專利名稱：抗炎癥因子制備及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抗炎癥因子的制備及應用，尤其涉及一種通過免疫接種乳牛產(chǎn)生高敏感免疫狀態(tài)并從其分泌的牛奶中制備抗炎癥因子的方法及應用。
發(fā)明技術背景炎癥是機體局部組織對傷害或損傷引發(fā)的保護性反應，其特征是局部組織出現(xiàn)典型的疼痛、發(fā)熱、潮紅、腫脹以及局部組織功能障礙，主要是由于局部血流增快、血管擴張，血管通透性增高，組織液滲透增加，白細胞聚集所引起，與局部炎癥因子如組織胺、五羥色胺分泌增加有關。炎癥本身是一種防御反應，可以促進創(chuàng)傷修復，但過于劇烈的炎癥反應卻可引起機體不舒適、疼痛、功能障礙，甚至會造成局部組織的病理損害，因此降低局部組織炎癥反應是臨床癥狀治療的重要課題，而用于減低局部炎癥因子的藥物稱之為抗炎癥藥物，常用于治療不同疾病所引起的炎癥反應。
抗炎癥藥物、鎮(zhèn)痛藥、退熱藥是由多類物質混雜的藥物，化學結構不一樣，作用及付反應也各不相同，腎上腺皮質激素類藥物，例如醋酸可的松是最廣泛應用的抗炎藥物，旦白分解酶代表另一類具有抗炎癥作用的藥物，水楊酸類藥物如阿司匹林也是常規(guī)應用的抗炎癥藥物之一。這些藥物雖然有效，但明顯的負作用影響了進一步的應用。眾所周知，長期服用腎上腺皮質激素類藥物會引起多種嚴重負作用，如向心性肥胖、多毛癥、免疫功能減退、血壓升高、水鈉潴留等，極易引發(fā)微生物繼發(fā)感染，并且感染不易控制。長期服用水楊酸類抗炎藥物同樣會引發(fā)各種并發(fā)癥，如胃腸道不適、胃潰瘍、胃炎，以及體內酸堿平衡失調、出血傾向等多種負作用。
因此，研制一種天然成份組成，有抑制炎癥反應作用，但是卻無毒付作用的抗炎制劑是十分必需的。
現(xiàn)代研究證實在高敏感免疫狀態(tài)的動物體內存在一種能有效抑制炎癥反應的抗炎癥因子，而通過免疫接種乳?？梢哉T發(fā)牛產(chǎn)生高敏感免疫狀態(tài)，高敏感免疫狀態(tài)乳牛血清中的抗炎癥因子會轉移至牛奶中。
美國專利(4324782)公布的技術中，介紹了一種方法，通過用變異鏈球菌滅活疫苗免疫接種乳牛，從其分泌的牛奶中制備出的抗體能抑制齲齒的形成。美國專利(4636384)公布的技術中，介紹了采用單獨或復合細菌疫苗接種乳?？梢哉T發(fā)高敏感免疫狀態(tài)，其分泌的牛奶中含有可改善心血管功能的有效成分。
本發(fā)明所要解決的技術問題是，從天然食品成分中制備一種能有效抑制炎癥反應，并長期服用無毒負作用的抗炎癥因子。

發(fā)明內容
本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案，其特征是，選擇合適的抗原或抗原組合，制備單價或多價復合抗原疫苗，免疫接種經(jīng)選擇的健康乳牛，監(jiān)測接種乳牛血清以確定其已進入高敏感免疫狀態(tài)，重復追加接種足夠劑量的疫苗以維持其高敏感免疫狀態(tài)，測試免疫牛奶中抗炎癥因子，從收集的牛奶中通過分離提純的程序制備高純度的抗炎癥因子。
本發(fā)明的技術特征是，單獨的抗原或者復合抗原都可以被用作制備接種乳牛的疫苗，抗原類型可以是細菌、病毒、孢子體、螺旋體等微生物或其他物質，只要該抗原可以引發(fā)接種的乳牛進入高敏感免疫狀態(tài)。最適宜的抗原類型是細菌，最好是采用多價抗原形式的滅活細菌疫苗。
本發(fā)明的技術特征是，選擇的免疫接種對象可以是乳?；蛉檠颍詈檬墙】等榕?，接種方式可以是皮下注射、皮內注射、靜脈注射、腹膜內注射、乳房內注射、口服、灌腸、肌肉注射等，只要該接種形式能使接種動物致敏，最好的接種方式是肌肉注射，如果肌肉注射不能引發(fā)高敏感免疫狀態(tài)，可以同時采用靜脈注射或乳房內注射聯(lián)合接種，以誘發(fā)接種動物進入高敏感免疫狀態(tài)。接種的劑量要足夠，劑量范圍從1，times，10，sup.6cells到1.times.10.sup.8cells。
本發(fā)明的技術特征是，制備相對高純度抗炎癥因子制劑的方法是，對收集的牛奶采用離心方式脫脂，用酸劑調整牛奶PH至4.5～4.9，最好4.7～4.8，加熱30℃～50℃，最好40℃，加熱時間20分鐘～40分鐘，最好30分鐘，再降溫至4℃靜置過夜，用濾布過濾器，最好是尼龍濾布過濾器濾除凝集的酪旦白后，直接噴霧干燥，或加堿劑，調整PH至6.8～7.0后噴霧干燥成干粉，或者在加熱后直接用離心機離心沉淀酪旦白，離心時間15分鐘～45分鐘，最好30分鐘，離心速度3000～6000轉/分，最好5000轉/分，離心沉淀去除酪旦白后，上清液直接噴霧干燥，或調整PH至6.8～7.0后噴霧干燥成粉，噴霧干燥時溫度不能超過140°F。
本發(fā)明的技術特征是，制備較高純度抗炎癥因子的方法是，收集的牛奶用離心方式脫脂，脫脂牛奶采用分子量為10,000的超微濾膜進行分離過濾，收集分子量＜10,000的上清液，直接噴霧干燥(溫度＜140°F)制備干粉，或者冷凍抽干制備干粉，也可以在脫脂程序后，以1∶3生理鹽水稀釋擴容后采用交錯切面流體超濾裝置，采用10,000分子量的超微濾膜分離過濾，收集上清液，用同樣設備但采用脫水濃縮程序后冷凍干燥制備干粉。
本發(fā)明的技術特征是，本發(fā)明方法制備的抗炎癥因子，既可以單獨應用，也可以與其他抗炎癥反應的有效成份聯(lián)合使用，以發(fā)揮更強大的協(xié)同作用，其施用方法可以是直接服用牛奶、奶粉或高純度抗炎癥因子制劑，也可以與其他藥用輔料制備成片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、沖劑、油劑、乳劑、含片等多種形式服用，還可以作為食品添加劑加工成食品食用。
本發(fā)明的技術特征是，本發(fā)明方法制備的抗炎癥因子制劑可以用來預防和治療任何疾病和創(chuàng)傷引起的炎癥反應，包括但不限于風濕性關節(jié)炎、牛皮癬性關節(jié)炎、強直性脊柱炎、急性或亞急性滑囊炎、非特異性腱鞘炎、風濕性心肌炎、天皰瘡、大泡性皮膚炎、嚴重紅斑、系統(tǒng)性皮肌炎、多發(fā)性脫落性皮炎、肝硬化、季節(jié)持續(xù)性皮炎、支氣管哮喘、接觸性皮炎、血清病、過敏性結腸炎、角膜炎、帶狀皰疹、虹膜炎、擴散性葡萄膜炎、視神經(jīng)炎、系統(tǒng)性肉瘤病、溶血性貧血等，本發(fā)明方法制備的抗炎癥因子制劑也可以用于減輕某些疾病的癥狀，包括但不限于白血病、淋巴瘤、結核病和腦膜炎等。
本發(fā)明的技術特征是，應該監(jiān)測接種乳牛是否對抗原敏感，以及是否已進入高敏感免疫狀態(tài)。有很多已知的方法可以檢測這種敏感性，其中包括皮膚敏感性試驗、測定血清中特異性抗體滴度，最好的方法是分別測試乳牛接種前后血清對多價抗原復合疫苗產(chǎn)生的抗體凝集反應，如果在接種后出現(xiàn)特異性抗體凝集反應，則證實已經(jīng)進入高敏感免疫狀態(tài)。
本發(fā)明的技術特征是，乳牛在首次免疫接種誘發(fā)高敏感免疫狀態(tài)后，應該重復追加接種注射，以維持這種已誘發(fā)的高敏感免疫狀態(tài)，重復注射應維持足夠的劑量，至少應等于首次接種劑量，必要時可加大劑量，但不超過初始劑量的150％，重復接種的時間和次數(shù)取決于抗原的選擇及組合，通常是每兩周重復注射一次，一般可重復注射4～6次，但在這期間至少每兩周監(jiān)測一次血清抗體凝集反應，如果接種乳牛出現(xiàn)免疫耐受現(xiàn)象，則應停止使用該乳牛的牛奶作為原料制備抗炎癥因子。
本發(fā)明的技術特征是，在從牛奶中制備抗炎癥因子前，應測試牛奶中抗炎癥因子的特性，可以采用“鼠掌角叉菜膠誘發(fā)水腫試驗”[Winter C.A.et al“Carrageenin InducedOedema in Hind Paw of the Rat as an Assay for Ant i-Inflammatory Drugs”Proc.Soc.Exp.Biol.Med.111544-547，(1962)]，這種方法是最簡單和最直接的測試方法，是用于測試抗炎藥物的標準方法，已經(jīng)被公認對抗炎癥藥物有高度敏感性，這個方法是在白鼠前腳掌注射少量角叉菜膠以誘發(fā)炎癥反應，數(shù)小時后鼠掌會腫脹，可以通過重量或容積測試方法檢測鼠掌的腫脹程度，抗炎癥藥物能有效阻止其炎癥反應。
本發(fā)明的技術特征是，收集致敏乳牛分泌的牛奶制備抗炎癥因子，視所需要的純度可以采用多種制備方式，牛奶脫脂后可以制備含抗炎癥因子的牛奶或直接制備奶粉，在此處理過程中，應注意抗炎癥因子的熱敏感特性，任何處理工藝中溫度均不能超過140°F，采用巴氏消毒法時，溫度也不應超過140°F。直接噴霧干燥可制備富含抗炎癥因子的奶粉，噴霧干燥過程中的溫度也不應超過140°F。制備的奶粉可以直接服用，也可以添加到其他食品中聯(lián)合應用。應用于抗炎癥反應的用途時，服用劑量可以從100ml～10L/天，最好在0.5L/天。
本發(fā)明的有益效果是，采用天然成份作為抗炎癥因子不僅可以有效抑制炎癥，還能避免其他抗炎癥藥物的毒負作用，與現(xiàn)有技術相比，更適合慢性炎癥患者長期服用。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明實施例1免疫接種及抗體滴度檢測選用大腸桿菌(Escherichia Coli，American Type Culture StrainNo.13076)，用標準細菌培養(yǎng)基在37℃溫度下培養(yǎng)48小時，60℃持續(xù)2小時滅活細菌，離心收集細菌，用雙蒸餾水沖洗五次，用生理鹽水稀釋成最終濃度為4.times.10.sup.8cells，選擇健康乳牛，在臀部肌肉注射5ml，然后每周注射一次，連續(xù)注射四周，共注射5次，在第五周未，收集接種乳牛的牛奶，采用抗體凝集反應測定抗大腸桿菌抗體，以未免疫注射前的乳牛的牛奶作為對照，表1為檢測結果。
表1免疫接種前后牛奶抗大腸桿菌滴度對比免疫接種前 免疫接種后05,000表1結果顯示，在免疫接種后抗大腸桿菌抗體滴度顯著升高，證明免疫接種誘發(fā)了高免疫敏感狀態(tài)。
實施例2制備復合細菌疫苗從美國菌種培養(yǎng)中心(American Type Culture Collection)獲得下列菌種金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus，ATCC#.11631)、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis.155)、釀膿葡萄球菌1型(streptococcus pyogenes.Typel.8671)、3型(Type3.10389)、5型(type5.12347)、8型(Type8.12349)、12型(type12.11434)、14型(type14.12972)、18型(type18.12357)、22型(type22.10403)、產(chǎn)氣桿菌(Aerobacteraerogenes.884)、大腸桿菌(Escherichia Coli.11126)、腸炎(沙門)桿菌(Salmonellaenteritidis 13076)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa 7700)、肺炎桿菌(KlebsiellaPneumoniae.9590)、鼠傷寒(沙門)桿菌(Salmonella typhimurium.13311)、出血桿菌(Haemophilus typhimurium.9333)、普通變形桿菌(Proteus vulgaris 13315)、志賀痢疾桿菌(Shigella dysenteriae.13313)、肺炎雙球菌(Diplococcus pneumoniae.6303)、變異鏈球菌(Strep.sanguinis10556)、小鏈球菌(Strep.Mitis.6249)、出血鏈球菌(Strep.Sanguinis.10556)、唾液鏈球菌(Strep.Salivarius.13419)、缺乳鏈球菌(Strep.Agalactiae.13813)。每種細菌接種按照規(guī)定，采用合適的培養(yǎng)液，在37℃恒溫下培養(yǎng)48小時，觀察培養(yǎng)是否正常，如果細菌在培養(yǎng)基中生長良好，用離心機分離培養(yǎng)液，細菌用無菌生理鹽水沖洗五次，用60℃溫度滅活2小時，殺死所有細菌，從已滅活的細菌中采集樣本繼續(xù)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37℃下培養(yǎng)2小時)，確認無細菌存活，收集的細菌冷凍干燥成為細菌粉，上述每種粉稱取1g，用500ml生理鹽水混懸，并反復稀釋，直至配制成濃度為2.times.10.sup.8bacterial cells/ml的溶液，(在660nm上顯示1.0光密度單位)。
實施例3用復合疫苗免疫接種乳牛選擇健康乳牛，用實施例1配制的復合細菌疫苗免疫接種乳牛，采用肌肉注射方式，在臀部肌肉注射5ml疫苗，每隔二周相同劑量追加注射一次，共重復追加五次，在第一次注射后5天，采集接種乳牛的牛奶，采用放射免疫法測定復合抗原的抗體滴度，并與未免疫接種前采集的牛奶進行對比，發(fā)現(xiàn)免疫接種后復合抗原的抗體滴度增加百倍，證明接種乳牛處于高敏感免疫狀態(tài)。
實施例4制備抗炎癥因子制劑收集20公升免疫接種乳牛的牛奶，用脂肪分離機去脂，脫脂奶用中空纖維分離器(分子量為10,000)分離過濾牛奶，流速在自動計量器上的讀數(shù)為80，入口壓力為30psi，出口壓力為25psi，收集分離過濾液，直接送入冷凍干燥裝置，制備為干粉。
實施例5測試抗炎癥作用取實施例4制備的抗炎癥因子制劑20mg溶解于生理鹽水中，注射于已采用角叉菜膠注射液引發(fā)腫脹等炎癥反應的小鼠前掌，每只前掌注射1％角叉菜膠溶液0.1ml，在注射抗炎癥因子后兩個小時測量前掌厚度，并與注射前相比較，結果顯示抗炎癥因子有明確的消除炎癥作用。
權利要求
1.本發(fā)明涉及一種抗炎癥因子的制備及應用，尤其涉及一種通過免疫接種乳牛產(chǎn)生高敏感免疫狀態(tài)并從其分泌的牛奶中制備抗炎癥因子的方法及應用，其特征是，選擇合適的抗原或抗原組合，制備單價或多價復合抗原疫苗，免疫接種經(jīng)選擇的健康乳牛，監(jiān)測接種乳牛血清以確定其已進入高敏感免疫狀態(tài)，重復追加接種足夠劑量的疫苗以維持其高敏感免疫狀態(tài)，測試免疫牛奶中抗炎癥因子，從收集的牛奶中通過分離提純的程序制備高純度的抗炎癥因子。
2.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，單獨的抗原或者復合抗原都可以被用作制備接種乳牛的疫苗，抗原類型可以是細菌、病毒、孢子體、螺旋體等微生物或其他物質，只要該抗原可以引發(fā)接種的乳牛進入高敏感免疫狀態(tài)，最適宜的抗原類型是細菌，最好是采用多價抗原形式的滅活細菌疫苗。
3.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，選擇的免疫接種對象可以是乳?；蛉檠颍詈檬墙】等榕?，接種方式可以是皮下注射、皮內注射、靜脈注射、腹膜內注射、乳房內注射、口服、灌腸、肌肉注射等，只要該接種形式能使接種動物致敏，最好的接種方式是肌肉注射，如果肌肉注射不能引發(fā)高敏感免疫狀態(tài)，可以同時采用靜脈注射或乳房內注射聯(lián)合接種，以誘發(fā)接種動物進入高敏感免疫狀態(tài)，接種的劑量要足夠，劑量范圍從1，times，10，sup.6 cells到1.times.10.sup.8cells。
4.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，應該監(jiān)測接種乳牛是否對抗原敏感，以及是否已進入高敏感免疫狀態(tài)，有很多已知的方法可以檢測這種敏感性，其中包括皮膚敏感性試驗、測定血清中特異性抗體滴度，最好的方法是分別測試乳牛接種前后血清對多價抗原復合疫苗產(chǎn)生的抗體凝集反應，如果在接種后出現(xiàn)特異性抗體凝集反應，則證實已經(jīng)進入高敏感免疫狀態(tài)。
5.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，乳牛在首次免疫接種誘發(fā)高敏感免疫狀態(tài)后，應該重復追加接種注射，以維持這種已誘發(fā)的高敏感免疫狀態(tài)，重復注射應維持足夠的劑量，至少應等于首次接種劑量，必要時可加大劑量，但不超過初始劑量的50％，重復接種的時間和次數(shù)取決于抗原的選擇及組合，通常是每兩周重復注射一次，一般可重復注射4～6次，但在這期間至少每兩周監(jiān)測一次血清抗體凝集反應，如果接種乳牛出現(xiàn)免疫耐受現(xiàn)象，則應停止使用該乳牛的牛奶作為原料制備抗炎癥因子。
6.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，收集致敏乳牛分泌的牛奶制備抗炎癥因子，視所需要的純度可以采用多種制備方式，牛奶脫脂后可以制備含抗炎癥因子的牛奶或直接制備奶粉，在此處理過程中，應注意抗炎癥因子的熱敏感特性，任何處理工藝中溫度均不能超過140°F，采用巴氏消毒法時，溫度也不應超過140°F，直接噴霧干燥可制備富含抗炎癥因子的奶粉，噴霧干燥過程中的溫度也不應超過140°F，制備的奶粉可以直接服用，也可以添加到其他食品中聯(lián)合應用，應用于抗炎癥反應的用途時，服用劑量可以從100ml～10L/天，最好在0.5L/天。
7.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，制備相對高純度抗炎癥因子制劑的方法是，對收集的牛奶采用離心方式脫脂，用酸劑調整牛奶PH至4.5～4.9，最好4.7～4.8，加熱30℃～50℃，最好40℃，加熱時間20分鐘～40分鐘，最好30分鐘，再降溫至4℃靜置過夜，用濾布過濾器，最好是尼龍濾布過濾器濾除凝集的酪旦白后，直接噴霧干燥，或加堿劑，調整PH至6.8～7.0后噴霧干燥成干粉，或者在加熱后直接用離心機離心沉淀酪旦白，離心時間15分鐘～45分鐘，最好30分鐘，離心速度3000～6000轉/分，最好5000轉/分，離心沉淀去除酪旦白后，上清液直接噴霧干燥，或調整PH至6.8～7.0后噴霧干燥成粉，噴霧干燥時溫度不能超過140°F。
8.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，制備較高純度抗炎癥因子的方法是，收集的牛奶用離心方式脫脂，脫脂牛奶采用分子量為10,000的超微濾膜進行分離過濾，收集分子量＜10,000的上清液，直接噴霧干燥(溫度＜140°F)制備干粉，或者冷凍抽干制備干粉，也可以在脫脂程序后，以1∶3生理鹽水稀釋擴容后采用交錯切面流體超濾裝置，采用10,000分子量的超微濾膜分離過濾，收集上清液，用同樣設備但采用脫水濃縮程序后冷凍干燥制備干粉。
9.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，本發(fā)明方法制備的抗炎癥因子，既可以單獨應用，也可以與其他抗炎癥反應的有效成份聯(lián)合使用，以發(fā)揮更強大的協(xié)同作用，其施用方法可以是直接服用牛奶、奶粉或高純度抗炎癥因子制劑，也可以與其他藥用輔料制備成片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、沖劑、油劑、乳劑、含片等多種形式服用，還可以作為食品添加劑加工成食品食用。
10.按照權利要求1所述的方法，本發(fā)明的技術特征是，本發(fā)明方法制備的抗炎癥因子制劑可以用來預防和治療任何疾病和創(chuàng)傷引起的炎癥反應，包括但不限于風濕性關節(jié)炎、牛皮癬性關節(jié)炎、強直性脊柱炎、急性或亞急性滑囊炎、非特異性腱鞘炎、風濕性心肌炎、天皰瘡、大泡性皮膚炎、嚴重紅斑、系統(tǒng)性皮肌炎、多發(fā)性脫落性皮炎、肝硬化、季節(jié)持續(xù)性皮炎、支氣管哮喘、接觸性皮炎、血清病、過敏性結腸炎、角膜炎、帶狀皰疹、虹膜炎、擴散性葡萄膜炎、視神經(jīng)炎、系統(tǒng)性肉瘤病、溶血性貧血等，本發(fā)明方法制備的抗炎癥因子制劑也可以用于減輕某些疾病的癥狀，包括但不限于白血病、淋巴瘤、結核病和腦膜炎等。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗炎癥因子的制備及應用，尤其涉及一種通過免疫接種乳牛產(chǎn)生高敏感免疫狀態(tài)并從其分泌的牛奶中制備抗炎癥因子的方法及應用，其特征是，選擇合適的抗原或抗原組合，制備單價或多價復合抗原疫苗，免疫接種經(jīng)選擇的健康乳牛，監(jiān)測接種乳牛血清以確定其已進入高敏感免疫狀態(tài)，重復追加接種足夠劑量的疫苗以維持其高敏感免疫狀態(tài)，測試免疫牛奶中抗炎癥因子，從收集的牛奶中通過分離提純的程序制備高純度的抗炎癥因子。
文檔編號A61P29/00GK1557468SQ20041001584
公開日2004年12月29日 申請日期2004年1月15日 優(yōu)先權日2004年1月15日
發(fā)明者高春平 申請人:高春平