專利名稱：哺乳動(dòng)物細(xì)胞因子∶白介素－b30和相關(guān)試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)細(xì)胞)生物學(xué)和生理學(xué)中起作用的蛋白質(zhì)相關(guān)的組合物。具體地說，提供純化的基因、蛋白質(zhì)、抗體和相關(guān)的有用試劑，例如用以調(diào)節(jié)各種細(xì)胞類型(包括造血細(xì)胞)的活化、發(fā)育、分化和功能。
背景技術(shù)：
重組DNA技術(shù)一般是指這些技術(shù)，所述技術(shù)通過將來自供體源的遺傳信息整合到載體中用于后續(xù)加工，諸如通過引入到宿主中，由此使所轉(zhuǎn)移的遺傳信息在該新環(huán)境中復(fù)制和/或表達(dá)。通常，該遺傳信息以互補(bǔ)DNA(cDNA)的形式存在，所述互補(bǔ)DNA衍生自編碼所需蛋白產(chǎn)物的信使RNA(mRNA)。該載體通常是一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒具有將用于隨后復(fù)制的cDNA加入宿主中的能力，在某些情況下，實(shí)際控制該cDNA的表達(dá)，并由此指導(dǎo)所編碼的產(chǎn)物在該宿主中合成。
一段時(shí)間以來，已經(jīng)知道哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答基于稱為“免疫網(wǎng)絡(luò)”的一系列復(fù)雜的細(xì)胞相互作用。最近的研究已經(jīng)提供了對(duì)該網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部運(yùn)作的新的了解。盡管已經(jīng)清楚許多免疫應(yīng)答實(shí)際上確實(shí)圍繞淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和其它細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)樣相互作用運(yùn)轉(zhuǎn)，但免疫學(xué)家現(xiàn)在一般堅(jiān)持這樣一種觀點(diǎn)稱為淋巴因子、細(xì)胞因子或單核因子的可溶性蛋白，在控制這些細(xì)胞相互作用中起關(guān)鍵作用。因此，人們對(duì)細(xì)胞調(diào)節(jié)因子的分離、特征鑒定和作用機(jī)制相當(dāng)感興趣，對(duì)這些信息的了解將導(dǎo)致在許多醫(yī)學(xué)異常(例如免疫系統(tǒng)失調(diào))的診斷和治療方面取得相當(dāng)大的進(jìn)展。這些因子中的某些因子是造血生長(zhǎng)因子，例如粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)。參見例如Thomson(1994編輯)TheCvtokine Handbook(第2版)Academic Press，San Diego；Metcalf和Nicola(1995)The Hematopoietic Colony Stimulating Factors CambridgeUniversity Press；和Aggarwal和Gutterman(1991)Human CytokinesBlackwell Pub。
淋巴因子顯然以多種方式介導(dǎo)細(xì)胞活性。已經(jīng)表明，它們支持多能造血干細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)并分化為大量的祖細(xì)胞(progenitor)，所述祖細(xì)胞包括構(gòu)成復(fù)雜的免疫系統(tǒng)的多樣化的細(xì)胞譜系。細(xì)胞組分之間適當(dāng)和平衡的相互作用是健康的免疫應(yīng)答所必需的。當(dāng)結(jié)合其它因子給予淋巴因子時(shí)，不同的細(xì)胞譜系常常以不同方式應(yīng)答。
對(duì)免疫應(yīng)答尤其重要的細(xì)胞譜系包括兩類淋巴細(xì)胞B細(xì)胞，它們可以產(chǎn)生和分泌免疫球蛋白(具有識(shí)別并結(jié)合外源物質(zhì)以實(shí)現(xiàn)將其去除的能力的蛋白)；和各種亞群的T細(xì)胞，它們分泌淋巴因子，并誘導(dǎo)或抑制B細(xì)胞和構(gòu)成免疫網(wǎng)絡(luò)的各種其它細(xì)胞(包括其它T細(xì)胞)。這些淋巴細(xì)胞與許多其它細(xì)胞類型相互作用。
另一種重要的細(xì)胞譜系是肥大細(xì)胞(在所有哺乳動(dòng)物物種中尚未被明確鑒定)，這是一種含顆粒的結(jié)締組織細(xì)胞，鄰近遍布機(jī)體的毛細(xì)血管定位。發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞在肺、皮膚以及胃腸道和生殖泌尿道中的濃度尤其高。肥大細(xì)胞如下在變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的病癥(特別是過敏反應(yīng))中起中心作用當(dāng)選定的抗原與結(jié)合于肥大細(xì)胞表面上受體的一類免疫球蛋白交聯(lián)時(shí)，該肥大細(xì)胞脫顆粒并釋放引起變態(tài)反應(yīng)(例如過敏反應(yīng))的介質(zhì)，例如組胺、5-羥色胺、肝素和前列腺素。
一般不能在體外維持免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，這已經(jīng)阻礙了為更好地了解和治療各種免疫失調(diào)而進(jìn)行的研究。免疫學(xué)家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過使用T細(xì)胞和其它細(xì)胞的上清液，可以完成對(duì)這些細(xì)胞的培養(yǎng)，所述上清液含有各種生長(zhǎng)因子，包括許多淋巴因子。
根據(jù)以上所述，可明顯看出，新的淋巴因子(例如與G-CSF和/或IL-6相關(guān)的淋巴因子)的發(fā)現(xiàn)和研制，應(yīng)該有助于用于范圍廣泛的直接或間接涉及免疫系統(tǒng)和/或造血細(xì)胞的退行性病癥或異常病癥的新療法。特別是，對(duì)于增加或增強(qiáng)已知淋巴因子有益活性的淋巴因子的發(fā)現(xiàn)和研制應(yīng)該是非常有利。本發(fā)明提供新的白介素組合物和相關(guān)的化合物以及它們的使用方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物、犬科動(dòng)物、貓科動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物)的白介素-B30(IL-B30)及其生物活性。它包括編碼多肽本身的核酸和它們的生產(chǎn)和使用方法。根據(jù)與本文包含的所克隆的互補(bǔ)DNA(cDNA)序列的同源性和/或應(yīng)用于通常由這些核酸編碼的多肽例如G-CSF(參見Nagata(1994)載于Thomson The Cvtokine Handbook第2版，Academic Press，San Diego)和/或IL-6(參見Hirano(1994)載于ThomsonThe Cvtokine Handbook第2版，Academic Press，San Diego)的生長(zhǎng)因子樣活性或細(xì)胞因子樣活性的功能測(cè)定，部分特征鑒定出本發(fā)明的核酸。提供調(diào)節(jié)或干擾依賴于生長(zhǎng)因子的生理學(xué)或免疫應(yīng)答的控制的方法。
本發(fā)明部分基于一種新細(xì)胞因子序列的發(fā)現(xiàn)，所述新細(xì)胞因子序列表現(xiàn)出與G-CSF和IL-6顯著的序列和結(jié)構(gòu)相似性。具體地說，它提供靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如人類)其編碼的蛋白質(zhì)成熟大小約168個(gè)氨基酸的基因以及豬和鼠類(例如小鼠)的序列。表現(xiàn)出顯著序列同源性的功能相當(dāng)物可得自其它哺乳動(dòng)物，例如乳牛、馬和大鼠以及非哺乳動(dòng)物物種。
在各種蛋白質(zhì)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供大致純的或重組的IL-B30蛋白或肽，它在至少約12個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度內(nèi)，表現(xiàn)出與SEQ ID NO2的序列同一性至少約85％；SEQ ID NO2的天然序列IL-B30；和包含IL-B30序列的融合蛋白。在某些實(shí)施方案中，所述同源性為至少約90％的同一性，而所述部分至少約9個(gè)氨基酸；所述同源性為至少約80％的同一性，而所述部分至少約17個(gè)氨基酸；或所述同源性為至少約70％的同一性，而所述部分至少約25個(gè)氨基酸。在其它實(shí)施方案中，所述IL-B30包含表1的成熟序列；或表現(xiàn)出與天然IL-B30不同的翻譯后修飾模式；或所述蛋白或肽來自選自哺乳動(dòng)物(包括靈長(zhǎng)類動(dòng)物)的溫血?jiǎng)游锇琒EQ ID NO2的至少一個(gè)多肽區(qū)段；表現(xiàn)出多個(gè)部分表現(xiàn)出同一性；為IL-B30的天然等位基因變異體；其長(zhǎng)度至少約30個(gè)氨基酸；表現(xiàn)出至少兩個(gè)非重疊表位為哺乳動(dòng)物IL-B30特異性的；在至少約20個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度內(nèi)，表現(xiàn)出與哺乳動(dòng)物IL-B30的序列同一性至少約90％；為糖基化的；其天然糖基化的分子量至少約10kD；為合成多肽；連接至固體基質(zhì)上；綴合于另一化學(xué)部分；為對(duì)天然序列進(jìn)行5重或5重以下的置換；或?yàn)樘烊恍蛄械娜笔Щ虿迦胱儺愺w。優(yōu)選實(shí)施方案包括的組合物包含無菌IL-B30蛋白或肽；或所述IL-B30蛋白或肽和一種載體，其中所述載體為水性化合物，包括水、鹽水和/或緩沖液；和/或配制用于經(jīng)口、直腸、鼻、局部或胃腸外給藥。在融合蛋白實(shí)施方案中，所述蛋白可以具有表1的成熟蛋白序列；一種檢測(cè)或純化標(biāo)記，包括FLAG、His6或Ig序列；和/或另一細(xì)胞因子或趨化因子的序列。
試劑盒實(shí)施方案包括的試劑盒具有IL-B30蛋白或多肽，和包含所述蛋白或多肽的區(qū)室；和/或使用或處理該試劑盒中試劑的說明。
在結(jié)合化合物實(shí)施方案中，所述化合物可以具有來自特異性地結(jié)合于天然IL-B30蛋白的抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其中所述IL-B30為哺乳動(dòng)物蛋白；所述結(jié)合化合物為Fv、Fab或Fab2片段；所述結(jié)合化合物與另一化學(xué)部分綴合；或所述抗體針對(duì)表1成熟多肽的肽序列而產(chǎn)生；針對(duì)成熟的IL-B30而產(chǎn)生；針對(duì)純化的嚙齒動(dòng)物IL-B30而產(chǎn)生；為免疫選擇性的；為多克隆抗體；結(jié)合于變性的IL-B30；表現(xiàn)出的Kd至少為30μM；連接至固體基質(zhì)，包括珠?；蛩芰夏ぃ辉跓o菌組合物中；或進(jìn)行了可檢測(cè)標(biāo)記，包括放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記。含結(jié)合化合物的試劑盒包括具有以下物質(zhì)的試劑盒包含所述結(jié)合化合物的區(qū)室；和/或使用或處理該試劑盒中試劑的說明。該試劑盒通常能夠進(jìn)行定性或定量分析。優(yōu)選的組合物包含無菌結(jié)合化合物；或所述結(jié)合化合物和一種載體，其中所述載體為水性化合物，包括水、鹽水和/或緩沖液；和/或配制用于經(jīng)口、直腸、鼻、局部或胃腸外給藥。
核酸的實(shí)施方案包括分離的或重組的核酸，它編碼IL-B30蛋白或肽或融合蛋白，其中所述IL-B30來自哺乳動(dòng)物；和/或所述核酸編碼表1的抗原肽序列；編碼多個(gè)表1的抗原肽序列；表現(xiàn)出與編碼所述區(qū)段的天然cDNA的同一性至少約80％；為一種表達(dá)載體；還包含一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)；來自天然來源；包含一種可檢測(cè)標(biāo)記；包含合成的核苷酸序列；小于6kb，最好小于3kb；來自哺乳動(dòng)物，包括靈長(zhǎng)類；包含一種天然的全長(zhǎng)編碼序列；為編碼所述IL-B30的基因的雜交探針；或?yàn)橐环NPCR引物、PCR產(chǎn)物或誘變引物。本發(fā)明也提供包含這樣一種重組核酸的細(xì)胞、組織或器官，而所述細(xì)胞最好是原核細(xì)胞；真核細(xì)胞；細(xì)菌細(xì)胞；酵母細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞；哺乳動(dòng)物細(xì)胞；小鼠細(xì)胞；靈長(zhǎng)類細(xì)胞；或人細(xì)胞。
試劑盒實(shí)施方案包括的試劑盒具有這類核酸，和包含所述核酸的區(qū)室；還包含所述IL-B30蛋白或多肽的區(qū)室；和/或使用或處理該試劑盒中試劑的說明。通常，該試劑盒能夠進(jìn)行定性或定量分析。
在某些實(shí)施方案中，所述核酸在30℃和低于2M鹽、或45℃和/或500mM鹽、或55℃和/或150mM鹽的洗滌條件下，與SEQ IDNO1雜交；或表現(xiàn)與靈長(zhǎng)類IL-B30的的同一性至少約85％和/或所述一段序列至少約30個(gè)核苷酸，或表現(xiàn)至少約90％的同一性和/或所述一段序列至少約55個(gè)核苷酸，或表現(xiàn)至少約95％的同一性和/或所述一段序列至少約75個(gè)核苷酸。
本發(fā)明包括調(diào)節(jié)細(xì)胞或組織培養(yǎng)細(xì)胞生理學(xué)或發(fā)育的方法，該方法包括使所述細(xì)胞與哺乳動(dòng)物IL-B30的激動(dòng)劑或拮抗劑接觸。所述方法為其中所述接觸為聯(lián)合G-CSG和/或IL-6的激動(dòng)劑或拮抗劑的接觸；或所述接觸為與拮抗劑的接觸，所述拮抗劑包括結(jié)合組合物，所述組合物包含特異性結(jié)合IL-B30的抗體結(jié)合位點(diǎn)。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本文引用的所有參考文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中，其程度與具體和單獨(dú)地表明每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)通過引用結(jié)合到本文中的程度一樣。I.一般描述本發(fā)明提供編碼為細(xì)胞因子的各種哺乳動(dòng)物蛋白的氨基酸序列和DNA序列，所述細(xì)胞因子例如為分泌分子，可以介導(dǎo)免疫細(xì)胞或其它細(xì)胞之間的信號(hào)。參見例如Paul(1994)Fundamental Immunology(第3版)Raven Press，N.Y.。所述全長(zhǎng)細(xì)胞因子和片段或拮抗劑可用于表達(dá)受體的細(xì)胞的生理學(xué)調(diào)節(jié)。對(duì)造血細(xì)胞，包括例如淋巴細(xì)胞，諸如T細(xì)胞、B細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、造血祖細(xì)胞等，IL-B30可能具有或者刺激效應(yīng)或者抑制效應(yīng)。所述蛋白也可用作抗原，例如免疫原，用于針對(duì)該蛋白上各種表位(線狀表位和構(gòu)象表位)產(chǎn)生抗體。
從人細(xì)胞系中鑒定出編碼IL-B30的cDNA。該分子命名為huIL-B30。也鑒定出相應(yīng)于豬序列的相關(guān)基因。也描述了來自小鼠的嚙齒動(dòng)物序列。
所述人基因編碼約168個(gè)氨基酸的小的可溶性細(xì)胞因子樣蛋白。所述信號(hào)序列可能為約21個(gè)殘基，可能從Met至約Ala。參見表1和SEQ ID NO1和2。IL-B30表現(xiàn)出長(zhǎng)鏈細(xì)胞因子成員特征性的結(jié)構(gòu)基元。比較例如可得自GenBank的IL-B30、G-CSF和IL-6的序列。也參見表2。表1編碼靈長(zhǎng)類(例如人)IL-B30的核酸(SEQ ID NO1)。翻譯的氨基酸序列為SEQ ID NO2。ATG CTG GGG AGC AGA GCT GTA ATG CTG CTG TTG CTG CTG CCC TGG ACA48Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr-21 -20 -15 -10GCT CAG GGC AGA GCT GTG CCT GGG GGC AGC AGC CCT GCC TGG ACT CAG96Ala Gln Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln-5 1 5 10TGC CAG CAG CTT TCA CAG AAG CTC TGC ACA CTG GCC TGG AGT GCA CAT144Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His15 20 25CCA CTA GTG GGA CAC ATG GAT CTA AGA GAA GAG GGA GAT GAA GAG ACT192Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr30 35 40ACA AAT GAT GTT CCC CAT ATC CAG TGT GGA GAT GGC TGT GAC CCC CAA240Thr Asn Asp Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln45 50 55GGA CTC AGG GAC AAC AGT CAG TTC TGC TTG CAA AGG ATC CAC CAG GGT288Gly Leu Arg Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly60 65 70 75CTG ATT TTT TAT GAG AAG CTG CTA GGA TCG GAT ATT TTC ACA GGG GAG336Leu Ile Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu80 85 90CCT TCT CTG CTC CCT GAT AGC CCT GTG GCG CAG CTT CAT GCC TCC CTA384Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala Gln Leu His Ala Ser Leu95 100 105CTG GGC CTC AGC CAA CTC CTG CAG CCT GAG GGT CAC CAC TGG GAG ACT432Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr110 115 120CAG CAG ATT CCA AGC CTC AGT CCC AGC CAG CCA TGG CAG CGT CTC CTT480Gln Gln Ile Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu125 130 135CTC CGC TTC AAA ATC CTT CGC AGC CTC CAG GCC TTT GTG GCT GTA GCC528Leu Arg Phe Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala140 145 150 155GCC CGG GTC TTT GCC CAT GGA GCA GCA ACC CTG AGT CCC TAA570Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro160 165編碼序列ATGCTGGGGA GCAGAGCTGT AATGCTGCTG TTGCTGCTGC CCTGGACAGCTCAGGGCAGA GCTGTGCCTG GGGGCAGCAG CCCTGCCTGG ACTCAGTGCCAGCAGCTTTC ACAGAAGCTC TGCACACTGG CCTGGAGTGC ACATCCACTAGTGGGACACA TGGATCTAAG AGAAGAGGGA GATGAAGAGA CTACAAATGATGTTCCCCAT ATCCAGTGTG GAGATGGCTG TGACCCCCAA GGACTCAGGGACAACAGTCA GTTCTGCTTG CAAAGGATCC ACCAGGGTCT GATTTTTTATGAGAAGCTGC TAGGATCGGA TATTTTCACA GGGGAGCCTT CTCTGCTCCCTGATAGCCCT GTGGCGCAGC TTCATGCCTC CCTACTGGGC CTCAGCCAACTCCTGCAGCC TGAGGGTCAC CACTGGGAGA CTCAGCAGAT TCCAAGCCTCAGTCCCAGCC AGCCATGGCA GCGTCTCCTT CTCCGCTTCA AAATCCTTCGCAGCCTCCAG GCCTTTGTGG CTGTAGCCGC CCGGGTCTTT GCCCATGGAGCAGCAACCCT GAGTCCCTAA嚙齒動(dòng)物，例如小鼠IL-B30(SEQ ID NO3和4)CGCTTAGAAG TCGGACTACA GAGTTAGACT CAGAACCAAA GGAGGTGGAT AGGGGGTCCA 60CAGGCCTGGT GCAGATCACA GAGCCAGCCA GATCTGAGAA GCAGGGAACA AG ATG 115Met-21CTG GAT TGC AGA GCA GTA ATA ATG CTA TGG CTG TTG CCC TGG GTC ACT163Leu Asp Cys Arg Ala Val Ile Met Leu Trp Leu Leu Pro Trp Val Thr-20 -15 -10 -5CAG GGC CTG GCT GTG CCT AGG AGT AGC AGT CCT GAC TGG GCT CAG TGC211Gln Gly Leu Ala Val Pro Arg Ser Ser Ser Pro Asp Trp Ala Gln Cys1 5 10CAG CAG CTC TCT CGG AAT CTC TGC ATG CTA GCC TGG AAC GCA CAT GCA259Gln Gln Leu Ser Arg Asn Leu Cys Met Leu Ala Trp Asn Ala His Ala15 20 25CCA GCG GGA CAT ATG AAT CTA CTA AGA GAA GAA GAG GAT GAA GAG ACT307Pro Ala Gly His Met Asn Leu Leu Arg Glu Glu Glu Asp Glu Glu Thr30 35 40AAA AAT AAT GTG CCC CGT ATC CAG TGT GAA GAT GGT TGT GAC CCA CAA355Lys Asn Asn Val Pro Arg Ile Gln Cys Glu Asp Gly Cys Asp Pro Gln45 50 55 60GGA CTC AAG GAC AAC AGC CAG TTC TGC TTG CAA AGG ATC CGC CAA GGT403Gly Leu Lys Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile Arg Gln Gly65 70 75CTG GCT TTT TAT AAG CAC CTG CTT GAC TCT GAC ATC TTC AAA GGG GAG451Leu Ala Phe Tyr Lys His Leu Leu Asp Ser Asp Ile Phe Lys Gly Glu80 85 90CCT GCT CTA CTC CCT GAT AGC CCC ATG GAG CAA CTT CAC ACC TCC CTA499Pro Ala Leu Leu Pro Asp Ser Pro Met Glu Gln Leu His Thr Ser Leu95 100 105CTA GGA CTC AGC CAA CTC CTC CAG CCA GAG GAT CAC CCC CGG GAG ACC547Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Asp His Pro Arg Glu Thr110 115 120CAA CAG ATG CCC AGC CTG AGT TCT AGT CAG CAG TGG CAG CGC CCC CTT595Gln Gln Met Pro Ser Leu Ser Ser Ser Gln Gln Trp Gln Arg Pro Leu125 130 135 140CTC CGT TCC AAG ATC CTT CGA AGC CTC CAG GCC TTT TTG GCC ATA GCT643Leu Arg Ser Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Leu Ala Ile Ala145 150 155GCC CGG GTC TTT GCC CAC GGA GCA GCA ACT CTG ACT GAG CCC TTA GTG691Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Thr Glu Pro Leu Val160 165 170CCA ACA GCT TAAGGATGCC CAGGTTCCCA TGGCTACCAT GATAAGACTA740Pro Thr Ala175ATCTATCAGC CCAGACATCT ACCAGTTAAT TAACCCATTA GGACTTGTGC TGTTCTTGTT 800TCGTTTGTTT TGCGTGAAGG GCAAGGACAC CATTATTAAA GAGAAAAGAA ACAAACCCCA 860GAGCAGGCAG CTGGCTAGAG AAAGGAGCTG GAGAAGAAGA ATAAAGTCTC GAGCCCTTGG 920CCTTGGAAGC GGGCAAGCAG CTGCGTGGCC TGAGGGGAAG GGGGCGGTGG CATCGAGAAA 980CTGTGAGAAA ACCCAGAGCA TCAGAAAAAG TGAGCCCAGG CTTTGGCCAT TATCTGTAAG 1040AAAAACAAGA AAAGGGGAAC ATTATACTTT CCTGGGTGGC TCAGGGAAAT GTGCAGATGC 1100ACAGTACTCC AGACAGCAGC TCTGTACCTG CCTGCTCTGT CCCTCAGTTC TAACAGAATC 1160TAGTCACTAA GAACTAACAG GACTACCAAT ACGAACTGAC AAA 1203表2與IL-B30相比的各種IL-6和G-CSF實(shí)施方案的比較。人IL-B30為SEQ ID NO2；小鼠IL-B30為SEQ ID NO4；豬IL-B30為SEQ ID NO5；牛G-CSF為SEQ ID NO6；貓G-CSF為SEQ ID NO7；人G-CSF為SEQ ID NO8；小鼠G-CSF為SEQ ID NO9；水獺IL-6為SEQ ID NO10；貓IL-6為SEQ ID NO11；人IL-6為SEQ ID NO12；綿羊IL-6為SEQ ID NO13；小鼠IL-6為SEQ ID NO14；雞MGF為SEQ ID NO15；而KSHV(卡波西肉瘤皰疹病毒)的病毒IL-6為SEQ ID NO16。il30_人 .......... ......VPGG SSPVWTQCQQ LSQKLCT.LA WSAHPLVG..il30_小鼠.......... ......VPRS SSPDWAQCQQ LSRNLCM.LA WNAHAPAG..il30_豬.......... .......... .......... .......... ..........gcsf_牛 ......TPLG P.......AR SLPQSFLLKC LEQVRKIQAD GAELQERL..gcsf_貓 ......TPLG P.......TS SLPQSFLLKC LEQVRKVQAD GTALQERL..gcsf_人 ......TPLG P.......AS SLPQSFLLKC LEQVRKIQGD GAALQEKLVSgcsf_小鼠VPLVTVSALP P.......SL PLPRSFLLKS LEQVRKIQAS GSVLLEQL..il6_水獺 .AFPTPGPLG GDSKDDATSN RPPLTSADKM EDFIKFILGK ISALRNEM..il6_貓 .AFPTPGPLG G....DATSN RLPLTPADKM EELIKYILGK ISALKKEM..il6_人 .AFPAPVPPG EDSKDVAAPH RQPLTSSERI DKQIRYILDG ISALRKET..il6_綿羊 .AFPTPGPLG EDFKNDTTPS RLLLTTPEKT EALIKHIVDK ISAIRKEI..il6_小鼠 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SCLQRIHQGLgcsf_牛 .CAA.HKLCH PEELMLLRHS LGIP.QAPLS SCSSQSLQLR GCLNQLHGGLgcsf_貓 .CAA.HKLCH PEELVLLGHA LGIP.QAPLS SCSSQALQLT GCLRQLHSGLgcsf_人 ECAT.YKLCH PEELVLLGHS LGIP.WAPLS SCPSQALQLA GCLSQLHSGLgcsf_小鼠.CAT.YKLCH PEELVLLGHS LGIP.KASLS GCSSQALQQT QCLSQLHSGLil6_水獺.CDK.YNKCE DSKEVLAENN LNLPKLAEKD RCFQSRFNQE TCLTRITTGLil6_貓 .CDN.YNKCE DSKEALAENN LNLPKLAEKD GCFQSGFNQE TCLTRITTGLil6_人 .CNK.SNMCE SSKEALAENN LNLPKMAEKD GCFQSGFNEE TCLVKIITGLil6_綿羊.CEK.NDECE NSKETLAENK LKLPKMEEKD GCFQSGFNQA ICLIKTTAGLil6_小鼠.CNG.NSDCM NNDDALAENN LKLPEIQRND GCYQTGYNQE ICLLKISSGLmgf_雞 .CDT.FQLCT EEELQLVQPD PHLV.QAPLD QCHKRGFQAE VCFTQIRAGLil6_khsv LCYR.TGICK GILEPAAIFH LKLPAINDTD HCGLIGFNET SCLKKLADGFil30_人 IFYEKLLGSD IFTGE..... .PSLLPDSPV AQLHASLLGL SQLLQPE..Gil30_小鼠AFYKHLLDSD IFKGE..... .PALLPDSPM EQLHTSLLGL SQLLQPE..Dil30_豬VFYEKLLGSD IFTGE..... .PSLHPDGSV GQLHASLLGL RQLLQPE..Ggcsf_牛 FLYQGLLQAL AGIS...... .PELAPTLDT LQLDVTDFAT NIWLQMEDLGgcsf_貓 FLYQGLLQAL AGIS...... .PELAPTLDM LQLDITDFAI NIWQQMEDVGgcsf_人 FLYQGLLQAL EGIS...... .PELGPTLDT LQLDVADFAT TIWQQMEELGgcsf_小鼠CLYQGLLQAL SGIS...... .PALAPTLDL LQLDVANFAT TIWQQMENLGil6_水獺QEFQIHLKYL ESNYEG...N KDNAHSVYIS TKHLLQTLRP M..NQIEVTTil6_貓 QEFQIYLKFL QDKYEG...D KENAKSVYTS TNVLLQMLKR KGKNQDEVTIil6_人 LEFEVYLEYL QNRFES...S EEQARAVQMS TKVLIQFLQK KAKNLDAITTil6_綿羊LEYQIYLDFL QNEFEG...N QETVMELQSS IRTLIQILKE KIAGL....Iil6_小鼠LEYHSYLEYM KNNLKDN..K KDKARVLQRD TETLIHIFNQ EVKDLHKIVLmgf_雞 HAYHDSLGAV LRLLP..... ..NHTTLVET LQLDAANLSS NIQQQMEDLGil6_khsv FEFEVLFKFL TTEFGKSVIN VDVMELLTKT LGWDIQEELN KLTKTHY..S表2(接上頁)il30_人HHWETQQIP. .SLSPSQ..P WQRLLLRFKI LRSLQAFVAV AARVFAHGAAil30_小鼠 HPRETQQMP. .SLSSSQ..Q WQRPLLRSKI LRSLQAFLAI AARVFAHGAAil30_豬 HHWETEQTP. .SPSPSQ..P WQRLLLRLKI LRSLQAFVAV AARVFAHGAAgcsf_牛AAPAVQPTQ. .GAMPTFTSA FQRRAGGVLV ASQMHRFLEL AYRGLRYLAEgcsf_貓MAPAVPPTQ. .QTMFTFTSA FQRRAGGTLV ASNLQSFLEV AYRALRHFTKgcsf_人MAPALQPTQ. .GAMPAFASA FQRRAGGVLV ASHLQSFLEV SYRVLRHLAQgcsf_小鼠 VAPTVQPTQ. .SAMPAFTSA FQRRAGGVLA ISYLQGFLET ARLALHHLA.il6_水獺 PDPTTDASL. .QALFKSQDK WLKHTTIHLI LRRLEDFLQF SLRAIRIM..il6_貓 PVPTVEVGL. .QLSCSHR.R VAEAHNNHLT LRRLEDFLQL RLRAVRIM..il6_人 PDPTTNASL. .LTKLQAQNQ WLQDMTTHLI LRSFKEFLQS SLRALRQM..il6_綿羊 TTPATHTDM. .LEKMQSSNE WVKNAKVIII LRSLENFLQF SLRAIRMK..il6_小鼠 PTPISNALL. .TDKLESQKE WLRTKTIQFI LKSLEEFLKV TLRSTRQT..mgf_雞 LDTVTLPAEQ RSPPPTFSGP FQQQVGGFFI LANFQRFLET AYRALRHLARil6_khsv P.PKFDRG.. LLGRLQGLKY WVRHFASFYV LSAMEKFAGQ AVRVLDSIPDil30_人TLSP....il30_小鼠 TLTEPLVPTAil30_豬 TLSQ....gcsf_牛P.......gcsf_貓P.......gcsf_人P.......gcsf_小鼠 ........il6_水獺 ........il6_貓 ........il6_人 ........il6_綿羊 ........il6_小鼠 ........mgf_雞 L.......il6_khsv VTPDVHDKIL-B30與相關(guān)細(xì)胞因子蛋白的結(jié)構(gòu)同源性提示該分子相關(guān)的功能。IL-B30是一種表現(xiàn)出與IL-6和G-CSF序列相似性的長(zhǎng)鏈細(xì)胞因子。
IL-B30的激動(dòng)劑或拮抗劑也可以起功能拮抗劑或受體拮抗劑的作用，例如，它們阻斷IL-6或G-CSF與其相應(yīng)受體的結(jié)合，或阻斷IL-6或G-CSF介導(dǎo)相反的作用。因此，IL-B30或其拮抗劑可以用于治療異常的醫(yī)學(xué)病癥，包括免疫失調(diào)，例如T細(xì)胞免疫缺陷、慢性炎癥或組織排斥，或心血管病癥或神經(jīng)生理學(xué)病癥。
所述天然抗原能夠介導(dǎo)導(dǎo)致靶細(xì)胞中生物學(xué)反應(yīng)或生理學(xué)反應(yīng)的各種生化反應(yīng)。本文特征鑒定的優(yōu)選實(shí)施方案來自人類，但實(shí)際上存在其它靈長(zhǎng)類或其它物種的天然相應(yīng)物。例如靈長(zhǎng)類、犬科動(dòng)物、貓科動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物的其它哺乳動(dòng)物物種中蛋白的其它序列也可以利用。參見下文。下文的說明的典型目的是涉及人IL-B30，但同樣可應(yīng)用于來自其它物種的相關(guān)實(shí)施方案。II.純化的IL-B30人IL-B30的氨基酸序列作為一個(gè)實(shí)施方案示于SEQ ID NO2中。采用所提供的序列，可以用例如PCR技術(shù)或雜交的標(biāo)準(zhǔn)方法，分離其它天然存在的編碼該蛋白的核酸。在提供所述細(xì)胞因子的序列信息以便于鑒別該蛋白抗原與其它蛋白并例舉多種變異體方面，這些從氨基至羧基提供的氨基酸序列是重要的。此外，所述肽序列使得可以制備肽，以產(chǎn)生識(shí)別這類區(qū)段的抗體，核苷酸序列使得可以制備寡核苷酸探針，這兩種都是檢測(cè)或分離例如克隆編碼這種序列的基因的策略。
當(dāng)用于蛋白質(zhì)方面時(shí)，本文所用的術(shù)語“人可溶性IL-B30”將包括其氨基酸序列相應(yīng)于SEQ ID NO2中所示可溶性多肽的蛋白質(zhì)、或其有效片段(significant fragment)。優(yōu)選實(shí)施方案包括限定長(zhǎng)度的大量不同的(例如非重疊)區(qū)段。通常，大多數(shù)為至少2個(gè)、更通常為至少3個(gè)、優(yōu)選至少5個(gè)、7個(gè)或更多個(gè)氨基酸。盡管提供了最小的長(zhǎng)度，但更長(zhǎng)的各種大小的長(zhǎng)度可以也是合適的，例如一個(gè)7個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的區(qū)段和兩個(gè)12個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的區(qū)段。
例如抗體的結(jié)合組分通常以高親和性結(jié)合于IL-B30，所述高親和性例如至少約100nM，通常優(yōu)于約30nM，優(yōu)選優(yōu)于約10nM，更優(yōu)選優(yōu)于約3nM。在非人類的哺乳動(dòng)物物種(例如其它靈長(zhǎng)類、有蹄類動(dòng)物或嚙齒動(dòng)物)中會(huì)發(fā)現(xiàn)相應(yīng)蛋白(counterpart protein)。例如鳥類或兩棲類的非哺乳動(dòng)物物種也應(yīng)該具有結(jié)構(gòu)上或功能上相關(guān)的基因和蛋白。
本文所用的術(shù)語“多肽”包括有效片段或區(qū)段，包括一段至少約8個(gè)氨基酸的氨基酸殘基，一般至少約12個(gè)氨基酸，通常至少約16個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少約20個(gè)氨基酸，在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，為至少約30個(gè)或30個(gè)以上的氨基酸，例如35、40、45、50個(gè)氨基酸等。在所有實(shí)際的組合中，這類片段可以具有實(shí)際上在所有位置開始和/或結(jié)束的末端，例如于殘基1、2、3等開始，和于例如殘基150、149、148等結(jié)束。特別感興趣的肽具有相應(yīng)于結(jié)構(gòu)域邊界的末端，例如螺旋A、B、C和/或D。參見表1。
術(shù)語“結(jié)合組合物”是例如在抗體-抗原相互作用中特異性地與IL-B30結(jié)合的分子。特異性的范圍可以更寬或更窄，例如對(duì)特定實(shí)施方案特異性，或?qū)?shù)組相關(guān)實(shí)施方案特異性，例如對(duì)靈長(zhǎng)類、嚙齒動(dòng)物特異性等。它也包括例如蛋白質(zhì)的化合物，所述化合物特異性地與IL-B30結(jié)合，包括在天然的生理學(xué)相關(guān)蛋白-蛋白相互作用中或者共價(jià)結(jié)合或者非共價(jià)結(jié)合。所述分子可以是聚合物或化學(xué)試劑。功能類似物可以是具有結(jié)構(gòu)修飾的蛋白質(zhì)，或它可以是具有與所述合適結(jié)合決定簇相互作用的分子形狀的分子。所述化合物可以用作受體結(jié)合相互作用的激動(dòng)劑或拮抗劑，參見例如Goodman等(編輯)Goodman &Gilman’sThe Parmacological Bases of Therapeutics(當(dāng)前版)PergamonPress。
例如在蛋白質(zhì)方面，大致純通常是指該蛋白沒有其它污染蛋白、核酸或由所述原始來源生物衍生的其它生物物質(zhì)?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)方法，通常通過重量分析純度，純度通常為至少約40％，一般至少約50％，常常至少約60％，通常至少約80％，優(yōu)選至少約90％，在最優(yōu)選實(shí)施方案中，純度至少約95％。通常加入載體或賦形劑。
多肽或片段的溶解性取決于環(huán)境和所述多肽。許多參數(shù)影響多肽的溶解性，包括溫度、電解質(zhì)環(huán)境、所述多肽的大小和分子特征以及所述溶劑的性質(zhì)。通常，使用所述多肽的溫度范圍為約4℃至約65℃。使用時(shí)的溫度常常高于約18℃。對(duì)于診斷目的，所述溫度通常約為室溫或更高的溫度，但低于該測(cè)定中組分的變性溫度。對(duì)于治療目的，所述溫度常常為體溫，對(duì)于人和小鼠而言通常為約37℃，盡管在某些情況下，在原位或體外下所述溫度可以升高或降低。
所述多肽的大小和結(jié)構(gòu)應(yīng)該一般為大致穩(wěn)定狀態(tài)，通常不是變性狀態(tài)。在四級(jí)結(jié)構(gòu)中所述多肽可以與其它多肽結(jié)合，例如以賦予溶解性，或與脂質(zhì)或去污劑結(jié)合。
所述溶劑和電解質(zhì)通常為用于保存生物活性的類型的生物相容的緩沖液，通常接近生理水性溶劑。所述溶劑常常具有中性pH，通常為約5和10之間，最好為約7.5。在某些情況下，加入一種或多種去污劑，通常為溫和的非變性去污劑，例如CHS(膽固醇半檸檬酸酯(cholesteryl hemisuccinate))或CHAPS(3-[3-膽酰氨基丙基)二甲氨基]-1-丙烷磺酸酯(3-[3-cholamidoprophyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate))，或去污劑的濃度足夠低，以避免顯著破壞所述蛋白的結(jié)構(gòu)或生理特性。在其它情況下，可以使用強(qiáng)去污劑實(shí)現(xiàn)顯著變性。III.天然變異體本發(fā)明也包括與所述IL-B30抗原的氨基酸序列具有大致氨基酸序列同一性的蛋白或肽。所述變異體包括物種變異體、多態(tài)或等位基因變異體。
通過使殘基匹配最優(yōu)化，必要時(shí)，根據(jù)需要引入間隙，確定氨基酸序列的同源性或序列同一性。也參見Needleham等(1970)J.Mol.Biol.48443-453；Sankoff等，(1983)Time Warps.String Edits.andMacromoleculesThe Theory and Practice of Sequence Comparsion的第1章，Addison-Wesley，Reading，MA；和IntelliGenetics(Mountain View，CA)的軟件包；和the University of Wisconsin Genetics Computer Group(Madison，WI)的軟件包。當(dāng)將保守取代考慮為匹配時(shí)，序列同一性會(huì)有變化。保守取代通常包括以下組內(nèi)的取代甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。保守性可以應(yīng)用于生物學(xué)特征、功能特征或結(jié)構(gòu)特征。同源的氨基酸序列通常計(jì)劃包括蛋白質(zhì)序列中的天然多態(tài)或等位基因變異和種間變異。典型的同源蛋白或肽與所述IL-B30的氨基酸序列的同一性將從25-100％(如果可以引入間隙)至50-100％(如果包括保守取代)。同一性測(cè)量結(jié)果將至少為大約35％，一般至少為大約40％，常常至少為大約50％，典型的至少為大約60％，通常至少為大約70％，優(yōu)選至少為大約80％，而更優(yōu)選至少為大約90％。
通過核苷酸置換、核苷酸缺失、核苷酸插入和短的核苷酸序列倒位，可以容易地修飾分離的IL-B30 DNA。這些修飾產(chǎn)生編碼這些抗原、其衍生物或具有相似生理、免疫原性、抗原性或其它功能活性的蛋白質(zhì)的新的DNA序列。這些修飾的序列可以用來產(chǎn)生突變抗原，或增強(qiáng)表達(dá)。增強(qiáng)的表達(dá)可以包括基因擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄增加、翻譯增加和其它機(jī)制。“突變IL-B30”包括這樣的多肽，它們?cè)谄渌矫鎸儆谝陨咸岢龅腎L-B30的序列同一性定義內(nèi)，但其氨基酸序列無論由于缺失、置換，還是由于插入，均不同于自然界中發(fā)現(xiàn)的IL-B30的氨基酸序列。這通常包括與具有SEQ ID NO2序列的蛋白質(zhì)具有顯著同一性、并且與那些序列享有不同的生物活性(例如抗原性或免疫原性)的蛋白，在優(yōu)選實(shí)施方案中，包含天然的全長(zhǎng)所公開的序列的大部分。通常最好使用全長(zhǎng)序列，盡管也可以使用截短的變體，同樣，通常最需要從天然來源發(fā)現(xiàn)的基因或蛋白。相似的概念適用于不同的IL-B30蛋白，特別是在各種溫血?jiǎng)游?例如哺乳動(dòng)物和鳥類)中發(fā)現(xiàn)的那些IL-B30蛋白。這些描述一般是指包括所有的IL-B30蛋白，但不限于具體討論的特定的靈長(zhǎng)類實(shí)施方案。
也可以通過制備氨基酸插入或缺失，進(jìn)行IL-B30誘變?？梢援a(chǎn)生置換、缺失、插入或任何組合，以得到最終的構(gòu)成物。插入包括氨基或羧基末端融合。可以于靶密碼子進(jìn)行隨機(jī)誘變，然后對(duì)所表達(dá)的突變體篩選所需活性。于序列已知的DNA預(yù)定位點(diǎn)制備置換突變的方法是本領(lǐng)域眾所周知，例如通過M13引物誘變或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)。參見例如Sambrook等(1989)；Ausubel等(1987和增補(bǔ)本)；和Kunkel等(1987)Methods in Enzvmol.154367-382。優(yōu)選實(shí)施方案包括例如1重、2重、3重、5重、7重置換等，最好于核苷酸水平或氨基酸水平的保守置換。所述置換最好遠(yuǎn)離保守的半胱氨酸，通常在遠(yuǎn)離螺旋結(jié)構(gòu)域的區(qū)域中。這種變異體可以用來產(chǎn)生特異性抗體，通常享有許多或所有生物學(xué)特性。
本發(fā)明也提供重組蛋白，例如采用這些蛋白區(qū)段的異源融合蛋白。異源融合蛋白是天然情況下通常不以同一方式融合的蛋白或區(qū)段的融合體。相似的概念適用于異源核酸序列。
另外，可以組合源自其它蛋白的相似的功能域而制備新的構(gòu)成物。例如，靶結(jié)合區(qū)段或其它區(qū)段可以在不同的新融合多肽或片段之間“交換”。參見例如Cunningham等(1989)Science 2431330-1336；和O’Dowd等(1988)J.Biol.Chem.26315985-15992。
由Beaucage和Carruthers(1981)Tetra.Letts.221895-1862描述的亞磷酰胺法將產(chǎn)生合適的合成DNA片段?；蛘咄ㄟ^合成互補(bǔ)鏈并使所述鏈在合適的條件下相互退火，或者通過用DNA聚合酶與合適的引物序列，加入互補(bǔ)鏈(例如PCR技術(shù))，通常可獲得雙鏈片段。
在對(duì)細(xì)胞因子IL-6家族的比較中，可以對(duì)該基因應(yīng)用結(jié)構(gòu)分析。該家族包括例如IL-6、IL-11、IL-12、G-CSF、LIF、OSM、CNTF和Ob。人、豬和小鼠IL-B30序列與IL-6家族其它成員的序列對(duì)比應(yīng)該使得能夠定義結(jié)構(gòu)特性。特別是，可以用例如RASMOL程序確定β-折疊和α-螺旋殘基，參見Bazan等(1996)Nature 379591；Lodi等(1994)Science 2631762-1766；Sayle和Milner-White(1995)TIBS 20374-376；和Gronenberg等(1991)Protein Engineering 4263-269。用于置換的優(yōu)選殘基包括預(yù)期與受體相互作用的表面暴露的殘基。應(yīng)該保留功能的其它殘基將進(jìn)行保守置換，特別是對(duì)于遠(yuǎn)離表面暴露殘基的位置。IV.功能變異體由于競(jìng)爭(zhēng)性抑制所述配體與其受體的結(jié)合，可以導(dǎo)致阻斷對(duì)IL-B30的生理反應(yīng)。
本發(fā)明的體外測(cè)定通常使用分離的蛋白、包含這些蛋白受體結(jié)合區(qū)段的可溶性片段、或連接至固相基質(zhì)的片段。這些測(cè)定也將使得可以對(duì)或者結(jié)合區(qū)段突變和修飾、或者細(xì)胞因子突變和修飾(例如IL-B30類似物)的效應(yīng)進(jìn)行診斷測(cè)定。
本發(fā)明也設(shè)想使用競(jìng)爭(zhēng)性藥物篩選測(cè)定，例如其中抗所述細(xì)胞因子抗體或受體結(jié)合片段與測(cè)試化合物競(jìng)爭(zhēng)。
IL-B30抗原的“衍生物”包括天然存在形式的氨基酸序列突變體、糖基化變異體、與其它化學(xué)部分的共價(jià)或聚集綴合物。例如通過采用標(biāo)準(zhǔn)方法將官能團(tuán)(functionality)交聯(lián)至IL-B30氨基酸側(cè)鏈或于N末端或C末端發(fā)現(xiàn)的基團(tuán)上，可以制備共價(jià)衍生物。參見例如Lundblad和Noyes(1988)Chemical Reagents for Protein Modification，第1-2卷，CRC Press，Inc.，Boca Raton，F(xiàn)L；Hugli(1989編輯)Techniques in ProteinChemistry，Academic Press，San Diego，CA；和Wong(1991)Chemistryof Protein Conjugation and Cross Linking，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L。
具體地說，糖基化改變包括例如通過在多肽合成和加工期間、或在進(jìn)一步加工步驟中修飾多肽糖基化模式制備的糖基化改變。參見例如Elbein(1987)Ann.Rev.Biochem.56497-534。也包括具有相同一級(jí)氨基酸序列、具有其它微小修飾的肽變異體，所述微小修飾包括磷酸化氨基酸殘基，例如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸。
也提供IL-B30和其它同源或異源蛋白之間的融合多肽。許多細(xì)胞因子受體或其它表面蛋白是多體的，例如同二體實(shí)體，重復(fù)構(gòu)成物可能具有各種優(yōu)點(diǎn)，包括減輕對(duì)蛋白水解切割的敏感性。典型的實(shí)例是受體多肽(例如熒光素酶)與蛋白區(qū)段或結(jié)構(gòu)域(例如受體結(jié)合區(qū)段)的融合體，使得可以容易地確定所述融合配體的存在或位置。參見例如Dull等的美國(guó)專利第4,859,609號(hào)。其它基因融合伴侶包括細(xì)菌β-半乳糖苷酶、trpE、蛋白A、β-內(nèi)酰胺酶、α淀粉酶、乙醇脫氫酶、酵母α交配因子和檢測(cè)或純化標(biāo)記，諸如His6序列的FLAG序列。參見例如Godowski等(1988)Science 241812-816。
融合肽通常通過或者重組核酸法或通過合成多肽法制備。用于核酸操作和表達(dá)的技術(shù)一般描述于例如Sambrook等(1989)MolecularCloningA Laboratory-Manual(第2版)，第1-3卷，Cold Spring HarborLaboratory；和Ausubel等(1993編輯)Current Protocols in MolecularBiology，Greene and Wiley，NY。用于多肽合成的技術(shù)描述于Merrifield(1963)J.Amer.Chem.Soc.852149-2156；Merrifield(1986)Science 232341-347；Atherton等(1989)Solid Phase Peptide SynthesisA PracticalApproach，IRL Press，Oxford；和Grant(1992)Synthetic PeptidesAUser’s Guide，W.H.Freeman，NY?？梢詫⒅卣郫B方法應(yīng)用于合成蛋白。
本發(fā)明也設(shè)想使用非氨基酸序列改變或糖基化改變的IL-B30衍生物。這類衍生物可以包括與化學(xué)部分或蛋白載體的共價(jià)或聚集綴合物。共價(jià)或聚集衍生物可用作免疫原、免疫測(cè)定中的試劑，或用于諸如親和純化結(jié)合伴侶(例如其它抗原)的純化方法中。通過用本領(lǐng)域熟知的方法將IL-B30共價(jià)結(jié)合于諸如溴化氰活化的SEPHAROSE的固相支持體，或通過或不通過戊二醛交聯(lián)吸附至聚烯烴表面上，可以將IL-B30固定化，以用于純化抗IL-B30抗體或替代結(jié)合組合物的測(cè)定或純化。所述IL-B30蛋白也可以用可檢測(cè)基團(tuán)標(biāo)記，例如用于診斷測(cè)定。通過固定化抗體或互補(bǔ)結(jié)合伴侶，例如受體的結(jié)合部分，可以實(shí)現(xiàn)IL-B30的純化。
本發(fā)明的溶解的IL-B30或片段可以用作免疫原，用于產(chǎn)生抗血清或結(jié)合特異性抗體。純化的抗原可以用來篩選單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，包括天然抗體的抗原結(jié)合片段，例如Fab、Fab’、F(ab)2等。純化的IL-B30抗原也可以用作試劑，以檢測(cè)對(duì)存在水平提高的所述細(xì)胞因子應(yīng)答而產(chǎn)生的抗體，所述細(xì)胞因子可以是異常或特定的生理學(xué)病癥或疾病病癥是診斷指標(biāo)(diagnostic)。本發(fā)明考慮了針對(duì)SEQ IDNO1所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列而產(chǎn)生的抗體。特別是，本發(fā)明考慮了對(duì)特定結(jié)構(gòu)域(例如螺旋A、B、C或D)具有結(jié)合親和性的抗體或針對(duì)特定結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的抗體。
本發(fā)明考慮了另外的密切相關(guān)物種變異體的分離。DNA印跡分析和RNA印跡分析將確立相似的遺傳實(shí)體存在于其它哺乳動(dòng)物中?？赡躀L-B30廣布于物種變異體中，其中所述物種例如為嚙齒動(dòng)物、兔形目動(dòng)物、食肉動(dòng)物、偶蹄類、奇蹄類和靈長(zhǎng)類。
本發(fā)明也提供分離一組相關(guān)抗原的方法，其中所述相關(guān)抗體在結(jié)果、表達(dá)和功能方面表現(xiàn)出不同和相似性。所述分子的另外不同物種或多態(tài)變異體的分離，將大大促進(jìn)所述分子生理效應(yīng)的闡明。特別是，本發(fā)明提供用于鑒別不同物種中另外的同源遺傳實(shí)體的有用探針。
所述分離的基因?qū)⑹沟每梢赞D(zhuǎn)化缺乏IL-B30表達(dá)的細(xì)胞，例如缺乏相應(yīng)蛋白并表現(xiàn)出陰性背景活性的或者物種類型或者細(xì)胞。這應(yīng)該使得可以與未轉(zhuǎn)化對(duì)照細(xì)胞相比分析IL-B30的功能。
采用現(xiàn)代分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，特別是比較相關(guān)類別的成員時(shí)，解剖影響通過這些抗原介導(dǎo)的各種生理功能的關(guān)鍵結(jié)果元件是可能的。參見例如在Cunningham等(1989)Science 2431339-1336中描述的同系物掃描誘變技術(shù)；和O’Dowd等(1988)J Biol Chem 26315985-15992和Lechleiter等(1990)EMBO J.94381-4390中所用的方法。
胞內(nèi)功能可以涉及受體發(fā)送信號(hào)。然而，蛋白內(nèi)化可以發(fā)生在某些情況下，可能發(fā)生胞內(nèi)組分和細(xì)胞因子之間的相互作用。通過誘變或直接生化方法(例如交聯(lián)或親和法)，可以鑒別IL-B30與互作組分相互作用的特定區(qū)段。也可應(yīng)用采用晶體學(xué)方法或其它物理方法的結(jié)構(gòu)分析。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的進(jìn)一步研究，將包括可以通過親和法或遺傳方法(例如互補(bǔ)分析突變體)分離的結(jié)合組分的研究。
我們將繼續(xù)IL-B30表達(dá)和控制的進(jìn)一步研究。與抗原結(jié)合的控制元件應(yīng)該表現(xiàn)出不同的生理、發(fā)育、組織特異性或其它表達(dá)模式。對(duì)例如控制元件的遺傳區(qū)上游或下游很感興趣。
所述IL-B30抗原的結(jié)構(gòu)研究將導(dǎo)致設(shè)計(jì)新的抗原，特別是對(duì)該分子表現(xiàn)出激動(dòng)劑或拮抗劑特性的類似物。這可以與先前描述的篩選方法結(jié)合，以分離表現(xiàn)出所需活性范圍的抗原。V.抗體可以產(chǎn)生針對(duì)其天然存在形式和為其重組形式的所述IL-B30蛋白不同表位的抗體，包括物種、多態(tài)或等位基因變異體和它們的片段。另外，可以針對(duì)或者活性形式或者無活性形式的IL-B30產(chǎn)生抗體，所述IL-B30包括天然或變性形式。也考慮了抗獨(dú)特型抗體。
通過用所述抗原預(yù)定片段與免疫原性蛋白的綴合物免疫動(dòng)物，可以產(chǎn)生針對(duì)所述片段的抗體，包括結(jié)合片段和單鏈形式的抗體。從分泌所需抗體的細(xì)胞制備單克隆抗體。這些抗體可以根據(jù)與正常或缺陷的IL-B30的結(jié)合進(jìn)行篩選，或根據(jù)例如通過受體介導(dǎo)的激動(dòng)劑或拮抗劑活性進(jìn)行篩選。例如由于抗體立體阻斷與受體的結(jié)合，抗體可以是激動(dòng)劑或拮抗劑。這些單克隆抗體通常以至少約1mM的KD結(jié)合，其結(jié)合KD更通常至少約300μM，典型的至少約100μM，更典型至少約30μM，優(yōu)選至少約10μM，更優(yōu)選至少約3μM或更好。
本發(fā)明的抗體也可用于診斷應(yīng)用。作為捕獲抗體或非中和抗體，可以篩選其結(jié)合所述抗原的能力，而不抑制與受體的結(jié)合。作為中和抗體，它們可以用于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定。它們也可用于檢測(cè)或定量測(cè)定IL-B30蛋白或其受體。參見例如Chan(1987編輯)ImmunologyAPractical Guide，Academic Press，Orlando，F(xiàn)L；Price和Newman(1991編輯)Priciples and Practice of Immunoassay，Stockton Press，N.Y.；和Ngo(1988編輯)Nonisotopic Immunoassay，Plenum Press，N.Y.。交叉吸收或其它試驗(yàn)將鑒別表現(xiàn)出不同特異性范圍(例如特有的或共享的物種特異性)的抗體。
此外，包括抗原結(jié)合片段的本發(fā)明抗體可能是有效的拮抗劑，它們結(jié)合于抗原，并抑制與可能引發(fā)生物學(xué)反應(yīng)的受體的功能結(jié)合。它們也可以用作非中和抗體，可以偶聯(lián)至毒素或放射性核素，使得當(dāng)所述抗體結(jié)合于抗原時(shí)，將殺傷例如在其表面表達(dá)該抗體的細(xì)胞。此外，這些抗體可以或者直接或者借助接頭間接綴合于藥物或其它治療劑，可以實(shí)現(xiàn)藥物導(dǎo)向。
抗原片段可以連接至其它物質(zhì)上，特別是連接至多肽，作為待用作免疫原的融合或共價(jià)連接多肽?？乖捌淦慰梢匀诤匣蚬矁r(jià)連接至多種免疫原，諸如匙孔血藍(lán)蛋白、牛血清白蛋白、破傷風(fēng)類毒素等。關(guān)于制備多克隆抗體的方法的描述，參見Microbiology，HoeberMedical Division，Harper和Row，1969；Landsteiner(1962)Specificity ofSerological Reactions，Dover Publications，New York；Williams等(1967)Methods in Immunology and Immunochemistry，第1卷，Academic Press，New York；和Harlow和Lane(1988)AntibodiesA Laboratory Manual.CSH Press，NY。
在某些情況下，最好從各種哺乳動(dòng)物宿主制備單克隆抗體，所述哺乳動(dòng)物宿主諸如小鼠、嚙齒動(dòng)物、靈長(zhǎng)類、人類等。在例如Stites等(編輯)Basic and Clinicl Immunology，(第4版)，Lange MedicalPublications，Los Altos，CA和其中引用的參考文獻(xiàn)；Harlow和Lane(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，CSH Press；Goding(1986)Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice(第2版)，Academic Press，New York中；和特別是在Kohler和Milstein(1975)Nature 256495-497中(該文獻(xiàn)討論了產(chǎn)生單克隆抗體的一種方法)，可以找到制備這類單克隆抗體的技術(shù)的描述。
其它合適的技術(shù)涉及將淋巴細(xì)胞體外暴露于抗原多肽，或者暴露于噬菌體或相似載體中抗體文庫(kù)的選擇。參見Huse等(1989)“在噬菌體λ中產(chǎn)生免疫球蛋白所有組成組分的大聯(lián)合文庫(kù)”，Science2461275-1281；和Ward等(1989)Nature 341544-456。本發(fā)明的多肽和抗體可以修飾或不修飾而使用，包括嵌合抗體或人源化抗體。通常通過或者共價(jià)或者非共價(jià)連接提供可檢測(cè)信號(hào)的物質(zhì)，標(biāo)記所述多肽或抗體。種類繁多的標(biāo)記和綴合技術(shù)是已知的，并且在科學(xué)文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)中進(jìn)行了廣泛的報(bào)道。合適的標(biāo)記包括放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光部分、化學(xué)發(fā)光部分、磁性顆粒等。指出這類標(biāo)記用途的專利包括美國(guó)專利第3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,227,437；4,275,149；和4,366,241號(hào)。也可以產(chǎn)生重組免疫球蛋白，參見Cabilly的美國(guó)專利第4,816,567號(hào)；Moore等的美國(guó)專利第4,642,334號(hào)；和Queen等(1989)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA8610029-10033。
本發(fā)明的抗體也可以用于分離所述蛋白的親和層析。當(dāng)將所述抗體連接至固相支持體時(shí)，可以制備柱子。參見例如Wilchek等(1984)Meth.Enzymol.1043-55。
針對(duì)每種IL-B30產(chǎn)生的抗體也可以用來產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體。這些抗體可用于檢測(cè)或診斷與所述相應(yīng)抗原表達(dá)相關(guān)的各種免疫學(xué)病癥。VI.核酸所述肽序列和相關(guān)試劑可用于例如從天然來源檢測(cè)、分離或鑒別編碼IL-B30的DNA克隆。通常，這可用于從哺乳動(dòng)物分離基因，相似的方法將用于分離來自其它物種的基因，所述其它物種例如溫血?jiǎng)游?，諸如鳥類和哺乳動(dòng)物。交叉雜交將使得可以從相同的例如多肽變異體或其它物種分離IL-B30。許多不同方法可用來成功地分離合適的核酸克隆。
純化的蛋白或特定肽可用于通過標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生抗體，如上所述?？梢詫⒑铣呻幕蚣兓鞍滋岢式o免疫系統(tǒng)，以產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體。參見例如Coligan(1991)Current Protocols in ImmunologyWiley/Greene；和Harlow和Lane(1989)AntibodiesA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press。
例如，所述特異性結(jié)合組合物可以用來篩選由表達(dá)IL-B30的細(xì)胞系制備的表達(dá)文庫(kù)。可以通過各種染色或免疫熒光方法，進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)的篩選。結(jié)合組合物可以用來親和純化或分選出表達(dá)表面融合蛋白的細(xì)胞。
所述肽區(qū)段也可以用來預(yù)測(cè)合適的寡核苷酸，以篩選文庫(kù)?？梢杂盟鲞z傳密碼篩選可用作篩選探針的合適的寡核苷酸。參見例如SEQ ID NO1。與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)結(jié)合，合成寡核苷酸將可用于從文庫(kù)選擇正確的克隆。互補(bǔ)序列也可以用作探針、引物或反義鏈。例如與錨定載體或poly-A互補(bǔ)PCR技術(shù)或與其它肽的互補(bǔ)DNA偶聯(lián)的各種片段應(yīng)該是特別有用的。
本發(fā)明考慮了使用分離的DNA或片段，以編碼相應(yīng)的生物活性IL-B30多肽，特別是缺乏編碼所述序列非翻譯5’部分的部分。另外，本發(fā)明包括編碼生物活性蛋白或多肽、并且能夠在合適條件下與本文所述DNA序列雜交的分離或重組DNA。所述生物活性蛋白或多肽可以是完整的抗原或片段，具有公開于例如SEQ ID NO2的氨基酸序列，特別是成熟的分泌多肽。此外，本發(fā)明包括其編碼的蛋白表現(xiàn)出與分泌IL-B30具有高度同一性的分離的或重組的DNA或其片段的應(yīng)用。所述分離的DNA可以在5’側(cè)翼和3’側(cè)翼具有相應(yīng)的調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、poly-A添加信號(hào)和其它序列?；蛘撸ㄟ^將編碼區(qū)段操作性連接至異源啟動(dòng)子，例如通過將啟動(dòng)子插入內(nèi)源基因上游，可以實(shí)現(xiàn)表達(dá)。
“分離的”核酸是與天然天然序列伴隨的其它組分(例如核糖體、聚合酶/或來自起源生物的側(cè)翼基因組序列)大致分離的核酸，例如RNA、DNA或混合聚合物。該術(shù)語包括已經(jīng)從其天然存在的環(huán)境中取出的核酸序列，包括重組的或克隆的DNA分離物和化學(xué)合成的類似物或通過異源系統(tǒng)生物合成的類似物。大致純的分子包括分離形式的所述分子。一般而言，所述核酸位于小于約50kb的載體或片段中，所述載體或片段常常小于約30kb，通常小于約10kb，最好小于約6kb。
分離的核酸一般是分子的同種組合物，但在某些實(shí)施方案中，將含有少量異質(zhì)性。這種異質(zhì)性通常發(fā)現(xiàn)于所述聚合物末端或?qū)τ谒枭锕δ芑蚧钚圆恢匾牟糠帧?br> “重組的”核酸根據(jù)或者其生產(chǎn)方法或者其結(jié)構(gòu)定義。對(duì)于其生產(chǎn)方法，例如用使用重組核酸技術(shù)的方法生產(chǎn)的產(chǎn)物，所述重組技術(shù)例如涉及在所述核苷酸序列中人的干涉，通常為選擇或生產(chǎn)?；蛘?，它可以是用以下方法制備的核酸產(chǎn)生包含天然相互不相鄰的兩種片段的融合體的序列，但是指排除天然產(chǎn)物，例如天然存在的突變體。因此，例如，包括用任何非天然存在的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞而制備的產(chǎn)物，也包括包含用任何合成寡核苷酸方法所衍生序列的核酸。通常進(jìn)行這樣一種方法，以用編碼同一種氨基酸或保守的氨基酸的豐余密碼子取代一個(gè)密碼子，同時(shí)通常引入或去除一個(gè)序列識(shí)別位點(diǎn)。
或者，進(jìn)行該方法，以將所需功能的核酸區(qū)段連接在一起，以產(chǎn)生包括所需功能組合的單一的遺傳實(shí)體，其中所述功能組合是未在通?？傻玫降奶烊恍问街邪l(fā)現(xiàn)的組合。限制性酶的識(shí)別位點(diǎn)常常是這類人工操作的靶，但可以通過設(shè)計(jì)，加入其它位點(diǎn)特異性靶，例如啟動(dòng)子、DNA復(fù)制位點(diǎn)、調(diào)節(jié)序列、控制序列或其它有用的特征。相似的概念將用于重組(例如融合)多肽。具體包括合成的核酸，它由于遺傳密碼的豐余性而編碼與這些抗原片段相似的多肽；和來自各種不同物種或多肽變異體的序列的融合體。
在核酸方面，有效“片段”是一連續(xù)的區(qū)段，它至少為大約17個(gè)核苷酸，一般至少為約22個(gè)核苷酸，常常至少為約29個(gè)核苷酸，更通常至少約35個(gè)核苷酸，典型至少為約41個(gè)核苷酸，通常至少為約47個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少為約55個(gè)核苷酸，在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，將至少為約60個(gè)或更多個(gè)核苷酸，例如67、73、81、89、95個(gè)等。
編碼IL-B30蛋白的核酸將特別用來鑒定編碼相關(guān)或相似蛋白的基因、mRNA和cDNA種類，以及鑒定編碼來自不同物種的同源蛋白的DNA。在其它物種中有同系物，所述其它物種包括靈長(zhǎng)類、嚙齒動(dòng)物、犬科動(dòng)物、貓科動(dòng)物和鳥類。各種IL-B30蛋白應(yīng)該是同源的，包括于本文中。然而，如果這些序列的同源性足夠大，則在合適條件下采用這些序列，甚至可以容易地分離與所述抗原進(jìn)化關(guān)系更遙遠(yuǎn)的蛋白。對(duì)靈長(zhǎng)類IL-B30蛋白特別感興趣。
得自基因組序列(例如含有內(nèi)含子)的重組克隆，將可用于轉(zhuǎn)基因研究，包括例如轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和生物，也可以用于基因治療。參見例如Goodnow(1992)“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”，Roitt(編輯)Encyclopedia ofImmunology，Academic Press，San Diego，第1502-1504頁；Travis(1992)Science 2561392-1394；Kuhn等(1991)Science 254707-710；Capecchi(1989)Science 2441288；Robertson(1987)(編輯)Teratocarcinomas andEmbryonic Stem CellsA Practical Approach，IRL Press，Oxford；和Rosenberg(1992)J.Clinical Oncology 10180-199。
在核酸序列比較方面，大致同源性例如同一性是指當(dāng)對(duì)比時(shí)，或者所述區(qū)段或者其互補(bǔ)鏈，在插入或缺失合適的核苷酸進(jìn)行最佳對(duì)比時(shí)，至少大約50％的核苷酸相同，相同的核苷酸一般至少為約58％，經(jīng)常至少為約65％，常常至少為約71％，典型至少為約77％，通常至少為大約85％，優(yōu)選至少為大約95％至98％或更多，而在特定實(shí)施方案中，高達(dá)大約99％或更多的核苷酸相同。另一方面，當(dāng)所述區(qū)段在選擇性雜交條件下與一條鏈或其互補(bǔ)鏈雜交時(shí)，存在著大致同源性，一般使用IL-B30的序列，例如SEQ ID NO1中的序列。通常，當(dāng)在一段至少大約30個(gè)核苷酸的序列中有至少大約55％同一性時(shí)，將發(fā)生選擇性雜交，優(yōu)選在約25個(gè)核苷酸的序列中同一性至少為大約75％，最優(yōu)選在約20個(gè)核苷酸中同一性至少為大約90％。參見Kanehisa(1984)Nuc.Acids Res.12203-213。所述的同源性比較的長(zhǎng)度如上所述，可以為更長(zhǎng)的序列，在某些實(shí)施方案中為一段至少為大約17個(gè)核苷酸的序列，一般至少為大約28個(gè)核苷酸，通常至少為大約40個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少為大約75-100個(gè)或更多的核苷酸。
關(guān)于雜交方面的同源性，嚴(yán)格條件將是通常在雜交反應(yīng)中控制的鹽、溫度、有機(jī)溶劑和其它參數(shù)的嚴(yán)格性的組合條件。嚴(yán)格性溫度條件通常包括超過大約30℃的溫度，通常為超過大約37℃的溫度，典型的為超過大約55℃的溫度，優(yōu)選為超過大約70℃的溫度。嚴(yán)格性的鹽條件一般低于大約1000mM，通常低于大約400mM，典型的低于大約250mM，優(yōu)選低于大約150mM，包括約100、50或甚至20mM。然而，參數(shù)的組合比任何單個(gè)參數(shù)的測(cè)量值更為重要。參見例如，Wetmur和Davidson(1968)J.Mol.Biol.31349-370。嚴(yán)格條件下的雜交得到的背景應(yīng)該是背景的至少2倍，最好至少3-5倍或更高。
對(duì)于序列比較，通常一個(gè)序列用作參比序列，將測(cè)試序列與其比較。當(dāng)使用一種序列比較算法時(shí)，將測(cè)試序列和參比序列輸入計(jì)算機(jī)，必要時(shí)指定亞序列坐標(biāo)，并且指定序列運(yùn)算規(guī)則程序的參數(shù)。然后，該序列比較算法根據(jù)指定的程序參數(shù)，計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參比序列的序列同一性百分率。
可以用如下進(jìn)行用于比較的序列的光學(xué)序列對(duì)比(opticalalignment)例如用Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2482的局部同源性算法、用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443的同源性序列對(duì)比算法、通過Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat’l AcadSci.USA 852444的相似性方法的檢索、通過計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)這些算法(Wisconsin Genetics軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)、或通過目測(cè)檢查(一般參見Ausubel等，見上文)。
有用的算法的一個(gè)實(shí)例是PILEUP。PILEUP采用漸進(jìn)的成對(duì)序列對(duì)比，產(chǎn)生來自一組相關(guān)序列的一個(gè)多重序列對(duì)比，以顯示關(guān)系和序列同一性的百分率。它也繪出一個(gè)樹(tree)或枝叉圖(dendrogram)，顯示用來產(chǎn)生所述序列對(duì)比的成簇關(guān)系。PILEUP采用Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evol.35351-360的漸進(jìn)序列對(duì)比法的簡(jiǎn)化方法。所用的方法類似于Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5151-153描述的方法。該程序可以對(duì)多達(dá)300個(gè)序列進(jìn)行序列對(duì)比，每個(gè)序列的最大長(zhǎng)度為5,000個(gè)核苷酸或氨基酸。多重序列對(duì)比法以兩個(gè)最相似的序列的成對(duì)序列對(duì)比開始，產(chǎn)生一組(a cluster of)兩個(gè)對(duì)比的序列。然后將該組與下一個(gè)最相關(guān)的序列或下一組對(duì)比的序列進(jìn)行序列對(duì)比。通過簡(jiǎn)單地延伸兩個(gè)單獨(dú)序列的成對(duì)序列對(duì)比，將兩組序列進(jìn)行序列對(duì)比。通過一系列漸進(jìn)的成對(duì)序列對(duì)比，得到最后的序列對(duì)比。通過指定序列比較區(qū)的特定序列及其氨基酸或核苷酸坐標(biāo)，并且指定該程序的參數(shù)，運(yùn)行該程序。例如，可以將參比序列與其它測(cè)試序列比較，以采用以下參數(shù)測(cè)定序列同一性關(guān)系的百分率默認(rèn)間隙加權(quán)值(3.00)、默認(rèn)間隙長(zhǎng)度加權(quán)值(0.10)和加權(quán)的末端間隙。
適用于測(cè)定序列同一性和序列相似性百分率的算法的另一實(shí)例是BLAST算法，在Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-410中有描述。公眾可從國(guó)家生物技術(shù)信息中心(httpwww.ncbi.nlm.nih.gov/)得到進(jìn)行BLAST分析的軟件。該算法包括首先通過在查詢序列中鑒別長(zhǎng)度為W的短字(short words)，而鑒別高計(jì)分序列對(duì)(HSP)，當(dāng)與一數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字進(jìn)行序列對(duì)比時(shí)，它們或者匹配或者滿足某些陽性值的閾值計(jì)分T。T稱為相鄰字計(jì)分閾值(Altschul等，見上文)。這些起始的相鄰字命中(word hit)用作種子，起始搜尋以尋找含所述字命中的較長(zhǎng)的HSP。然后，只要可以增加累積的序列對(duì)比計(jì)分，則所述字命中在兩個(gè)方向上沿每個(gè)序列延伸。在以下情況下，每個(gè)方向上所述字命中的延伸停止由于來自其最大得到的數(shù)值的數(shù)量X，累積的序列對(duì)比計(jì)分下降；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)計(jì)分的殘基序列對(duì)比的累積，累積計(jì)分轉(zhuǎn)為零或零以下；或達(dá)到兩個(gè)序列之一的末端。BLAST算法的參數(shù)W、T和X決定該序列對(duì)比的靈敏度和速度。BLAST程序使用時(shí)，默認(rèn)字長(zhǎng)(W)為11，BLOSUM62計(jì)分矩陣(參見Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 8910915)序列對(duì)比(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝4，并且比較兩條鏈。
除計(jì)算序列同一性百分率外，BLAST算法也進(jìn)行兩個(gè)序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 905873-5787)。BLAST算法提供的相似性的一種測(cè)量是最小和概率(P(N))，這提供偶然發(fā)生兩個(gè)核苷酸序列或氨基酸序列之間匹配概率的指標(biāo)。例如，如果在測(cè)試核酸與參比核酸的比較中，最小和概率低于大約0.1，更優(yōu)選低于大約0.01，最優(yōu)選低于大約0.001時(shí)，認(rèn)為該核酸與參比序列相似。
兩個(gè)多肽的核酸序列大致相同的再一指標(biāo)是第一種核酸編碼的多肽與第二種核酸編碼的多肽免疫交叉反應(yīng)，如以下所述。因此，例如在一種多肽與第二種多肽僅由于保守取代而不同時(shí)，這兩種多肽通常大致相同。兩個(gè)核酸序列大致相同的另一指標(biāo)是所述兩種分子在嚴(yán)格條件下相互雜交，如下所述。
通過密切相關(guān)物種的交叉物種雜交，可以克隆并分離來自其它哺乳動(dòng)物的IL-B30。在遠(yuǎn)緣物種之間的同源性可能相對(duì)低，因此最好是相對(duì)密切相關(guān)的物種的雜交?；蛘?，表現(xiàn)出物種同源性較低的抗體制備物的制備，可用于表達(dá)克隆方法。VII.制備IL-B30；模擬物通過化學(xué)合成、篩選cDNA文庫(kù)或篩選由種類繁多的細(xì)胞系或組織樣品制備的基因組文庫(kù)，可以獲得編碼所述IL-B30或其片段的DNA。參見例如Okayama和Berg(1982)Mol.Cell.Biol.2161-170；Gubler和Hoffman(1983)Gene 25263-269；和Glover(1984編輯)DNACloningA Practical Approach，IRL Press，Oxford?；蛘?，本文提供的序列提供有用的PCR引物，或使得可以化學(xué)或其它制備編碼IL-B30的合適基因；包括天然存在的實(shí)施方案。
該DNA可以在種類繁多的宿主細(xì)胞中表達(dá)，用于合成全長(zhǎng)IL-B30或片段，所述全長(zhǎng)IL-B30或片段進(jìn)而可以例如用來產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體；用于結(jié)合研究；用于構(gòu)建和表達(dá)修飾的分子；和用于結(jié)構(gòu)/功能研究。
本文所用的載體包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體、整合型DNA片段和能夠?qū)NA片段整合入宿主基因組中的其它載體。參見例如Pouwels等(1985和增補(bǔ)本)Cloning VectorsA Laboratorv Manual，Elsevier，N.Y.；和Rodriguez等(1988)(編輯)VectorsA Survey of Molecular CloningVectors and Their Uses，Buttersworth，Boston，MA。
對(duì)于本發(fā)明的目的，當(dāng)DNA序列功能上相互相關(guān)時(shí)，將它們操作性連接。例如，如果DNA作為前蛋白表達(dá)或參與將所述多肽導(dǎo)向細(xì)胞膜或指導(dǎo)分泌所述多肽，則將前序列(presequence)或分泌前導(dǎo)序列的DNA操作性連接至所述多肽。如果啟動(dòng)子控制所述多肽的轉(zhuǎn)錄，則將該啟動(dòng)子操作性連接至編碼序列；如果將核糖體結(jié)合位點(diǎn)定位以允許翻譯，則將核糖體結(jié)合位點(diǎn)操作性連接至編碼序列。通常，操作性連接是指鄰近的并且在讀框內(nèi)，然而，諸如阻抑物基因的某些遺傳元件不是鄰近連接的，但仍結(jié)合于操縱基因序列，進(jìn)而控制表達(dá)。參見例如Rodrguez等，第10章，第205-236頁；Balbas和Bolivar(1990)Methods in Enzymology 18514-37；和Ausubel等(1993)CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene and Wiley，NY。
合適表達(dá)載體的代表性實(shí)例包括pCDNA1；pCD，參見Okayama等(1985)Mol.Cell Biol.51136-1142；pMClneo Poly-A，參見Thomas等(1987)Cell 51503-512；和桿狀病毒載體，諸如pAC 373或pAC 610。參見例如Miller(1988)Ann.Rev.Microbiol.42177-199。
通常最好在提供特定或限定糖基化模式的系統(tǒng)中表達(dá)IL-B30多肽。參見例如Luckow和Summers(1988)Bio/Technology 647-55；和Kaufman(1990)Meth.Enzymol.185487-511。
可以對(duì)所述IL-B30或其片段進(jìn)行工程改造為連接于細(xì)胞膜的磷脂酰肌醇(PI)，但可以通過用磷脂酰肌醇切割酶(例如磷脂酰肌醇磷脂酶C)處理從細(xì)胞膜去除。這釋放生物活性形式的所述抗原，使得可以用蛋白化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行純化。參見例如Low(1989) Biochim.Biophys.Acta 988427-454；Tse等(1985)Science 2301003-1008；和Brunner等(1991)J.Cell Biol.1141275-1283。
既然已經(jīng)特征鑒定出所述IL-B30，而可以通過合成肽的常規(guī)方法制備其片段或衍生物。這些包括諸如在以下文獻(xiàn)中描述的方法Stewart和Young(1984)Solid Phase Peptide Synthesis，Pierce ChemicalCo.，Rockford，IL；Bodanszky和Bodanszky(1984)The Practice of PeptideSynthesis，Springer-Verlag，New York；Bodanszky(1984)The Principlesof Peptide Synthesis，Springer-Verlag，New York；和Villafranca(1991編輯)Techniques in Protein Chemistry II，Academic Press，San Diego，Ca。VIII.用途本發(fā)明提供供例如IL-B30介導(dǎo)的病癥或以下在診斷試劑盒描述的本文其它方面描述的診斷應(yīng)用之用的試劑。所述基因可以用于司法科學(xué)，例如以辨別嚙齒動(dòng)物與人類，或用作辨別表現(xiàn)出差異表達(dá)或修飾模式的不同細(xì)胞的標(biāo)記。
本發(fā)明也提供具有顯著經(jīng)濟(jì)潛力和/或治療潛力的試劑。所述IL-B30(天然存在的或重組的)或其片段及其抗體與鑒定為對(duì)IL-B30具有結(jié)合親和性的化合物，應(yīng)該可用作教授分子生物學(xué)、免疫學(xué)或生理學(xué)技術(shù)的試劑。例如在實(shí)踐實(shí)驗(yàn)室練習(xí)、生產(chǎn)或使用蛋白質(zhì)、抗體、克隆方法、組織學(xué)等方面，可以用所述試劑制備合適試劑盒。
所述試劑也可以用于治療與異常生理或發(fā)育(包括炎癥病癥)相關(guān)的病癥。它們可以用于體外測(cè)試可能與特定治療策略的成功相關(guān)的互作組分的存在或不存在。特別是，采用本文提供的組合物，通過合適的治療方法將得到各種例如造血細(xì)胞或淋巴細(xì)胞生理的調(diào)節(jié)。參見例如Thomson(1994編輯)The Cytokine handbook (第2版)Academic Press，San Diego；Metcalf和Nicola(1995)The Hematopoietic ColonyStimulating Factors Cambridge University Press；和Aggarwal和Gutterman(1991)Human Cytokines Blackwell Pub.。
例如，與異常表達(dá)IL-B30或IL-B30異常信號(hào)相關(guān)的疾病或病癥，應(yīng)該是激動(dòng)劑或拮抗劑的可能靶。所述新細(xì)胞因子應(yīng)該在例如淋巴細(xì)胞的造血細(xì)胞調(diào)節(jié)或發(fā)育中起作用，影響免疫應(yīng)答，例如炎癥和/或自身免疫失調(diào)。或者，它可能影響血管生理學(xué)或發(fā)育或神經(jīng)元作用。
特別是，所述細(xì)胞因子應(yīng)該在不同方面介導(dǎo)所述細(xì)胞的細(xì)胞因子合成、增殖等。IL-B30的拮抗劑，諸如天然存在形式的IL-B30的突變蛋白變異體或阻斷抗體，可以提供一種選擇性和有效的方法，以在諸如炎性或自身免疫反應(yīng)的情況下阻斷免疫應(yīng)答。也參見Samter等(編輯)Immunolological Diseases第1和2卷，Little，Brown and Co.。
另外，某些聯(lián)合組合物可能例如與其它炎癥調(diào)節(jié)劑一起使用。這類其它分子可以包括類固醇、IL-6和/或G-CSF的其它變體(包括物種變異體)或病毒同系物以及它們各自的拮抗劑。
在通過RNA印跡分析表現(xiàn)出產(chǎn)生IL-B30 mRNA的每種細(xì)胞類型中，各種異常病癥是已知的。參見Berkow(編輯)The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy，Merck & Co.，Rahway，N.J.；Thorn等，Harrison’sPrinciples of Internal Medicine，McGraw-Hill，N.Y.；和Weatherall等(編輯)Oxford Textbook of Medicine，Oxford University Press，Oxford。許多其它醫(yī)學(xué)病癥和疾病涉及被巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞活化，許多這些病癥和疾病對(duì)用本文提供的激動(dòng)劑或拮抗劑的治療有反應(yīng)。參見例如Stites和Terr(1991編輯)Basic and Clinical Immunology Appleton和Lange，挪威，Connecticut；和Samter等(編輯)Immnological Diseases Little，Brownand Co.。這些醫(yī)學(xué)難題應(yīng)該易于采用本文提供的組合物預(yù)防或治療。胰島定位提示可能與糖尿病相關(guān)。
可以純化IL-B30、拮抗劑、抗體等，然后將其給予獸醫(yī)患者或人類患者。例如在常規(guī)藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑(例如免疫原性佐劑)中，可以將這些試劑聯(lián)合另外的活性或惰性組分以及生理上無毒的穩(wěn)定劑、賦形劑或防腐劑，用于治療用途?？梢詫⑦@些組合物過濾除菌，將這些組合物通過在劑量管制瓶中凍干或貯存于穩(wěn)定化水性制劑中，以劑量形式放置。本發(fā)明也設(shè)想了包括非補(bǔ)體結(jié)合形式在內(nèi)的抗體及其結(jié)合片段的用途。
可以進(jìn)行用IL-B30及其片段的藥物篩選，以鑒別對(duì)IL-B30具有結(jié)合親和性或?qū)L-B30功能具有其它相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)的化合物，包括相關(guān)組分的分離。然后，可以利用后續(xù)的生物測(cè)定，確定所述化合物是否具有內(nèi)在刺激活性，并且是否由此因?yàn)樽钄嗨黾?xì)胞因子活性而為阻斷劑或拮抗劑。同樣，具有內(nèi)在刺激活性的化合物，可以激活所述信號(hào)途徑，并由此因?yàn)樗碳L-B30活性而為激動(dòng)劑。本發(fā)明還設(shè)想了IL-B30的阻斷抗體作為拮抗劑的治療用途和刺激性抗體作為激動(dòng)劑的治療用途。該方法應(yīng)該對(duì)于其它IL-B30物種的變異體特別有用。
有效治療所需的試劑量將取決于許多不同因素，包括給藥方法、靶部位、所述患者的生理狀況和其它給予的藥物。因此，應(yīng)該確定治療劑量，以優(yōu)化安全性和效力。通常，體外所用的劑量可以在原位給予這些試劑的用量方面提供有用的指南。治療特定病癥的有效量的動(dòng)物測(cè)試將提供進(jìn)一步的人類劑量的預(yù)測(cè)性指標(biāo)。例如在Gilman等(1990編輯)Goodman and Gilman’sThe Pharmacological Bases of Therapeutics，第8版，Pergamon Press；和Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，(1990)，Mack Publishing Co.，Easton，Penn中，描述了各種考慮。其中以及下文討論了給藥方法，例如經(jīng)口、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)給藥、透皮擴(kuò)散和其它給藥方法。藥學(xué)上可接受的載體將包括水、鹽水、緩沖液和例如在Merck Index，Merck & Co.，Rahway，New Jersey中描述的其它化合物。通常預(yù)計(jì)具有合適載體的劑量范圍為低于1mM濃度的量，通常低于約10μM濃度，常常低于約100μM，優(yōu)選低于約10pM(皮摩爾濃度)，最優(yōu)選低于約1 fM(費(fèi)摩爾濃度)。慢釋制劑或慢釋裝置通常用于持續(xù)或長(zhǎng)期給藥。參見例如Langer(1990)Science2491527-1533。
IL-B30、其片段、其抗體或抗體片段、拮抗劑和激動(dòng)劑，可以直接給予待治療宿主，或根據(jù)所述化合物的大小，可能最好在給予它們之前，將它們綴合于諸如卵清蛋白或血清白蛋白的載體蛋白。治療制劑可以以許多常規(guī)劑量制劑給予。盡管可能單獨(dú)給予所述活性組分，但最好將其作為藥用制劑給予。制劑通常包含至少一種以上定義的活性組分與其一種或多種可接受的載體。在與其它組分相容并且對(duì)所述患者無害的意義上，每種載體應(yīng)該是藥學(xué)上和生理上可接受的。制劑包括適用于經(jīng)口、直腸、鼻、局部或胃腸外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮內(nèi))給藥的制劑。所述制劑可以方便地以單位劑型給予，并且可以用藥學(xué)領(lǐng)域熟知的方法制備。參見例如Gilman等(1990編輯)Goodmanand Gilman’sThe Pharmacological Bases of Therapeutics.，第8版，Pergamon Press；和Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，(1990)，Mack Publishing Co.，Easton，Penn.；Avis等(1993編輯)Pharmaceutical Dosage Forms Parenteral Medications Dekker，New York；Lieberman等(1990編輯)Pharmaceutical Dosage FormsTablets，Dekker，New York；和Lieberman等(1990編輯)Pharmaceutical Dosage FormsDisperse Systems，Dekker，New York。本發(fā)明的療法可以與其它藥劑聯(lián)合，或結(jié)合其它藥劑使用，其它藥物諸如其它細(xì)胞因子，包括IL-6或G-CSF或其相應(yīng)的拮抗劑。
天然存在形式或重組形式的本發(fā)明IL-B30均特別可用于能夠篩選對(duì)所述蛋白有結(jié)合活性的化合物的試劑盒和測(cè)定方法。最近數(shù)年已經(jīng)開發(fā)了幾種自動(dòng)測(cè)定方法，以便使得可以在短時(shí)間內(nèi)篩選數(shù)萬種化合物。參見例如Fodor等(1991)Science 251767-773，該文獻(xiàn)描述了用于在固相支持體上合成的多種限定聚合物結(jié)合親和性的測(cè)試方法。如本發(fā)明提供的大量純化、可溶性IL-B30的可得性，可以大大促進(jìn)合適測(cè)定的開發(fā)。
其它方法可以用來確定IL-B30-IL-B30受體相互作用中的關(guān)鍵殘基?？梢赃M(jìn)行突變分析，例如參見Somoza等(1993)J.Exptl.Med.178549-558，以確定所述相互作用和/或發(fā)送信號(hào)中關(guān)鍵的具體殘基。PHD(Rost和Sander(1994)Proteins 1955-72)和DSC(King和Sternberg(1996)Protein Sci.52298-2310)可以提供α-螺旋(H)、β-鏈(E)或卷曲螺旋(coil)(L)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。螺旋A和D是受體相互作用中最重要的，同時(shí)螺旋D是更為重要的區(qū)域。螺旋A在人類中可能從約pro(7)走向his(27)，而螺旋D可能從約trp(135)走向gly(162)。表面暴露的殘基可能影響受體結(jié)合，而包埋的殘基可能影響整體結(jié)構(gòu)。預(yù)測(cè)的特別重要的殘基可能對(duì)應(yīng)于arg(146)、ser(147)、gln(149)、ala(150)、ala(153)、val(154)、ala(156)、arg(157)、ala(160)和his(161)。
例如，一旦已經(jīng)例如通過四級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)確定了所述抗原的結(jié)構(gòu)，則通常可以發(fā)現(xiàn)拮抗劑。采用純化的IL-B30，因高度自動(dòng)化測(cè)定方法的開發(fā)，潛在的互作類似物的測(cè)試現(xiàn)在是可能的。特別是，通過采用本文描述的篩選技術(shù)，將發(fā)現(xiàn)新的激動(dòng)劑和拮抗劑。特別重要的是發(fā)現(xiàn)對(duì)一系列IL-B30分子具有組合結(jié)合親和性的化合物，例如，可以用作IL-B30物種變異體拮抗劑的化合物。
一種藥物篩選方法利用表達(dá)IL-B30的重組DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細(xì)胞?？梢苑蛛x表達(dá)與其它分子分離的IL-B30的細(xì)胞。這種活的或固定形式的細(xì)胞，可以用于標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合伴侶的結(jié)合鑒定法。也參見Parce等(1989)Science 246243-247；和Owicki等(1990)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 874007-4011，該文獻(xiàn)描述了測(cè)定細(xì)胞反應(yīng)的靈敏方法。
用于藥物篩選的另一技術(shù)涉及一種方法，該方法提供對(duì)IL-B30具有合適結(jié)合親和性的化合物的高通量篩選，詳細(xì)描述于Geysen的歐洲專利申請(qǐng)84/03564，該專利申請(qǐng)于1984年9月13日公開。首先，在例如塑料釘或某些其它合適表面的固體基質(zhì)上合成大量的不同小肽測(cè)試化合物，參見Fodor等(1991)。然而，使所有釘與溶解的未純化或溶解的純化IL-B30反應(yīng)，然后洗滌。下一步涉及測(cè)定結(jié)合的IL-B30。
合適的藥物設(shè)計(jì)也可以基于所述IL-B30或其它效應(yīng)物或類似物的分子形狀的結(jié)構(gòu)研究。效應(yīng)物可以是對(duì)結(jié)合應(yīng)答而介導(dǎo)其它功能的其它蛋白，或?yàn)橥ǔＥcIL-B30反應(yīng)的其它蛋白，例如受體。用于確定那些位點(diǎn)與特定的其它蛋白反應(yīng)的一種方法是物理結(jié)構(gòu)測(cè)定，例如X射線晶體學(xué)或二維NMR技術(shù)。這些將為那些氨基酸殘基形成分子接觸區(qū)、例如針對(duì)其它細(xì)胞因子-受體模型制作模型提供指南。關(guān)于蛋白結(jié)構(gòu)測(cè)定的詳細(xì)描述，參見例如Blundell和Johnson(1976)ProteinCrystallography，Academic Press，New York。IX.試劑盒本發(fā)明也考慮了IL-B30蛋白、其片段、肽和它們的融合產(chǎn)物的用途，即用于在多種用于檢測(cè)另一IL-B30或結(jié)合伴侶存在的診斷試劑盒和方法。通常，所述試劑盒會(huì)具有含或者特定IL-B30肽或基因區(qū)段或者識(shí)別一種或另一種(例如IL-B30片段或抗體)的試劑的區(qū)室。
用于測(cè)定測(cè)試化合物對(duì)IL-B30的結(jié)合親和性的試劑盒，通常包含一種測(cè)試化合物；一種標(biāo)記化合物，例如對(duì)IL-B30具有已知結(jié)合親和性的一種結(jié)合伴侶或抗體；一種IL-B30源(天然存在的或重組的)；和用于將結(jié)合的標(biāo)記化合物與游離標(biāo)記化合物分離的工具，例如用于將該分子固定化的固相。一旦篩選出化合物，則可以在合適的生物測(cè)定中評(píng)估對(duì)該抗原具有合適結(jié)合親和性的那些化合物，所述生物測(cè)定是本領(lǐng)域熟知的，用于測(cè)定它們是作為IL-B30信號(hào)途徑的激動(dòng)劑還是作為拮抗劑起作用。重組IL-B30多肽的可得性也提供了很好確定的校準(zhǔn)這類測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)。
用于測(cè)定樣品中例如IL-B30濃度的優(yōu)選試劑盒，通常包含一種對(duì)所述抗原具有已知結(jié)合親和性的標(biāo)記化合物，例如結(jié)合伴侶或抗體；一種細(xì)胞因子源(天然存在的或重組的)和一種將結(jié)合標(biāo)記化合物與游離標(biāo)記化合物分離的工具，例如用于將所述IL-B30固定化的固相。通常提供含試劑的區(qū)室和說明。
包括抗原結(jié)合片段在內(nèi)的所述IL-B30或片段的特異性抗體，可用于檢測(cè)水平提高的IL-B30和/或其片段存在的診斷應(yīng)用。這類診斷測(cè)定可以使用裂解液、活細(xì)胞、固定細(xì)胞、免疫熒光、細(xì)胞培養(yǎng)物、體液，還可以涉及血清中與所述抗原相關(guān)的抗原的檢測(cè)等。診斷測(cè)定可以是均相(在游離試劑和抗原結(jié)合伴侶復(fù)合物之間無分離步驟)或異相(有分離步驟)的。存在各種商業(yè)測(cè)定，諸如放射免疫測(cè)定(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、酶免疫測(cè)定(EIA)、酶倍增免疫測(cè)定(enzyme-multiplied immunoassay)技術(shù)(EMIT)、底物標(biāo)記熒光免疫測(cè)定(SLFIA)等。參見例如Van Vunakis等(1980)Meth Enzymol.701-525；Harlow和Lane(1980)AntibodiesA Laboratory Manua，CSH Press，NY；和Coligan等(1993編輯)Current Protocols in Immunology，Greene and Wiley，NY。
抗獨(dú)特型抗體可以相似地用來診斷抗IL-B30抗體的存在，這樣可以診斷各種異常狀態(tài)。例如，IL-B30的超量產(chǎn)生可能導(dǎo)致產(chǎn)生可能是異常生理狀況診斷標(biāo)志的各種免疫反應(yīng)，所述異常生理狀況特別是增殖性細(xì)胞病癥(諸如癌癥)或異?；罨蚍只?。此外，可得到的分布模式提供細(xì)胞因子在胰島中表達(dá)的信息，提示該細(xì)胞因子可能參與該器官功能、例如參與糖尿病相關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥的可能性。
通常，用于診斷測(cè)定的試劑在試劑盒中供應(yīng)，以便使該測(cè)定的靈敏度最佳化。對(duì)于本發(fā)明，根據(jù)該測(cè)定的性質(zhì)，提供所述方案和所述標(biāo)記(或者標(biāo)記或未標(biāo)記的抗體或結(jié)合伴侶，或者標(biāo)記IL-B30)。這通常與其它添加劑結(jié)合，所述添加劑諸如緩沖液、穩(wěn)定劑、信號(hào)產(chǎn)生必需的物質(zhì)，諸如酶的底物等。所述試劑盒最好也含有正確使用和使用后正確處理內(nèi)容物的說明。所述試劑盒通常具有每種有用試劑的區(qū)域。當(dāng)所述試劑可以在水性介質(zhì)中重建，提供進(jìn)行該測(cè)定的合適試劑濃度時(shí)，所述試劑最好是作為干燥的凍干粉提供。
所述藥物篩選和所述診斷測(cè)定的許多上述組分可以不修飾而使用，或以多種方式進(jìn)行修飾。例如，通過共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合直接或間接提供可檢測(cè)信號(hào)的部分，可以達(dá)到標(biāo)記。在這些測(cè)定中的任一種中，可以或者直接或間接標(biāo)記所述結(jié)合伴侶、測(cè)試化合物、IL-B30或其抗體。直接標(biāo)記的可能性包括標(biāo)記基團(tuán)諸如125I的放射標(biāo)記；酶(美國(guó)專利第3,645,090號(hào))，諸如過氧化物酶和堿性磷酸酶；和能夠監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度、波長(zhǎng)移動(dòng)或熒光偏振變化的熒光標(biāo)記(美國(guó)專利第3,940,475號(hào))。間接標(biāo)記的可能性包括將一種組分生物素化，然后結(jié)合于偶聯(lián)至一種上述標(biāo)記基團(tuán)的抗生物素蛋白。
也有許多分離結(jié)合Il-B30與游離IL-B30、或者分離結(jié)合測(cè)試化合物與游離測(cè)試化合物的方法。所述IL-B30可以固定于各種基質(zhì)上，然后進(jìn)行洗滌。合適的基質(zhì)包括諸如ELISA板的塑料、濾膜和珠粒。參見例如Coligan等(1993編輯)Current Protocols in Immunology，第1卷，第2章，Greene and Wiley，NY。其它合適的分離技術(shù)包括但不限于Rattle等(1984)Clin.Chem.301457-1461中描述的熒光抗體可磁化微粒法、以及美國(guó)專利第4,659,678號(hào)中描述的雙抗體磁性微粒分離。
在所述文獻(xiàn)中已經(jīng)廣泛報(bào)道了用于將蛋白或其片段交聯(lián)于各種標(biāo)記的方法，本文不需要詳細(xì)討論。許多這些技術(shù)涉及或者通過碳二亞胺或者活性酯而使用活化羧基，形成肽鍵；通過巰基與活化鹵素(諸如氯乙酰)或活化烯烴(諸如馬來酰亞胺)反應(yīng)形成硫代酸酯，以用于交聯(lián)等。融合蛋白也可供這些應(yīng)用使用。
本發(fā)明的另一診斷方面涉及使用取自IL-B30序列的寡核苷酸序列或多核苷酸序列。這些序列可以用作探針，以檢測(cè)懷疑患有異常病癥(例如炎性病癥或自身免疫病癥)患者樣品中所述IL-B30信息水平。由于該細(xì)胞因子可以是活化標(biāo)記或中介體，所以可用來檢測(cè)多種活性細(xì)胞，以確定例如在所述效應(yīng)變顯著或進(jìn)展為顯著之前可能例如以預(yù)防方式需要其它療法的時(shí)間。RNA和DNA核苷酸序列的制備、所述序列的標(biāo)記和所述序列的優(yōu)選大小在所述文獻(xiàn)中有大量的描述和討論。參見例如Langer-Sager等(1982)Proc.Nat’l.Acad.Sci.794381-4385；Caskey(1987)Science 236962-967；和Wilchek等(1988)Anal.Biochem.1711-32。
也考慮了也測(cè)試其它分子定性或定量表達(dá)的診斷試劑盒。診斷或預(yù)后可能取決于用作標(biāo)記的多種指標(biāo)的組合。因此，試劑盒可以測(cè)試標(biāo)記的組合。參見例如Viallet等(1989)Progress in Growth Factor Res.189-97。其它試劑盒可以用來評(píng)估其它細(xì)胞亞群。X.IL-B30受體的分離由于已經(jīng)分離出特異性配體-受體相互作用的配體，存在分離所述受體的方法。參見Gearing等(1989)EMBO J.83667-3676。例如，可以確定標(biāo)記所述IL-B30細(xì)胞因子、但不干擾與其受體結(jié)合的方法。例如，親和標(biāo)記可以融合于所述配體的或者氨基末端或者羧基末端。這種標(biāo)記可以是FLAG附加表位，或例如Ig或Fc結(jié)構(gòu)域。例如通過細(xì)胞分選，或測(cè)定表達(dá)這種結(jié)合組分的亞群的其它篩選，可以對(duì)表達(dá)文庫(kù)篩選所述細(xì)胞因子的結(jié)合。參見例如Ho等(1993)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 9011267-11271；和Liu等(1994)J.Immunol.1521821-29?；蛘?，可以使用淘選法。參見例如Seed和Aruffo(1987)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 843365-3369。
可以應(yīng)用蛋白質(zhì)與標(biāo)記交聯(lián)的技術(shù)來分離所述IL-B30細(xì)胞因子的結(jié)合伴侶。這應(yīng)該使得可以鑒定與該細(xì)胞因子例如以配體-受體樣方式特異性相互作用的蛋白。
將進(jìn)行早期試驗(yàn)，以確定已知的IL-6或G-CSF受體組分是否參與對(duì)IL-B30的應(yīng)答。這些功能受體復(fù)合物可以與IL-B30受體復(fù)合物共享許多或所有組分，這種可能性也相當(dāng)大，其中所述組分或者為特定受體亞基或者為輔助受體亞基。
可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行許多修改和變化，而不偏離本發(fā)明的精神和范圍，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。提供本文描述的具體實(shí)施方案僅僅是舉例說明，本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求書的條款以及這些權(quán)利要求賦予的相當(dāng)物的全部范圍限制。
實(shí)施例I.一般方法在Maniatis等(1982)Molecular CloningA Laboratory Manual ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press，NY；Sambrook等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual (第2版)第1-3卷，CSHPress，NY；Aububel等，Biology Greene Publishing Associates，Brooklyn，NY；或Ausubel等(1987和增補(bǔ)本)Current Protocols in MolecularBiology Wiley/Greene，NY；Innis等(1990編輯)PCR ProtocolsA Guideto Methods and Applications Academic Press，NY中，描述或引用的以下的許多標(biāo)準(zhǔn)方法。用于蛋白純化的方法包括諸如硫酸銨沉淀、柱層析、電泳、離心、結(jié)晶的方法和其它方法。參見例如Ausubel等(1987和定期增補(bǔ)本)；Deutscher(1990)“蛋白純化指南”，Methods in Enzymology第182卷和該系列中的其它卷；Coligan等(1995和增補(bǔ)本)CurrentProtocls in Protein Science John Wiley and Sons，New York，NY；P.Matsudaira(1993編輯)A Practical Guide to Protein and PeptidePurification for Microsequencing，Academic Press，San Diego，CA；和例如Pharmacia，Piscataway，NJ或Bio-Rad，Richmond，CA的生產(chǎn)商關(guān)于蛋白純化產(chǎn)品使用的文獻(xiàn)。與重組技術(shù)結(jié)合，使得可以與合適區(qū)段(附加表位)融合，例如與FLAG序列或可以通過蛋白酶可去除序列融合的相當(dāng)序列融合。參見例如Hochli(1989)Chemische Industrie 1269-70；Hichuli(1990)“用金屬螯合吸收劑純化重組蛋白”，Setlow(編輯)Genetic Engineeing.Principle and Methods 1287-98，Plenum Press，NY；和Crowe等(1992)OIAexpressThe High Level Expression & ProteinPurifcation System QUIAGEN，Inc.，Chatsworth，CA。
例如在Hertzenberg等(1996版)Weir’s Handbook of ExperimentalImmnology第1-4卷，Blackwell Science；Coligan(1991)CurrentProtocols in Immunology Wiley/Greene，NY；和Methods in Enzymology第70、73、74、84、92、93、108、116、121、132、150、162和163卷中，描述了標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)技術(shù)。例如在Thomson(1994編輯)The Cytokine Handbook(第2版)Academic Press，San Diego；Metcalf和Nicola(1995)The Hematopoietic Colony Stimulating Factors CambridgeUniversty Press；和Aggarwal和Gutterman(1991)Human CytokinesBlackwell Pub.中，描述了細(xì)胞因子測(cè)定。
血管生物活性的測(cè)定是本領(lǐng)域熟知的。它們包括腫瘤或其它組織(例如動(dòng)脈平滑肌)增生(參見例如Koyoma等(1996)Cell 871069-1078)、單核細(xì)胞粘著于血管上皮(參見McEvoy等(1997)J.Exp.Med.1852069-2077)等中的血管生成活性和血管抑制(angiostatic)活性。也參見Ross(1993)Nature 362801-809；Rekhter和Gordon(1995)Am.J.Pathol.147668-677；Thyberg等(1990)Atherosclerosis 10966-990；和Gumbiner(1996)Cell 84345-357。
例如在Wouterlood(1995編輯)Neuroscience Protocls modules 10，Elsevier；Methods in Neurosciences Academic Press；和NeuromethodsHumana Press，Totowa，NJ中，描述了用于神經(jīng)細(xì)胞生物活性的測(cè)定。例如在Meisami(編輯)Handbook of Human Growth and DevelopmentalBiology CRC Press；和Chrispeels(編輯)Molecular Techniques andApproaches in Developmental Biology Interscience中，描述了發(fā)育系統(tǒng)的方法學(xué)。
在Melamed等(1990)Flow Cytometry and Sorting Wiley-Liss，Inc.，New York，NY；Shapiro(1988)Practical Flow Cytometry Liss，New York，NY；和Robinson等(1993)Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss，New York，NY中，描述了FACS分析。II.人IL-B30的克隆表1提供了該基因的序列。所述序列得自由黑素細(xì)胞、胎心和妊娠子宮制備的cDNA文庫(kù)。從得自胰島的cDNA文庫(kù)序列中也發(fā)現(xiàn)了該序列。這些序列使得可以制備PCR引物或探針，以測(cè)定該基因的細(xì)胞分布。所述序列使得可以分離編碼該信息的基因組DNA。
使用所述探針或PCR引物，可以探測(cè)各種組織或細(xì)胞類型，以確定細(xì)胞分布。用例如TA克隆試劑盒(Invitrogen)克隆PCR產(chǎn)物。在自動(dòng)測(cè)序儀(Applied Biosystems)上，從兩個(gè)末端對(duì)所得的cDNA質(zhì)粒測(cè)序。III.IL-B30的細(xì)胞表達(dá)制備對(duì)編碼靈長(zhǎng)類IL-B30的cDNA特異性的合適探針或引物。通常，例如通過隨機(jī)引物，標(biāo)記該探針。表達(dá)可以在所述的細(xì)胞類型中，也許也在胰島中。DNA分析初次擴(kuò)增的cDNA文庫(kù)的DNA(5μg)用合適的限制性酶消化，以釋放插入片段，在1％瓊脂糖凝膠上電泳，并轉(zhuǎn)移至尼龍膜(Schleicher和Schuell，Keene，NH)上。
用于人mRNA分離的樣品包括外周血單核細(xì)胞(單核細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、粒細(xì)胞、B細(xì)胞)，靜息的(T100)；外周血單核細(xì)胞，用抗CD3激活2、6、12小時(shí)的混合物(pooled)(T101)；T細(xì)胞，TH0克隆Mot 72，靜息的(T102)；T細(xì)胞，TH0克隆Mot 72，用抗CD28和抗CD3激活3、6、12小時(shí)的混合物(T103)；T細(xì)胞，TH0克隆Mot 72，用特定肽無反應(yīng)性處理2、7、12小時(shí)的混合物(T104)；T細(xì)胞，TH1克隆HY06，靜息的(T107)；T細(xì)胞，TH1克隆HY06，用抗CD28和抗CD3激活3、6、12小時(shí)的混合物(T108)；T細(xì)胞，TH1克隆HY06，用特定肽無反應(yīng)性處理2、6、12小時(shí)的混合物(T109)；T細(xì)胞，TH2克隆HY935，靜息的(T110)；T細(xì)胞，TH2克隆HY935，用抗CD28和抗CD3激活2、7、12小時(shí)的混合物(T111)；T細(xì)胞腫瘤系Jurkat和Hut78，靜息的(T117)；T細(xì)胞克隆，混合的AD130.2、Tc783.12、Tc783.13、Tc783.58、Tc782.69，靜息的(T118)；T細(xì)胞隨機(jī)γδT細(xì)胞克隆，靜息的(T119)；CD28-T細(xì)胞克??；脾細(xì)胞，靜息的(B100)；脾細(xì)胞，用抗CD40和IL-4激活的(B101)；B細(xì)胞EBV系，混合的WT49、RSB、JY、CVIR、721.221、RM3、HSY，靜息的(B102)；B細(xì)胞系JY，用PMA和離子霉素激活1、6小時(shí)的混合物(B103)；混合的NK 20克隆，靜息的(K100)；混合的NK20克隆，用PMA和離子霉素激活6小時(shí)(K101)；NKL克隆，得自LGL白血病患者的外周血，IL-2處理的(K106)；造血前體系TF1，用PMA和離子霉素激活1、6小時(shí)的混合物(C100)；U937前單核細(xì)胞系，靜息的(M100)；U937前單核細(xì)胞系，用PMA和離子霉素激活1、6小時(shí)的混合物(M101)；淘析的單核細(xì)胞，用LPS、IFNγ、抗IL-10激活1、2、6、12、24小時(shí)的混合物(M102)；淘析的單核細(xì)胞，用LPS、IFNγ、IL-10激活1、2、6、12、24小時(shí)的混合物(M103)；淘析的單核細(xì)胞，用LPS、IFNγ、抗IL-10激活4、16小時(shí)的混合物(M106)；淘析的單核細(xì)胞，用LPS、IFNγ、IL-10激活4、16小時(shí)的混合物(M107)；淘析的單核細(xì)胞，用LPS激活1小時(shí)(M108)；淘析的單核細(xì)胞，用LPS激活6小時(shí)(M109)；DC 70％CD1a+，來自CD34+GM-CSF、TNFα12天，靜息的(D101)；DC 70％CD1a+，來自CD34+GM-CSF、TNFα12天，用PMA和離子霉素激活1小時(shí)(D102)；DC 70％CD1a+，來自CD34+GM-CSF、TNFα12天，用PMA和離子霉素激活6小時(shí)(D103)；DC 95％CD1a+，來自CD34+GM-CSF、TNFα12天，通過FACS分選，用PMA和離子霉素激活1、6小時(shí)的混合物(D104)；DC 95％ CD14+，來自CD34+GM-CSF、TNFα12天，通過FACS分選，用PMA和離子霉素激活1、6小時(shí)的混合物(D105)；DC CD1a+CD86+，來自CD34+GM-CSF、TNFα12天，通過FACS分選，用PMA和離子霉素激活1、6小時(shí)的混合物(D106)；DC，來自單核細(xì)胞GM-CSF、IL-4 5天，靜息的(D107)；DC，來自單核細(xì)胞GM-CSF、IL-45天，靜息的(D108)；DC，來自單核細(xì)胞GM-CSF、IL-4 5天，用LPS激活4、16小時(shí)的混合物(D109)；DC，來自單核細(xì)胞GM-CSF、IL-45天，用TNFα、單核細(xì)胞上清液(supe)激活4、16小時(shí)的混合物(D110)；上皮細(xì)胞，未刺激的；上皮細(xì)胞，IL-1β激活的；肺成纖維細(xì)胞肉瘤系MRC5，用PMA和離子霉素激活1、6小時(shí)的混合物(C101)；腎上皮癌細(xì)胞系CHA，用PMA和離子霉素激活1、6小時(shí)的混合物(C102)。在淘析的單核細(xì)胞，用LPS、IFNγ、抗IL-10激活4、16小時(shí)的混合物(M106)；淘析的單核細(xì)胞，用LPS、IFNγ、抗IL-10激活1、2、6、12、24小時(shí)的混合物(M102)；淘析的單核細(xì)胞，用LPS激活6小時(shí)(M109)；淘析的單核細(xì)胞，用LPS激活1小時(shí)(M108)中，IL-B30轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)非常高。在DC 95％CD1a+，來自CD34+GM-CSF、TNFα12天，通過FACS分選，用PMA和離子霉素激活1、6小時(shí)的混合物(D104)；和混合的NK20克隆，用PMA和離子霉素激活6小時(shí)(K101)中表達(dá)高。在DC 70％CD1a+，來自CD34+GM-CSF、TNFα12天，用PMA和離子霉素激活6小時(shí)(D103)；DC 70％CD1a+，來自CD34+GM-CSF、TNFα12天，用PMA和離子霉素激活1小時(shí)(D102)；T細(xì)胞，TH1克隆HY06，用特定肽無反應(yīng)性處理2、6、12小時(shí)的混合物(T109)；外周血單核細(xì)胞，用抗CD3激活2、6、12小時(shí)的混合物(T101)；T細(xì)胞，TH0克隆Mot 72，用抗CD28和抗CD3激活3、6、12小時(shí)的混合物(T103)；脾細(xì)胞，用抗CD40和IL-4激活的(B101)；T細(xì)胞，TH0克隆Mot 72，用特定肽無反應(yīng)性處理2、7、12小時(shí)的混合物(T104)；脾細(xì)胞，靜息的(B100)；T細(xì)胞，TH1克隆HY06，用抗CD28和抗CD3激活3、6、12小時(shí)的混合物(T108)；上皮細(xì)胞，IL-1β激活的；淘析的單核細(xì)胞，用LPS、IFNγ、IL-10激活4、16小時(shí)的混合物(M107)；和B細(xì)胞系JY，用PMA和離子霉素激活1、6小時(shí)的混合物(B103)中，檢測(cè)到較低的表達(dá)。在DC，來自單核細(xì)胞GM-CSF、IL-45天，用LPS激活4、16小時(shí)的混合物(D109)；T細(xì)胞，TH0克隆Mot 72，靜息的(T102)；外周血單核細(xì)胞(單核細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、粒細(xì)胞、B細(xì)胞)，靜息的(T100)；T細(xì)胞，在抗CD28、IL-4和抗IFN-γ中極化27天的CD4+CD45RO-T細(xì)胞，極化的TH2，用抗CD3和抗CD28激活4小時(shí)(T116)；T細(xì)胞克隆，混合的AD130.2、Tc783.12、Tc783.13、Tc783.58、Tc782.69，靜息的(T118)；U937前單核細(xì)胞系，靜息的(M100)；造血前體系TF1，用PMA和離子霉素激活1、6小時(shí)的混合物(C100)；T細(xì)胞，TH2克隆HY935，用抗CD28和抗CD3激活2、7、12小時(shí)的混合物(T111)；DC CD1a+CD86+，來自CD34+GM-CSF、TNFα12天，通過FACS分選，用PMA和離子霉素激活1、6小時(shí)的混合物(D106)；淘析的單核細(xì)胞，用LPS、IFNγ、IL-10激活1、2、6、12、24小時(shí)的混合物(M103)；DC，來自單核細(xì)胞GM-CSF、IL-45天，用TNFα、單核細(xì)胞上清液激活4、16小時(shí)的混合物(D110)；DC，來自單核細(xì)胞GM-CSF、IL-45天，靜息的(D108)；U937前單核細(xì)胞系，用PMA和離子霉素激活1、6小時(shí)的混合物(M101)；T細(xì)胞隨機(jī)γδT細(xì)胞克隆，靜息的(T119)；和T細(xì)胞，TH1克隆HY06，用抗CD28和抗CD3激活3、6、12小時(shí)的混合物(T108)中，觀察到可檢測(cè)的表達(dá)。在其它樣品中沒有檢測(cè)到信號(hào)。
總之，分布顯示，IL-B30在活化巨噬細(xì)胞中水平升高，提示在炎癥中的作用；在活化Th1細(xì)胞中水平升高，提示在T輔助細(xì)胞亞群(helper subset)中，特別是在Th1免疫應(yīng)答中有調(diào)節(jié)或效應(yīng)物作用；在活化樹突細(xì)胞中水平升高，提示在抗原提呈或生發(fā)中心T或B細(xì)胞與DC相互作用中的作用。
用于小鼠mRNA分離的樣品可以包括靜息的小鼠成纖維細(xì)胞的L細(xì)胞系(C200)；BrafER(與雌激素受體融合的Braf融合體)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，對(duì)照(C201)；Me114+原初T細(xì)胞，來自脾臟，靜息的(T209)；Me114+T細(xì)胞，來自脾臟，用IFN-γ、IL-12和抗IL-4刺激極化為TH1細(xì)胞，暴露于IFN-γ和IL-46、12、24小時(shí)的混合物(T210)；Me114+原初T細(xì)胞，來自脾臟，用IL-4和抗IFN-γ刺激極化為Th2細(xì)胞，暴露于IL-4和抗IFN-γ6、13、24小時(shí)的混合物(T211)；T細(xì)胞，極化的TH1(Me114 bright，來自脾臟的CD4+細(xì)胞，用IFN-γ和抗IL-4極化7天；T200)；T細(xì)胞，極化的TH2(Me114 bright，來自脾臟的CD4+細(xì)胞，用IL-4和抗IFN-γ極化7天；T201)；T細(xì)胞，高度極化3x的TH1，來自轉(zhuǎn)基因Balb/c(參見Openshaw等(1995)J.Exp.Med.1821357-1367；用抗CD3激活2、6、16小時(shí)的混合物；T202)；T細(xì)胞，高度極化3x的TH2，來自轉(zhuǎn)基因Balb/c(用抗CD3激活2、6、24小時(shí)的混合物；T203)；T細(xì)胞，高度極化3x的TH1，來自轉(zhuǎn)基因C57 bl/6(用抗CD3激活2、6、24小時(shí)的混合物；T212)；T細(xì)胞，高度極化3x的TH2，來自轉(zhuǎn)基因C57 bl/6(用抗CD3激活2、6、24小時(shí)的混合物；T213)；T細(xì)胞，高度極化的TH1(來自轉(zhuǎn)基因Balb/c的原初CD4+T細(xì)胞，用IFN-γ、IL-12和抗IL-4極化3x；用IGIF、IL-12和抗IL-4刺激6、12、24小時(shí)的混合物)；CD44-CD25+前T細(xì)胞，從胸腺分選的(T204)；TH1 T細(xì)胞克隆D1.1，用抗原最后一次刺激后靜息3周(T205)；TH1 T細(xì)胞克隆D1.1，10μg/ml ConA激活15小時(shí)(T206)；TH2 T細(xì)胞克隆CDC35，用抗原最后一次刺激后靜息3周(T207)；TH2 T細(xì)胞克隆CDC35，10μg/ml ConA激活15小時(shí)(T208)；未刺激的B細(xì)胞系CH12(B201)；未刺激的成熟B細(xì)胞白血病細(xì)胞系A(chǔ)20(B200)；來自脾臟的未刺激的大B細(xì)胞(B202)；來自全脾的B細(xì)胞，LPS激活(B203)；來自脾臟的三碘苯甲酰氨基葡萄糖富集的樹突細(xì)胞，靜息的(D200)；來自骨髓的樹突細(xì)胞，靜息的(D201)；未刺激骨髓源性樹突細(xì)胞，用抗B220、抗CD3和抗II類排除(deplete)，在GM-CSF和IL-4中培養(yǎng)的(D202)；骨髓源性樹突細(xì)胞，用抗B220、抗CD3和抗II類排除，在GM-CSF和IL-4中培養(yǎng)，用抗CD40刺激1、5天的混合物(D203)；單核細(xì)胞細(xì)胞系RAW 264.7，用LPS激活4小時(shí)(M200)；骨髓巨噬細(xì)胞，用GM和M-CSF衍生的(M201)；骨髓巨噬細(xì)胞，用GM-CSF衍生，用LPS、IFNγ和抗IL-10刺激24小時(shí)(M205)；骨髓巨噬細(xì)胞，用GM-CSF衍生，用LPS、IFNγ和抗IL-10刺激24小時(shí)(M206)；腹膜巨噬細(xì)胞(M207)；巨噬細(xì)胞系J774，靜息的(M202)；于0.5、1、3、6、12小時(shí)混合的巨噬細(xì)胞系J774+LPS+抗IL-10(M203)；于0.5、1、3、5、12小時(shí)混合的巨噬細(xì)胞系J774+LPS+IL-10(M204)；未刺激的肥大細(xì)胞系MC-9和MCP-12(M208)；得自腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的無限增殖化內(nèi)皮細(xì)胞系，未刺激的(E200)；得自腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的無限增殖化內(nèi)皮細(xì)胞系，用TNFα刺激過夜(E201)；得自腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的無限增殖化內(nèi)皮細(xì)胞系，用TNFα刺激過夜(E202)；得自腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的無限增殖化內(nèi)皮細(xì)胞系，用TNFα和IL-10刺激過夜(E203)；來自wt C57bl/6小鼠的全主動(dòng)脈；來自5月齡ApoE KO小鼠的全主動(dòng)脈(X207)；來自12月齡ApoE KO小鼠的全主動(dòng)脈(X207)；wt胸腺(O214)；全胸腺，rag-1(O208)；全腎臟，rag-1(O209)；全腎臟，NZ B/W小鼠；和全心臟，rag-1(O202)。在單核細(xì)胞細(xì)胞系RAW 264.7，用LPS激活4小時(shí)(M200)；T細(xì)胞，高度極化3x的TH1，來自轉(zhuǎn)基因C57 bl/6(用抗CD3激活2、6、24小時(shí)的混合物；T212)；和T細(xì)胞，高度極化的TH1(來自轉(zhuǎn)基因Balb/c的原初CD4+T細(xì)胞，用IFN-γ、IL-12和抗IL-4極化3x；用IGIF、IL-12和抗IL-4刺激6、12、24小時(shí)的混合物)中，檢測(cè)到高信號(hào)。在T細(xì)胞，高度極化3x的TH1，來自轉(zhuǎn)基因Balb/c(參見Openshaw等(1995)J.Exp.Med.1821357-1367；用抗CD3激活2、6、16小時(shí)的混合物；T202)；T細(xì)胞，極化的TH2(Me114 bright，來自脾臟的CD4+細(xì)胞，用IL-4和抗IFN-γ極化7天；T201)；T細(xì)胞，極化的TH1(Me114 bright，來自脾臟的CD4+細(xì)胞，用IFN-γ和抗IL-4極化7天；T200)；于0.5、1、3、6、12小時(shí)混合的巨噬細(xì)胞系J774+LPS+抗IL-10(M203)；巨噬細(xì)胞系J774，靜息的(M202)；于0.5、1、3、5、12小時(shí)混合的巨噬細(xì)胞系J774+LPS+IL-10(M204)；得自腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的無限增殖化內(nèi)皮細(xì)胞系，周TNFα刺激過夜(E201)；和骨髓巨噬細(xì)胞，用GM-CSF衍生，用LPS、IFN-γ和抗IL-10刺激24小時(shí)(M206)中檢測(cè)到可檢測(cè)信號(hào)。其它樣品未顯示信號(hào)。在RAW 264.7小鼠單核細(xì)胞系中的表達(dá)提示一種天然蛋白源。IV.IL-B30的染色體作圖使用編碼所述IL-B30的分離的cDNA。染色體作圖是一種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。參見例如BIOS Laboratories(New Haven，CT)和采用小鼠體細(xì)胞雜種庫(kù)和PCR的方法。間接證據(jù)表明，小鼠IL-B30基因作圖至染色體10。V.IL-B30蛋白的純化對(duì)多個(gè)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系篩選以高于其它細(xì)胞的水平表達(dá)該細(xì)胞因子的細(xì)胞系。篩選各種細(xì)胞系，在處理中選擇其合適的特性。天然IL-B30可以從天然來源分離，或采用合適的表達(dá)載體通過表達(dá)從轉(zhuǎn)化細(xì)胞中分離。用標(biāo)準(zhǔn)方法可以達(dá)到所表達(dá)蛋白的純化，或可以結(jié)合工程改造方法，以高效率從細(xì)胞裂解液或上清液中有效地純化所表達(dá)的蛋白。對(duì)于這類純化特征可以使用FLAG或His6區(qū)段?；蛘?，可以用特異性抗體，使用親和層析，參見下文。
根據(jù)需要，在大腸桿菌(coli)、昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生蛋白質(zhì)。VI.同源IL-B30基因的分離所述IL-B30 cDNA或其它物種對(duì)應(yīng)序列可以用作雜交探針，以從所需來源(例如靈長(zhǎng)類細(xì)胞cDNA文庫(kù))篩選文庫(kù)。可以采用探針，對(duì)許多不同的物種篩選易于雜交必需的嚴(yán)格性和存在。合適的雜交條件將用來篩選表達(dá)交叉雜交特異性的克隆。
采用基于所述肽序列的簡(jiǎn)并探針通過雜交篩選，也使得可以分離合適的克隆?；蛘?，使用合適的PCR篩選引物，將產(chǎn)生合適核酸克隆的富集。
相似的方法可應(yīng)用于分離或者物種變異體、多態(tài)變異體或者等位基因變異體。根據(jù)作為探針的來自一個(gè)物種的全長(zhǎng)分離物或片段的分離，采用交叉物種雜交技術(shù)，可以分離物種變異體。
或者，針對(duì)人IL-B30產(chǎn)生的抗體用來從合適的例如cDNA文庫(kù)中篩選表達(dá)交叉反應(yīng)性蛋白的細(xì)胞。純化的蛋白和限定的肽可用來通過如上所述的標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生抗體。將合成肽或純化蛋白提呈給免疫系統(tǒng)，以產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體。參見例如Coligan(1991)CurrentProtocols in Immunology Wiley/Greene；和Harlow和Lane(1989)AntibodiesA Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press。所得的抗體用于如上所述的篩選、純化或診斷。VII.IL-B30特異性抗體的制備將合成肽或純化蛋白提呈給免疫系統(tǒng)，以產(chǎn)生單克隆或多克隆抗體。參見例如Coligan(1991)Current Protocols in ImmunologyWiley/Greene；和Harlow和Lane(1989)AntibodiesA LaboratoryManual Cold Spring Harbor Press?？梢灾苽涠嗫寺⊙寤螂s交瘤。在合適的情況下，所述結(jié)合試劑或者如上所述進(jìn)行標(biāo)記，例如熒光標(biāo)記，或者固定化至基質(zhì)上用于淘選法。免疫選擇和相關(guān)技術(shù)可用來根據(jù)需要制備選擇性試劑。VIII.生物學(xué)功能廣度的評(píng)估根據(jù)IL-B30和IL-6和G-CSF之間序列同源性和結(jié)構(gòu)同源性，測(cè)試IL-B30的生物活性。最初，檢查已經(jīng)顯示IL-6或G-CSF生物活性的測(cè)定。A.對(duì)細(xì)胞增殖的效應(yīng)用不同濃度的細(xì)胞因子，評(píng)估對(duì)各種細(xì)胞類型增殖的效應(yīng)。結(jié)合相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、G-CSF等進(jìn)行劑量效應(yīng)分析。B.對(duì)人單核細(xì)胞上細(xì)胞表面分子表達(dá)的效應(yīng)通過負(fù)選擇，從正常健康供體的外周血單核細(xì)胞純化單核細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，將3×108ficoll帶的單核細(xì)胞與單克隆抗體混合物(Becton-Dickinson；Mountain View，CA)在冰上孵育，所述單克隆抗體混合物包含例如200μlαCD2(Leu-5A)、200μlαCD3(Leu-4)、100μlαCD8(Leu 2a)、100μlαCD19(Leu-12)、100μlαCD20(Leu-16)、100μlαCD56(Leu-19)、100μlαCD67(IOM 67；Immnotech，Westbrook，ME)和抗血型糖蛋白抗體(10F7MN，ATCC，Rockville，MD)。洗滌抗體結(jié)合細(xì)胞，然后與羊抗小鼠IgG偶聯(lián)的磁性珠粒(Dynal，Oslo，挪威)一起溫育，珠粒與細(xì)胞之比為20∶1。通過施加磁場(chǎng)，從單核細(xì)胞中分離抗體結(jié)合細(xì)胞。隨后，在缺乏或存在IL-B30、IL-6、G-CSF或組合物的情況下，在含1％人AB血清的Yssel氏培養(yǎng)基(Gemini Bioproducts，Calabasas，CA)中培養(yǎng)人單核細(xì)胞。
通過直接免疫熒光，可以進(jìn)行細(xì)胞表面分子表達(dá)的分析。例如，將2×105純化的人單核細(xì)胞在含1％人血清的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中在冰上孵育20分鐘。以200×g沉淀細(xì)胞。將細(xì)胞再懸浮于20ml PE或FITC標(biāo)記的mAb中。于冰上再孵育20分鐘后，細(xì)胞在含1％人血清的PBS中洗滌，然后在單獨(dú)的PBS中洗滌2次。將細(xì)胞在含1％低聚甲醛的PBS中固定，并在FACScan流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson；Mountain View，CA)上進(jìn)行分析。使用典型的mAb，例如得自Becton-Dickinson的CD11b(抗mac1)、CD11c(gp150/95)、CD14(Leu-M3)、CD-54(Leu 54)、CD80(抗BB1/B7)、HLA-DR(L243)和CD86(FUN 1；Pharmingen)、CD64(32.2；Medarex)、CD40(mAb89；Schering-Plough法國(guó))。C.IL-B30對(duì)人單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的效應(yīng)如上所述分離人單核細(xì)胞，并在缺乏或存在IL-B30(1/100稀釋液，桿狀病毒表達(dá)的物質(zhì))的情況下，在含1％人AB血清Yssel氏培養(yǎng)基(Gemini Bioproducts，Calabasas，CA)中培養(yǎng)。另外，在缺乏或存在IL-B30的情況下，用LPS(大腸桿菌0127B8 Difco)刺激單核細(xì)胞，并通過ELISA測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、TNFα、GM-CSF和IL-10)的濃度。
對(duì)于細(xì)胞因子的胞質(zhì)內(nèi)染色，在缺乏和存在IL-B30和LPS(大腸桿菌0127B8 Difco)和10mg/ml布雷菲德菌素A(Epicentre technologiesMadison WI)的情況下，在Yssel氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)(1×106/ml)單核細(xì)胞12小時(shí)。在PBS中洗滌細(xì)胞，并在2％甲醛/PBS溶液中于室溫下孵育20分鐘。隨后將細(xì)胞洗滌，再懸浮于透化緩沖液(0.5％皂苷(Sigma)的PBS/BSA(0.5％)/疊氮化物(1mM)溶液)中，于室溫下孵育20分鐘。將細(xì)胞(2×105)離心，于室溫下再懸浮于20ml直接綴合的抗細(xì)胞因子mAb中20分鐘，所述mAb以1∶10在透化緩沖液中稀釋?？梢允褂靡韵驴贵wIL-1α-PE(364-3B3-14)；IL-6-PE(MQ2-13A5)；TNFα-PE(Mab11)；GM-CSF-PE(BVD2-21C11)；和IL-12-PE(C11.5.14；Pharmingen San Diego，CA)。隨后，將細(xì)胞在透化緩沖液中洗滌2次，在PBS/BSA/疊氮化物中洗滌1次，并在FACScan流式細(xì)胞儀(BectonDickinson；Mountain View，CA)上進(jìn)行分析。D.IL-B30對(duì)人外周血單核細(xì)胞(PBMC)增殖的效應(yīng)如所述(Boyum等)，通過Ficoll-hypaque離心，從正常健康供體的淺黃色層分離總PBMC。在缺乏或存在IL-B30的情況下，將PBMC在96孔板(Falcon，Becton-Dickinson，NJ)中的200μl含1％人AB血清的Yssel氏培養(yǎng)基(Gemini Bioproducts，Calabasas，CA)中培養(yǎng)。將細(xì)胞在單獨(dú)的培養(yǎng)基中或結(jié)合100 U/ml IL-2(R & D Systems)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)120小時(shí)。在培養(yǎng)的最后6小時(shí)期間，3H-胸苷，通過液閃計(jì)數(shù)測(cè)定3H-胸苷的摻入。
可以在許多其它生物測(cè)定系統(tǒng)中，例如在T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、造血祖細(xì)胞等上，測(cè)試所述天然、重組和融合蛋白的激動(dòng)劑或拮抗劑活性。因?yàn)镮L-6和G-CSF的結(jié)構(gòu)關(guān)系，應(yīng)該分析與那些活性相關(guān)的測(cè)定。
在表達(dá)IL-6或G-CSF受體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞和對(duì)照上，評(píng)估IL-B30的激動(dòng)劑或拮抗劑活性。參見例如Ho等(1993)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA90，11267-11271；Ho等(1995)Mol.Cell Biol.155043-5053；和Liu等(1994)J Immunol.1521821-1829。
評(píng)估IL-B30在對(duì)抗原或同種異型刺激物應(yīng)答的巨噬細(xì)胞/樹突細(xì)胞活化和抗原提呈測(cè)定、T細(xì)胞細(xì)胞因子產(chǎn)生和增殖方面的效應(yīng)。參見例如De Waal Malefyt等(1991)J.Exp.Med.1741209-1220；de waalMalefyt等(1991)J.Exp.Med.174915-924；Fiorentino等(1991)J.Immunol.147，3815-3822；Fiorentino等(1991)J.Immunol.1463444-3451；和Groux等(1996)J.Exp.Med.18419-29。
也將評(píng)估IL-B30對(duì)NK細(xì)胞刺激的效應(yīng)。測(cè)定可以基于例如Hsu等(1992)Internat.Immunol.4563-569；和Schwarz等(1994)J.Immumother.1695-104。
將例如通過在Defrance等(1 992)J.Exp.Med.175671-682；Rousset等(1992)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 891890-1893中描述的方法，包括IgG2和IgA2開關(guān)因子測(cè)定，分析B細(xì)胞生長(zhǎng)和分化效應(yīng)。IX.遺傳改變動(dòng)物的產(chǎn)生和分析通過標(biāo)準(zhǔn)方法可產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。這種動(dòng)物可用來測(cè)定在特定組織或在整個(gè)所述生物中該基因缺乏的效應(yīng)。這種動(dòng)物可以提供對(duì)該動(dòng)物或特定組織在各個(gè)階段中發(fā)育的有趣的了解。此外，可以評(píng)估對(duì)生物脅迫各種反應(yīng)的效應(yīng)。參見例如Hogan等(1995)Manipulating theMouse EmbryoA Laboratory Manual(第2版)Cold Spring HarborLaboratory Press。
已經(jīng)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因小鼠，盡管所述動(dòng)物看來經(jīng)受得住出生，但不能健康成長(zhǎng)，通常在數(shù)周內(nèi)死亡。所述構(gòu)成物基于具有CMV增強(qiáng)子的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子應(yīng)該導(dǎo)致寬范圍的表達(dá)和高表達(dá)。象IL-6轉(zhuǎn)基因小鼠的小鼠發(fā)育不良。此外，它們表現(xiàn)出腹?jié)q、胃和腸有炎癥、細(xì)胞浸潤(rùn)到肝臟中，通常在第50天之前死亡。這些小鼠不能生育。第二亞組的轉(zhuǎn)基因小鼠的表型嚴(yán)重性較低，正在試圖繁殖它們。
已經(jīng)測(cè)定了小鼠IL-B30的基因組結(jié)構(gòu)。已經(jīng)開發(fā)出產(chǎn)生IL-B30失效小鼠的策略，并已經(jīng)開始構(gòu)建。
本文引用的所有參考文獻(xiàn)均通過引用結(jié)合到本文中，對(duì)于所有的目的，其程度與具體和單獨(dú)地表明每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)通過引用結(jié)合到本文中的程度一樣。
可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行許多修改和變化，而不偏離本發(fā)明的精神和范圍，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。提供本文描述的具體實(shí)施方案僅僅是舉例說明，本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求書的條款以及這些權(quán)利要求賦予的相當(dāng)物的全部范圍的限制。
序列表SEQ ID NO1為靈長(zhǎng)類IL-B30天然核酸序列。SEQ ID NO2為靈長(zhǎng)類IL-B30天然氨基酸序列。SEQ ID NO3為嚙齒動(dòng)物IL-B30天然核酸序列。SEQ ID NO4為嚙齒動(dòng)物IL-B30天然氨基酸序列。SEQ ID NO5為豬IL-B30.SEQ ID NO6為牛G-CSF.SEQ ID NO7為貓G-CSF.SEQ ID NO8為人G-CSF.SEQ ID NO9為小鼠G-CSF.SEQ ID NO10為水獺IL-6.SEQ ID NO11為貓IL-6.SEQ ID NO12為人IL-6.SEQ ID NO13為綿羊IL-6.SEQ ID NO14為小鼠IL-6.SEQ ID NO15為雞MGF.SEQ ID NO16為KSHV(卡波西肉瘤皰疹病毒)的病毒IL-6.(1)一般資料(i)申請(qǐng)人Schering Corporation(ii)發(fā)明名稱哺乳動(dòng)物細(xì)胞因子；相關(guān)試劑(iii)序列數(shù)16(iv)通信地址(A)收信人Schering Corporation(B)街道2000 Galloping Hill Road(C)城市Kenilworth(D)州New Jersey(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼07033-0530(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)Power Macintosh 7600/120(C)操作系統(tǒng)Windows(D)軟件MS Word(vi)當(dāng)前申請(qǐng)資料
(A)申請(qǐng)?zhí)?B)中請(qǐng)日1998年7月24日(C)分類(vii)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/900,905(B)申請(qǐng)日1997年7月25日(viii)代理律師/代理人資料(A)姓名Thampoe，Immac J.
(B)注冊(cè)號(hào)36,322(C)參考/檔案號(hào)DX0758K1(ix)電信信息(A)電話(908)298-5061(B)傳真(908)298-5388(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度570個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..567(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞成熟肽(B)位置64..567(xi)序列描述SEQ ID NO1ATG CTG GGG AGC AGA GCT GTA ATG CTG CTG TTG CTG CTG CCC TGG ACA48Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr-21 -20 -15 -10GCT CAG GGC AGA GCT GTG CCT GGG GGC AGC AGC CCT GCC TGG ACT CAG96Ala Gln Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln-5 1 5 10TGC CAG CAG CTT TCA CAG AAG CTC TGC ACA CTG GCC TGG AGT GCA CAT 144Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His15 20 25CCA CTA GTG GGA CAC ATG GAT CTA AGA GAA GAG GGA GAT GAA GAG ACT 192Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr30 35 40ACA AAT GAT GTT CCC CAT ATC CAG TGT GGA GAT GGC TGT GAC CCC CAA 240Thr Asn Asp Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln45 50 55GGA CTC AGG GAC AAC AGT CAG TTC TGC TTG CAA AGG ATC CAC CAG GGT 288Gly Leu Arg Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly60 65 70 75CTG ATT TTT TAT GAG AAG CTG CTA GGA TCG GAT ATT TTC ACA GGG GAG 336Leu Ile Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu80 85 90CCT TCT CTG CTC CCT GAT AGC CCT GTG GCG CAG CTT CAT GCC TCC CTA 384Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala Gln Leu His Ala Ser Leu95 100 105CTG GGC CTC AGC CAA CTC CTG CAG CCT GAG GGT CAC CAC TGG GAG ACT 432Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr110 115 120CAG CAG ATT CCA AGC CTC AGT CCC AGC CAG CCA TGG CAG CGT CTC CTT 480Gln Gln Ile Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu125 130 135CTC CGC TTC AAA ATC CTT CGC AGC CTC CAG GCC TTT GTG GCT GTA GCC 528Leu Arg Phe Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala140 145 150 155GCC CGG GTC TTT GCC CAT GGA GCA GCA ACC CTG AGT CCC TAA 570Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro
160 165(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度189個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr-21 -20 -15 -10Ala Gln Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln-5 1 5 10Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His15 20 25Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr30 35 40Thr Asn Asp Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln45 50 55Gly Leu Arg Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly60 65 70 75Leu Ile Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu80 85 90Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Ala Gln Leu His Ala Ser Leu95 100 105Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr110 115 120Gln Gln Ile Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu125 130 135Leu Arg Phe Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala140 145 150 155Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro160 165(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1203個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置113..700(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞成熟肽(B)位置176..700(xi)序列描述SEQ ID NO3CGCTTAGAAG TCGGACTACA GAGTTAGACT CAGAACCAAA GGAGGTGGAT AGGGGGTCCA 60CAGGCCTGGT GCAGATCACA GAGCCAGCCA GATCTGAGAA GCAGGGAACA AG ATG115Met-21CTG GAT TGC AGA GCA GTA ATA ATG CTA TGG CTG TTG CCC TGG GTC ACT 163Leu Asp Cys Arg Ala Val Ile Met Leu Trp Leu Leu Pro Trp Val Thr-20 -15 -10 -5CAG GGC CTG GCT GTG CCT AGG AGT AGC AGT CCT GAC TGG GCT CAG TGC 211Gln Gly Leu Ala Val Pro Arg Ser Ser Ser Pro Asp Trp Ala Gln Cys1 5 10CAG CAG CTC TCT CGG AAT CTC TGC ATG CTA GCC TGG AAC GCA CAT GCA 259Gln Gln Leu Ser Arg Asn Leu Cys Met Leu Ala Trp Asn Ala His Ala15 20 25CCA GCG GGA CAT ATG AAT CTA CTA AGA GAA GAA GAG GAT GAA GAG ACT 307Pro Ala Gly His Met Asn Leu Leu Arg Glu Glu Glu Asp Glu Glu Thr30 35 40AAA AAT AAT GTG CCC CGT ATC CAG TGT GAA GAT GGT TGT GAC CCA CAA 355Lys Asn Asn Val Pro Arg Ile Gln Cys Glu Asp Gly Cys Asp Pro Gln45 50 55 60GGA CTC AAG GAC AAC AGC CAG TTC TGC TTG CAA AGG ATC CGC CAA GGT 403Gly Leu Lys Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile Arg Gln Gly65 70 75CTG GCT TTT TAT AAG CAC CTG CTT GAC TCT GAC ATC TTC AAA GGG GAG 451Leu Ala Phe Tyr Lys His Leu Leu Asp Ser Asp Ile Phe Lys Gly Glu80 85 90CCT GCT CTA CTC CCT GAT AGC CCC ATG GAG CAA CTT CAC ACC TCC CTA 499Pro Ala Leu Leu Pro Asp Ser Pro Met Glu Gln Leu His Thr Ser Leu95 100 105CTA GGA CTC AGC CAA CTC CTC CAG CCA GAG GAT CAC CCC CGG GAG ACC 547Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Asp His Pro Arg Glu Thr110 115 120CAA CAG ATG CCC AGC CTG AGT TCT AGT CAG CAG TGG CAG CGC CCC CTT 595Gln Gln Met Pro Ser Leu Ser Ser Ser Gln Gln Trp Gln Arg Pro Leu125 130 135 140CTC CGT TCC AAG ATC CTT CGA AGC CTC CAG GCC TTT TTG GCC ATA GCT 643Leu Arg Ser Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Leu Ala Ile Ala145 150 155GCC CGG GTC TTT GCC CAC GGA GCA GCA ACT CTG ACT GAG CCC TTA GTG 691Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Thr Glu Pro Leu Val160 165 170CCA ACA GCT TAAGGATGCC CAGGTTCCCA TGGCTACCAT GATAAGACTA 740Pro Thr Ala175ATCTATCAGC CCAGACATCT ACCAGTTAAT TAACCCATTA GGACTTGTGC TGTTCTTGTT 800TCGTTTGTTT TGCGTGAAGG GCAAGGACAC CATTATTAAA GAGAAAAGAA ACAAACCCCA 860GAGCAGGCAG CTGGCTAGAG AAAGGAGCTG GAGAAGAAGA ATAAAGTCTC GAGCCCTTGG 920CCTTGGAAGC GGGCAAGCAG CTGCGTGGCC TGAGGGGAAG GGGGCGGTGG CATCGAGAAA 980CTGTGAGAAA ACCCAGAGCA TCAGAAAAAG TGAGCCCAGG CTTTGGCCAT TATCTGTAAG1040AAAAACAAGA AAAGGGGAAC ATTATACTTT CCTGGGTGGC TCAGGGAAAT GTGCAGATGC1100ACAGTACTCC AGACAGCAGC TCTGTACCTG CCTGCTCTGT CCCTCAGTTC TAACAGAATC1160TAGTCACTAA GAACTAACAG GACTACCAAT ACGAACTGAC AAA 1203(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度196個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Leu Asp Cys Arg Ala Val Ile Met Leu Trp Leu Leu Pro Trp Val-21 -20 -15 -10Thr Gln Gly Leu Ala Val Pro Arg Ser Ser Ser Pro Asp Trp Ala Gln-5 1 5 10Cys Gln Gln Leu Ser Arg Asn Leu Cys Met Leu Ala Trp Asn Ala His15 20 25Ala Pro Ala Gly His Met Asn Leu Leu Arg Glu Glu Glu Asp Glu Glu30 35 40Thr Lys Asn Asn Val Pro Arg Ile Gln Cys Glu Asp Gly Cys Asp Pro45 50 55Gln Gly Leu Lys Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile Arg Gln60 65 70 75Gly Leu Ala Phe Tyr Lys His Leu Leu Asp Ser Asp Ile Phe Lys Gly80 85 90Glu Pro Ala Leu Leu Pro Asp Ser Pro Met Glu Gln Leu His Thr Ser95 100 105Leu Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Asp His Pro Arg Glu110 115 120Thr Gln Gln Met Pro Ser Leu Ser Ser Ser Gln Gln Trp Gln Arg Pro125 130 135Leu Leu Arg Ser Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Leu Ala Ile140 145 150 155Ala Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Thr Glu Pro Leu160 165 170Val Pro Thr Ala175(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度102個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型不適用(not relevant)(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO5Ser Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly Leu Val Phe Tyr Glu Lys Leu1 5 10 15Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu Pro Ser Leu His Pro Asp Gly20 25 30Ser Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu Leu Gly Leu Arg Gln Leu Leu35 40 45Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr Glu Gln Thr Pro Ser Pro Ser50 55 60Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu Leu Arg Leu Lys Ile Leu Arg65 70 75 80Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala Ala Arg Val Phe Ala His Gly85 90 95Ala Ala Thr Leu Ser Gln100(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度174個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型不適用(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO6Thr Pro Leu Gly Pro Ala Arg Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala Asp Gly Ala Glu Leu Gln20 25 30Glu Arg Leu Cys Ala Ala His Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Met35 40 45Leu Leu Arg His Ser Leu Gly Ile Pro Gln Ala Pro Leu Ser Ser Cys
50 55 60Ser Ser Gln Ser Leu Gln Leu Arg Gly Cys Leu Asn Gln Leu His Gly65 70 75 80Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile Ser85 90 95Pro Glu Leu Ala Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Thr Asp100 105 110Phe Ala Thr Asn Ile Trp Leu Gln Met Glu Asp Leu Gly Ala Ala Pro115 120 125Ala Val Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Thr Phe Thr Ser Ala Phe130 135 140Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser Gln Leu His Arg Phe145 150 155 160Leu Glu Leu Ala Tyr Arg Gly Leu Arg Tyr Leu Ala Glu Pro165 170(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度174個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型不適用(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO7Thr Pro Leu Gly Pro Thr Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Val Gln Ala Asp Gly Thr Ala Leu Gln20 25 30Glu Arg Leu Cys Ala Ala His Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val35 40 45Leu Leu Gly His Ala Leu Gly Ile Pro Gln Ala Pro Leu Ser Ser Cys50 55 60Ser Ser Gln Ala Leu Gln Leu Thr Gly Cys Leu Arg Gln Leu His Ser65 70 75 80Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Ala Gly Ile Ser85 90 95Pro Glu Leu Ala Pro Thr Leu Asp Met Leu Gln Leu Asp Ile Thr Asp100 105 110Phe Ala Ile Asn Ile Trp Gln Gln Met Glu Asp Val Gly Met Ala Pro115 120 125Ala Val Pro Pro Thr Gln Gly Thr Met Pro Thr Phe Thr Ser Ala Phe130 135 140Gln Arg Arg Ala Gly Gly Thr Leu Val Ala Ser Asn Leu Gln Ser Phe145 150 155 160Leu Glu Val Ala Tyr Arg Ala Leu Arg His Phe Thr Lys Pro165 170(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度177個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型不適用(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO8Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30Glu Lys Leu Val Ser Glu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu35 40 45Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu50 55 60Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln65 70 75 80Leu His Ser Gly Leu Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala85 90 95Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu100 105 110Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu115 120 125Arg His Leu Ala Gln Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu130 135 140Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp145 150 155 160Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly165 170 175Pro(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度178個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型不適用(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO9Val Pro Leu Val Thr Val Ser Ala Leu Pro Pro Ser Leu Pro Leu Pro1 5 10 15Arg Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Ala20 25 30Ser Gly Ser Val Leu Leu Glu Gln Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys35 40 45His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Lys50 55 60Ala Ser Leu Ser Gly Cys Ser Ser Gln Ala Leu Gln Gln Thr Gln Cys65 70 75 80Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Cys Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln85 90 95Ala Leu Ser Gly Ile Ser Pro Ala Leu Ala Pro Thr Leu Asp Leu Leu100 105 110Gln Leu Asp Val Ala Asn Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu115 120 125Asn Leu Gly Val Ala Pro Thr Val Gln Pro Thr Gln Ser Ala Met Pro130 135 140Ala Phe Thr Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Ala Ile145 150 155 160Ser Tyr Leu Gln Gly Phe Leu Glu Thr Ala Arg Leu Ala Leu His His165 170 175Leu Ala(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度186個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型不適用(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO10Ala Phe Pro Thr Pro Gly Pro Leu Gly Gly Asp Ser Lys Asp Asp Ala1 5 10 15Thr Ser Asn Arg Pro Pro Leu Thr Ser Ala Asp Lys Met Glu Asp Phe20 25 30Ile Lys Phe Ile Leu Gly Lys Ile Ser Ala Leu Arg Asn Glu Met Cys35 40 45Asp Lys Tyr Asn Lys Cys Glu Asp Ser Lys Glu Val Leu Ala Glu Asn50 55 60Asn Leu Asn Leu Pro Lys Leu Ala Glu Lys Asp Arg Cys Phe Gln Ser65 70 75 80Arg Phe Asn Gln Glu Thr Cys Leu Thr Arg Ile Thr Thr Gly Leu Gln85 90 95Glu Phe Gln Ile His Leu Lys Tyr Leu Glu Ser Asn Tyr Glu Gly Asn100 105 110Lys Asp Asn Ala His Ser Val Tyr Ile Ser Thr Lys His Leu Leu Gln115 120 125Thr Leu Arg Pro Met Asn Gln Ile Glu Val Thr Thr Pro Asp Pro Thr130 135 140Thr Asp Ala Ser Leu Gln Ala Leu Phe Lys Ser Gln Asp Lys Trp Leu145 150 155 160Lys His Thr Thr Ile His Leu Ile Leu Arg Arg Leu Glu Asp Phe Leu165 170 175Gln Phe Ser Leu Arg Ala Ile Arg Ile Met180 185(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度183個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型不適用(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO11Ala Phe Pro Thr Pro Gly Pro Leu Gly Gly Asp Ala Thr Ser Asn Arg1 5 10 15Leu Pro Leu Thr Pro Ala Asp Lys Met Glu Glu Leu Ile Lys Tyr Ile20 25 30Leu Gly Lys Ile Ser Ala Leu Lys Lys Glu Met Cys Asp Asn Tyr Asn35 40 45Lys Cys Glu Asp Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu50 55 60Pro Lys Leu Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Gln65 70 75 80Glu Thr Cys Leu Thr Arg Ile Thr Thr Gly Leu Gln Glu Phe Gln Ile85 90 95Tyr Leu Lys Phe Leu Gln Asp Lys Tyr Glu Gly Asp Lys Glu Asn Ala
100 105 110Lys Ser Val Tyr Thr Ser Thr Asn Val Leu Leu Gln Met Leu Lys Arg115 120 125Lys Gly Lys Asn Gln Asp Glu Val Thr Ile Pro Val Pro Thr Val Glu130 135 140Val Gly Leu Gln Leu Ser Cys Ser His Arg Arg Val Ala Glu Ala His145 150 155 160Asn Asn His Leu Thr Leu Arg Arg Leu Glu Asp Phe Leu Gln Leu Arg165 170 175Leu Arg Ala Val Arg Ile Met180(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度188個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO12Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala1 5 10 15Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln20 25 30Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys35 40 45Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn50 55 60Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser65 70 75 80Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu85 90 95Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser100 105 110Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln115 120 125Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp130 135 140Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln145 150 155 160Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu165 170 175Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met180 185(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度184個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型不適用(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO13Ala Phe Pro Thr Pro Gly Pro Leu Gly Glu Asp Phe Lys Asn Asp Thr1 5 10 15Thr Pro Ser Arg Leu Leu Leu Thr Thr Pro Glu Lys Thr Glu Ala Leu20 25 30Ile Lys His Ile Val Asp Lys Ile Ser Ala Ile Arg Lys Glu Ile Cys35 40 45Glu Lys Asn Asp Glu Cys Glu Asn Ser Lys Glu Thr Leu Ala Glu Asn50 55 60Lys Leu Lys Leu Pro Lys Met Glu Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser65 70 75 80Gly Phe Asn Gln Ala Ile Cys Leu Ile Lys Thr Thr Ala Gly Leu Leu85 90 95Glu Tyr Gln Ile Tyr Leu Asp Phe Leu Gln Asn Glu Phe Glu Gly Asn100 105 110Gln Glu Thr Val Met Glu Leu Gln Ser Ser Ile Arg Thr Leu Ile Gln115 120 125Ile Leu Lys Glu Lys Ile Ala Gly Leu Ile Thr Thr Pro Ala Thr His130 135 140Thr Asp Met Leu Glu Lys Met Gln Ser Ser Asn Glu Trp Val Lys Asn145 150 155 160Ala Lys Val Ile Ile Ile Leu Arg Ser Leu Glu Asn Phe Leu Gln Phe165 170 175Ser Leu Arg Ala Ile Arg Met Lys180(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度188個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型不適用(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO14Ala Phe Pro Thr Ser Gln Val Arg Arg Gly Asp Phe Thr Glu Asp Thr1 5 10 15Thr Pro Asn Arg Pro Val Tyr Thr Thr Ser Gln Val Gly Gly Leu Ile20 25 30Thr His Val Leu Trp Glu Ile Val Glu Met Arg Lys Glu Leu Cys Asn35 40 45Gly Asn Ser Asp Cys Met Asn Asn Asp Asp Ala Leu Ala Glu Asn Asn50 55 60Leu Lys Leu Pro Glu Ile Gln Arg Asn Asp Gly Cys Tyr Gln Thr Gly65 70 75 80Tyr Asn Gln Glu Ile Cys Leu Leu Lys Ile Ser Ser Gly Leu Leu Glu85 90 95Tyr His Ser Tyr Leu Glu Tyr Met Lys Asn Asn Leu Lys Asp Asn Lys100 105 110Lys Asp Lys Ala Arg Val Leu Gln Arg Asp Thr Glu Thr Leu Ile His115 120 125Ile Phe Asn Gln Glu Val Lys Asp Leu His Lys Ile Val Leu Pro Thr130 135 140Pro Ile Ser Asn Ala Leu Leu Thr Asp Lys Leu Glu Ser Gln Lys Glu145 150 155 160Trp Leu Arg Thr Lys Thr Ile Gln Phe Ile Leu Lys Ser Leu Glu Glu165 170 175Phe Leu Lys Val Thr Leu Arg Ser Thr Arg Gln Thr180 185(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度178個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型不適用(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO15Ala Pro Leu Ala Glu Leu Ser Gly Asp His Asp Phe Gln Leu Phe Leu1 5 10 15His Lys Asn Leu Glu Phe Thr Arg Lys Ile Arg Gly Asp Val Ala Ala20 25 30Leu Gln Arg Ala Val Cys Asp Thr Phe Gln Leu Cys Thr Glu Glu Glu35 40 45Leu Gln Leu Val Gln Pro Asp Pro His Leu Val Gln Ala Pro Leu Asp50 55 60Gln Cys His Lys Arg Gly Phe Gln Ala Glu Val Cys Phe Thr Gln Ile65 70 75 80Arg Ala Gly Leu His Ala Tyr His Asp Ser Leu Gly Ala Val Leu Arg85 90 95Leu Leu Pro Asn His Thr Thr Leu Val Glu Thr Leu Gln Leu Asp Ala100 105 110Ala Asn Leu Ser Ser Asn Ile Gln Gln Gln Met Glu Asp Leu Gly Leu115 120 125Asp Thr Val Thr Leu Pro Ala Glu Gln Arg Ser Pro Pro Pro Thr Phe130 135 140Ser Gly Pro Phe Gln Gln Gln Val Gly Gly Phe Phe Ile Leu Ala Asn145 150 155 160Phe Gln Arg Phe Leu Glu Thr Ala Tyr Arg Ala Leu Arg His Leu Ala165 170 175
Arg Leu(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度185個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型不適用(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO16Thr Arg Gly Lys Leu Pro Asp Ala Pro Glu Phe Glu Lys Asp Leu Leu1 5 10 15Ile Gln Arg Leu Asn Trp Met Leu Trp Val Ile Asp Glu Cys Phe Arg20 25 30Asp Leu Cys Tyr Arg Thr Gly Ile Cys Lys Gly Ile Leu Glu Pro Ala35 40 45Ala Ile Phe His Leu Lys Leu Pro Ala Ile Asn Asp Thr Asp His Cys50 55 60Gly Leu Ile Gly Phe Asn Glu Thr Ser Cys Leu Lys Lys Leu Ala Asp65 70 75 80Gly Phe Phe Glu Phe Glu Val Leu Phe Lys Phe Leu Thr Thr Glu Phe85 90 95Gly Lys Ser Val Ile Asn Val Asp Val Met Glu Leu Leu Thr Lys Thr100 105 110Leu Gly Trp Asp Ile Gln Glu Glu Leu Asn Lys Leu Thr Lys Thr His115 120 125Tyr Ser Pro Pro Lys Phe Asp Arg Gly Leu Leu Gly Arg Leu Gln Gly130 135 140Leu Lys Tyr Trp Val Arg His Phe Ala Ser Phe Tyr Val Leu Ser Ala145 150 155 160Met Glu Lys Phe Ala Gly Gln Ala Val Arg Val Leu Asp Ser Ile Pro165 170 175Asp Val Thr Pro Asp Val His Asp Lys180 18權(quán)利要求
1.編碼抗原多肽的分離的或重組的多核苷酸，包含a)SEQ ID NO2的成熟編碼部分的至少17個(gè)連續(xù)氨基酸；b)SEQ ID NO4的成熟編碼部分的至少17個(gè)連續(xù)氨基酸；c)SEQ ID NO5的成熟編碼部分的至少17個(gè)連續(xù)氨基酸。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，編碼以下成熟多肽a)SEQ ID NO2；或b)SEQ ID NO4。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，它于55℃、低于500 mM鹽和50％甲酰胺下與以下編碼部分雜交a)SEQ ID NO1的編碼部分；或b)SEQ ID NO3的編碼部分。
4.權(quán)利要求3的多核苷酸，包含a)SEQ ID NO1的編碼部分的至少35個(gè)連續(xù)核苷酸；或b)SEQ ID NO3的編碼部分的至少35個(gè)連續(xù)核苷酸。
5.包含權(quán)利要求1的多核苷酸的表達(dá)載體。
6.含權(quán)利要求5的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，包括真核細(xì)胞。
7.制備抗原多肽的方法，包括表達(dá)權(quán)利要求1的重組多核苷酸。
8.檢測(cè)權(quán)利要求1的多核苷酸的方法，包括使所述多核苷酸與一探針接觸，所述探針在嚴(yán)格條件下與以下編碼部分的至少25個(gè)連續(xù)核苷酸雜交a)SEQ ID NO1的編碼部分；或b)SEQ ID NO3的編碼部分；以形成雙鏈體，其中所述雙鏈體的檢測(cè)顯示存在所述多核苷酸。
9.用于檢測(cè)權(quán)利要求1的多核苷酸的試劑盒，包括含探針的區(qū)室，所述探針在嚴(yán)格條件下與權(quán)利要求1的多核苷酸的至少17個(gè)連續(xù)核苷酸雜交形成雙鏈體。
10.權(quán)利要求9的試劑盒，其中所述探針為可檢測(cè)標(biāo)記的。
11.包含抗體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合化合物，所述化合物與以下氨基酸特異性結(jié)合a)SEQ ID NO2的至少17個(gè)連續(xù)氨基酸；b)SEQ ID NO4的至少17個(gè)連續(xù)氨基酸；或c)SEQ ID NO5的至少17個(gè)連續(xù)氨基酸。
12.權(quán)利要求11的結(jié)合化合物，其中a)所述抗體結(jié)合位點(diǎn)為1)與SEQ ID NO2的多肽特異性免疫反應(yīng)；2)與SEQ ID NO4的多肽特異性免疫反應(yīng)；3)與SEQ ID NO5的多肽特異性免疫反應(yīng)；4)針對(duì)純化或重組產(chǎn)生的人IL-B30蛋白而產(chǎn)生的；5)針對(duì)純化或重組產(chǎn)生的小鼠IL-B30而產(chǎn)生的；6)在單克隆抗體、Fab或F(ab)2中；或b)所述結(jié)合化合物為1)抗體分子；2)多克隆抗血清；3)可檢測(cè)標(biāo)記的；4)無菌的；或5)在緩沖組合物中。
13.使用權(quán)利要求11的結(jié)合化合物的方法，包括使所述結(jié)合化合物與包含抗原的生物樣品接觸，其中所述接觸導(dǎo)致形成結(jié)合化合物抗原復(fù)合物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述生物樣品來自人，并且其中所述結(jié)合化合物為抗體。
15.檢測(cè)試劑盒，包含權(quán)利要求12的所述結(jié)合化合物，和a)使用所述結(jié)合化合物用于所述檢測(cè)的說明材料；或b)提供分隔所述結(jié)合化合物的區(qū)室。
16.大致純或分離的抗原多肽，它結(jié)合于權(quán)利要求11的所述結(jié)合組合物，并且還包含a)SEQ ID NO2的至少17個(gè)連續(xù)氨基酸；b)SEQ ID NO4的至少17個(gè)連續(xù)氨基酸；或c)SEQ ID NO5的至少17個(gè)連續(xù)氨基酸。
17.權(quán)利要求16的多肽，它a)包含至少一種來自靈長(zhǎng)類IL-B30蛋白的至少25個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的片段；b)包含至少一種來自嚙齒動(dòng)物IL-B30蛋白的至少25個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的片段；c)為可溶性多肽；d)為可檢測(cè)標(biāo)記的；e)在無菌組合物中；f)在緩沖組合物中；g)結(jié)合于細(xì)胞表面受體；h)為重組產(chǎn)生的，或；i)具有天然存在的多肽序列。
18.權(quán)利要求17的多肽，它a)包含SEQ ID NO2的至少17個(gè)連續(xù)氨基酸；b)包含SEQ ID NO4的至少17個(gè)連續(xù)氨基酸；或c)包含SEQ ID NO5的至少17個(gè)連續(xù)氨基酸。
19.調(diào)節(jié)細(xì)胞或組織培養(yǎng)細(xì)胞生理或發(fā)育的方法，包括使所述細(xì)胞與哺乳動(dòng)物IL-B30的激動(dòng)劑或拮抗劑接觸。
20.權(quán)利要求19的方法，其中a)所述接觸為與G-CSF和/或IL-6的激動(dòng)劑或拮抗劑聯(lián)合接觸；或b)所述接觸為與包括結(jié)合組合物的拮抗劑接觸，所述結(jié)合組合物包含特異性結(jié)合IL-B30的抗體結(jié)合位點(diǎn)。
全文摘要
提供了編碼哺乳動(dòng)物細(xì)胞因子的純化基因、與其相關(guān)的試劑,包括純化的蛋白、特異性抗體和編碼該分子的核酸。也提供了使用所述試劑的方法和診斷試劑盒。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1271387SQ98809375
公開日2000年10月25日 申請(qǐng)日期1998年7月24日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月25日
發(fā)明者J·F·巴贊 申請(qǐng)人:先靈公司