專利名稱：大炎肽/炎癥因子1在制備診斷乳腺癌的標(biāo)識物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于癌診斷標(biāo)識物，具體涉及用多肽(大炎肽/炎癥因子1)Daintain/AIF1制備單克隆或多克隆抗體作為一種診斷乳腺癌的標(biāo)識物。
背景技術(shù)：
目前乳腺癌的診斷主要依靠病人的臨床反應(yīng)和腫瘤外觀特征，作出初步判斷。但是否為惡性腫瘤則必須從細(xì)胞學(xué)水平上加以區(qū)分，普遍采用目前世界公認(rèn)的伊紅/蘇木精(HE)病理切片診斷。但用HE染色只能針對晚期腫瘤，因此時腫瘤細(xì)胞以具備完整、明顯的癌細(xì)胞的形態(tài)特征，則疾病已到達(dá)難以治愈的程度。同時有些生理狀態(tài)正常的細(xì)胞也會出現(xiàn)形態(tài)異常的情況，醫(yī)生不能得到正確的判斷，甚至造成誤診。至今還沒有確切的特異性強(qiáng)的識別乳腺癌的標(biāo)識物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出大炎肽/炎癥因子1在制備診斷乳腺癌的標(biāo)識物中的應(yīng)用，目的在于為診斷乳腺癌提供確切的特異性強(qiáng)的標(biāo)識物。
本發(fā)明大炎肽/炎癥因子1在制備診斷乳腺癌的標(biāo)識物中的應(yīng)用，所述大炎肽/炎癥因子1的氨基酸順序為SQTRDLQGGKAFRLLKAQQEERLDEINKQFLDDPKYSSDEDLPSKLEGFKEKYMEFDLNGNGDIDIMSLKRMLEKLGVPKTHLELKKLIGEVSSGSGETFSYPDFLRMMLGKRSAILKMILMYEEKAREKEKPTGPPAKKAISELP，外觀為白色的粉末，易溶于水，分子量為17000道爾頓。
所述大炎肽/炎癥因子1在制備診斷乳腺癌的標(biāo)識物中的應(yīng)用，其特征在于以大炎肽/炎癥因子1為抗原，采用標(biāo)準(zhǔn)方法制備單克隆和多克隆抗體，用于乳腺癌診斷。
研究發(fā)現(xiàn)，大炎肽/炎癥因子1(daintain/AIF1)，這個起源于免疫細(xì)胞和參與細(xì)胞免疫應(yīng)答過程的生物活性肽，不在或極少量在正常乳腺中表達(dá)，但在乳腺癌細(xì)胞中明顯表達(dá)，而且其表達(dá)量與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展即惡化之間存在著緊密正相關(guān)性乳腺良性腫瘤，如脂肪瘤中檢測不出此肽的表達(dá)，在導(dǎo)管內(nèi)乳擴(kuò)張瘤、纖維腺瘤、導(dǎo)管上皮增生等良性腫瘤組織中則低度表達(dá)，免疫組化染色檢測為淡黃色。但在原位癌，如小葉原位癌、導(dǎo)管原位癌中則大量表達(dá)，免疫組化染色檢測為清晰的黃色。進(jìn)而在侵潤癌組織和癌轉(zhuǎn)移的淋巴組織中，免疫組化染色檢測為棕黃色。利用這種明顯的染色差異，對乳腺腫瘤及其病程進(jìn)行鑒別和診斷。上述結(jié)果，用反轉(zhuǎn)錄—多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和原位雜交檢測得到了驗證。利用目前世界公認(rèn)的HE病理切片染色法作對照證明，大炎肽及其抗體用于檢測乳腺腫瘤的效果不亞于HE法，并且在HE無法確認(rèn)的情況下，本發(fā)明的標(biāo)識物可以得到更精確的結(jié)果。


圖1為純化mAb的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析照片；圖2A為病例A的乳腺癌大炎肽免疫染色病理切片診斷圖譜；圖2B為病例A的乳腺癌HE染色病理切片診斷圖譜；圖2C為病例B的正常乳腺組織大炎肽免疫染色病理切片診斷圖譜；圖2D為病例C的導(dǎo)管浸潤癌大炎肽免疫染色病理切片診斷圖譜；圖3A為病例D的導(dǎo)管原位癌大炎肽免疫染色病理切片診斷圖譜；圖3B為病例E的導(dǎo)管原位癌大炎肽免疫染色病理切片診斷圖譜；圖3C為病例F的導(dǎo)管浸潤癌大炎肽免疫染色病理切片診斷圖譜；
圖3D為病例G的乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶大炎肽免疫染色病理切片診斷圖譜。
具體實施例方式
1.大炎肽的制備(1)從天然材料中純化大炎肽以豬小腸為原料(500千克)，沸水處理10分鐘，滅活內(nèi)源性蛋白酶。經(jīng)過0.2M稀乙酸低溫浸提10小時，海藻酸(5千克)吸附，以320g/L氯化鈉鹽析，過濾收集鹽析物，異丙醇分級提取、葡聚糖Sephadex G-25凝膠過濾和纖維素弱陰離子DEAE交換柱層析，最后以反相高效液相色譜方法分離純化出大炎肽。大炎肽外觀為白色的粉末，易溶于水，分子量為17000道爾頓。
(2)以基因工程辦法制備設(shè)計一對引物如下5’GCGAATTCTATGAGCCAAACCAGGGATT 3’5’GCCTGCATTTCCCATATCTGGGTATTAG 3’應(yīng)用PCR(鏈?zhǔn)骄酆厦笖U(kuò)增)技術(shù)，將大炎肽基因cDNA擴(kuò)增，經(jīng)酶切后與原核表達(dá)載體pKK223-3連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后篩選陽性表達(dá)株，將其表達(dá)產(chǎn)物按照上述從天然材料中提取的辦法進(jìn)行純化大炎肽。
2.大炎肽抗體制備(1)大炎肽多克隆抗體的制備將大炎肽連結(jié)在載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)上，該連結(jié)物作為免疫原，采用背部皮下多點注射方法免疫4只新西蘭大白兔，第一次用2mg/只劑量免疫，然后分別在第28、42、56天用1mg/只劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫。在第四次免疫后第9天從頸動脈采血，并分離血清，用鹽析法純化抗體。經(jīng)酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)方法檢測抗體效價。從四只免疫兔共獲得免疫血清約240ml，得到純化的抗體2.35克，2mg/ml抗體的效價為1∶4×106。
(2)大炎肽單克隆抗體的制備將大炎肽連結(jié)在載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)上作為免疫原，采用背部皮下多點注射方法免疫巴比氏BALB/C小鼠，第一次用50μg/只劑量免疫，分別在第28、42、用25μg/只的量進(jìn)行加強(qiáng)免疫，在第三次免疫后第9天用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)方法檢測血清中抗體效價，發(fā)現(xiàn)血清中抗體效價達(dá)到106，然后用25μg進(jìn)行腹腔注射加強(qiáng)免疫，72小時后處死鼠，取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)進(jìn)行陽性克隆細(xì)胞的篩選，用有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞克隆，經(jīng)3次克隆以后獲得5株能穩(wěn)定分泌抗大炎肽單克隆的細(xì)胞株，分別命名為H9，F(xiàn)6，E5，C7，A10。
將各克隆株細(xì)胞腹腔注射成年BALB/C小鼠，采集腹水，然后用辛酸—硫酸氨沉淀方法純化抗體。用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)檢測純化抗體的效價，又用專一酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)檢測試劑盒(Pierce公司)鑒定各株單抗的亞類與亞型。
用5株雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液上清，測定了mAb(單克隆抗體)的Ig亞類(型)、mAbs的效價和抗體親和力，5株mAb中，H9和E5為IgG1(κ)，其它3株均為IgG2b(κ)。培養(yǎng)液中5株mAb的效價其中H9和C7為1∶4×104，F(xiàn)6為1∶1×104，E5為1∶8×104，A10為1∶2×104。5株mAb腹水效價其中E5和A10為1∶8×106，H9和F6為1∶4×106，C7為1∶4×105。5株mAbH9、F6、E5、C7、A10的親和常數(shù)，依次為1.75×1011、3.64×109、3.25×1011、2.65×108、2.14×109。純化的5株mAb進(jìn)行還原SDS-PAGE后，出現(xiàn)2條明顯帶，其分子量分別為55000及23000，符合IgG重鏈和輕鏈的大小，見圖1。
3.免疫組織化學(xué)診斷乳腺癌從湖北腫瘤醫(yī)院得到67例乳腺病理標(biāo)本，其中確診為乳腺癌(含乳腺小葉癌和乳腺導(dǎo)管癌)30例，良性瘤37例(乳頭突出瘤、纖維瘤、組織增生各11例，脂肪瘤4例)。
表1各組乳腺腫瘤中大炎肽免疫染色(例數(shù))

在病理切片診斷圖譜中，棕黃色為強(qiáng)陽性(++)，黃色為陽性(+)，不著色或者淡黃色為陰性(-)，界于+，-之間不易主觀判斷的為(+/-)，腫瘤組織中既有黃色染色部分又有不著色或者淡黃色為(+/+-)。與良性腫瘤相比，惡性腫瘤的免疫著色率明顯偏高。
用大炎肽的多克隆抗體對病理切片進(jìn)行免疫染色后，93％的乳腺癌切片都呈陽性反應(yīng)，而正常乳腺組織的對照中不染色；大多數(shù)乳腺導(dǎo)管上皮增生組織、纖維腺瘤、導(dǎo)管內(nèi)乳突狀瘤和所有的脂肪瘤都沒有著色。
通過與HE病理切片染色法作對照證明，大炎肽及其抗體用于檢測乳腺腫瘤同樣具有和HE法檢測一致的結(jié)果，并且有病例實驗證明在HE染色后無法判定的情況下，大炎肽也能強(qiáng)陽性染色，如圖2A和圖2B所示。(片中相同視野的大炎肽免疫染色和HE染色效果。相比之下，大炎肽免疫染色不但能更明顯地反映癌組織的形態(tài)學(xué)特征，還能直接通過顏色識別組織癌變。)
權(quán)利要求
1.大炎肽/炎癥因子1在制備診斷乳腺癌的標(biāo)識物中的應(yīng)用，所述大炎肽/炎癥因子1的氨基酸順序為SQTRDLQGGKAFRLLKAQQEERLDEINKQFLDDPKYSSDEDLPSKLEGFKEKYMEFDLNGNGDIDIMSLKRMLEKLGVPKTHLELKKLIGE.VSSGSGETFSYPDFLRMMLGKRSAILKMILMYEEKAREKEKPTGPPAKKAISELP，外觀為白色的粉末，易溶于水，分子量為17000道爾頓。
2.如權(quán)利要求1所述的大炎肽/炎癥因子1在制備診斷乳腺癌的標(biāo)識物中的應(yīng)用，其特征在于以大炎肽/炎癥因子1為抗原，采用標(biāo)準(zhǔn)方法制備單克隆和多克隆抗體，用于乳腺癌診斷。
全文摘要
大炎肽/炎癥因子1在制備診斷乳腺癌的標(biāo)識物中的應(yīng)用，屬于癌診斷標(biāo)識物，目的在于為診斷乳腺癌提供確切的特異性強(qiáng)的標(biāo)識物。所述大炎肽/炎癥因子1的氨基酸順序為SQTRDLQGGKAFRLLKAQQEERLDE INKQFLDDPKYSSDEDLPSKLEGFKEKYMEFDLNGNGDIDIMSLKRMLEKLGVPKTHLELKKLIGEVSSGSGETFSYPDFLRMMLGKRSAILKMILMYEEKAREKEKPTGPPAKKAISELP，外觀為白色的粉末，易溶于水，分子量為17000道爾頓。以大炎肽/炎癥因子1為抗原，采用標(biāo)準(zhǔn)方法制備單克隆和多克隆抗體，用于乳腺癌診斷。檢測乳腺腫瘤的效果不亞于HE法，在HE無法確認(rèn)的情況下，本發(fā)明可得到更精確的結(jié)果。
文檔編號G01N33/577GK1782708SQ200510019458
公開日2006年6月7日 申請日期2005年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月20日
發(fā)明者陳正望, 李發(fā)芳, 趙燕英, 王建和, 陳磊 申請人:華中科技大學(xué)