用于檢測GPIb-凝血酶相互作用的調節(jié)因子的方法和用于進行該方法的測定試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于凝血診斷（coagulation diagnostics)的領域并且涉及用于檢測樣品 中的GPIb-凝血酶相互作用的調節(jié)因子的方法。
【背景技術】
[0002] 凝血酶（因子IIa)參與血漿血液凝固的多重性激活和抑制機制，并且因此是二 期止血（secondary hemostasis)(其主要包括血纖蛋白的形成）的核心酶。較差的研宄 和理解的是凝血酶在一期止血（primary hemostasis)(其包括作為內(nèi)皮損傷的結果的 血小板的激活和血小板的附著）中的作用。已知的是凝血酶是血小板激活因子并刺激 血小板的聚集。血小板表面上最重要的凝血酶受體是，第一，PAR受體（蛋白酶激活的受 體）和第二，糖蛋白Ib-V-IX受體復合物。糖蛋白Ib-V-IX受體復合物包含內(nèi)在膜蛋白 (integral membrane protein)糖蛋白Ib (GPIb)、內(nèi)在膜蛋白糖蛋白IX(GPIX)和糖蛋白 V(De Candia, E. , Mechanisms of platelet activation by thrombin:A short history. Thrombosis Research 2012,129 :250 - 256)〇
[0003] GPIb是由具有約145kDa的表觀分子質量的重鏈（同義詞：α鏈或者GPIb a ) 和具有約22kDa的表觀分子質量的輕鏈（同義詞：β鏈或者GPIb β)組成的雙鏈分子， 其通過二硫鍵連接至彼此（Lopez，J.A.et al. ,Cloning of the a chain of human platelet glycoprotein Ib :A transmembrane protein with homology to leucine-richa2_glyc〇Pr〇tein.Proc. Natl. Acad. Sci USA 1987,84:5615 - 5619)。
[0004] GPIba蛋白包含用于凝血酶的結合位點并且因此引起凝血酶結合至糖蛋白 Ib-V-IX受體復合物。GPIba鏈的片段是糖萼蛋白（glycocalicin)，其水解地切割自血 小板膜中的完整的受體蛋白。糖萼蛋白在血漿中是可檢測的。血漿中的游離糖萼蛋白的 升高的濃度表示血小板功能的破壞（Beer, J.H.et al.，Glycocalicin:A New Assay-The Normal Plasma Levels And Its Potential Usefulness in Selected Diseases. Blood 1994, 83(3) :691 - 702)。
[0005] 由于凝血酶和血小板在動脈血栓形成（thrombose)的發(fā)展中起著主要作用并且 由于用于預防性和治療性應用的血小板聚集的抑制因子正被同時研宄和使用，因此，凝血 酶和血小板的相互作用的具體研宄是有極大益處的。
[0006] 因此期望具有這樣的方法：其允許檢測患者樣品中血小板-凝血酶相互作用的調 節(jié)因子（調節(jié)子，調節(jié)劑，modulator)即，抑制因子（抑制子，抑制劑，inhibitor)或者激活 因子（激活子，活化劑，activator)。這樣的方法將允許監(jiān)測血小板抑制因子療法或者甚至 檢測生理學破壞性因子，如，激活性或者抑制性自身抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目標是提供用于專門檢測樣品中的GPIb-凝血酶相互作用的調節(jié)因子 的方法。
[0008] 通過以下實現(xiàn)該目標：使樣品與分離的GPIba蛋白并且與分離的凝血酶接觸并 且測定GPIba蛋白和凝血酶之間的復合物的形成，GPIba蛋白是突變的，與人類GPIba蛋 白的野生型序列相比，包含至少氨基酸殘基1 - 268并且具有在位置233、235、237和239中 的至少一個處的替換Xaa(SEQ ID NO: 1)。
[0009] 術語"GPIb -凝血酶相互作用的調節(jié)因子"包含影響GPIb -凝血酶相互作用的物 質。GPIb-凝血酶相互作用的抑制因子減少凝血酶與GPIba蛋白的結合。GPIb-凝血酶 相互作用的激活因子增強凝血酶與GPIb a蛋白的結合。
[0010] 如果樣品包含激活因子，那么與標準樣品相比，復合物的形成被增強。
[0011] 如果樣品包含抑制因子，例如
[0012] ?治療上給予的凝血酶抑制因子，例如來自外位點（exosite) I抑制因子（例如， 水輕素）或者外位點Π 抑制因子（例如，肝素）的組（Ruggeri，Z. M. et al.，Unravelling the mechanism and significance of thrombin binding to platelet glycoprotein lb. Thrombosis and Haemostasis 2010，104.5:894 _ 902)或者
[0013] ?生理性凝血酶抑制因子，如，例如，防止凝血酶與GPIbcx的結合的抗凝血酶自身 抗體，或者
[0014] ?治療給予的GPIb α抑制因子，如，例如，抗GPIb α抗體，例如抗體4H12 (US 5486361)或者抗體 SZ2(Ruan, C. et al. , A murine antiglycoprotein Ib complex monoclonal antibody,SZ2, inhibits platelet aggregation induced by both ristocetin and collagen. Blood 1987, 69 (2) :570 - 577)或者 H6B4-Fab，人源化單克隆 抗 GPIba 抗體的 Fab 片段（Firbas，C.et al·，Targeting von Willebrand factor and platelet glycoprotein Ib receptor.Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 2010, 8 (12):1689 - 1701)，或者GPG-290、重組的、包含結合至人類IgGl的GPIb α的氨基末端氨基酸I - 290的 嵌合抗體（Yeung, J. &Holinstat，M.，Newer agents in antiplatelet therapy:a review. Journal of Blood Medicine 2012, 3:33 - 42)，或者
[0015] ?生理性GPIb α抑制因子，如，例如，防止GPIb α與凝血酶的結合的抗GPIb α自 身抗體，或者
[0016] ?升高的糖萼蛋白濃度，其與GPIba蛋白競爭結合至凝血酶，
[0017] 那么，與標準樣品相比，復合物的形成減少。
[0018] 因此，本發(fā)明提供用于檢測樣品中GPIb -凝血酶相互作用的調節(jié)因子的方法，使 該樣品與分離的GPIb α蛋白并且與分離的凝血酶接觸，并且確定GPIb α蛋白與凝血酶之 間的復合物的形成。使用的GPIba蛋白是突變的，并且與人類GPIba蛋白的野生型序列 相比，包含至少氨基酸殘基1 - 268并且具有在位置233、235、237和239中的至少一個處的 替換 Xaa(SEQ ID N0:1)。
[0019] 有利的是所述方法處理而不需要使用血小板。從動物或者人類血液制備血小板試 劑代價高和不方便并且不能保證始終如一的質量。
[0020] 術語"樣品"包括生物液體、尤其來自人類和動物的生物液體，如血液、血漿或者血 清。
[0021] 術語"標準樣品"包括參考材料，當其在根據(jù)本發(fā)明的方法中用作樣品時，產(chǎn)生對 應于健康個體的或者健康個體的群體的GPIb-凝血酶相互作用的測定值，該個體或者群 體不具有受GPIb-凝血酶相互作用的調節(jié)因子影響的GPIb-凝血酶相互作用。合適的參 考材料是，例如，由體液組成的庫，例如來自一般至少20明顯健康個體的標準血漿庫或者 標準血清庫。
[0022] 在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的GPIba蛋白可以是重組地或者合成地生產(chǎn)的 GPIba蛋白。適于生產(chǎn)重組GPIba蛋白的是已知的原核的或者真核表達系統(tǒng)，如，例 如，在細菌（例如，大腸桿菌（E. coli))中、在酵母（例如，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德畢赤氏酵母（Pichia pastoris))中、在植物、動物或者人類細胞培養(yǎng) 物中表達的。適于生產(chǎn)合成的GPIba蛋白的是用于體外蛋白合成的已知的技術，如，固相 合成（例如，梅里菲爾德（Merrifield)合成法）。優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的 GPIba蛋白是重組生產(chǎn)的GPIba蛋白，其是在人類細胞的培養(yǎng)物中、優(yōu)選地在人類胚腎細 胞（HEK細胞）的培養(yǎng)物中生產(chǎn)的。
[0023] 優(yōu)選地，以這樣的量將GPIba蛋白添加到測定體積中使得獲得測定體積中的 0. 5 - 50 μ g/mL GPIb