抗人白介素-6受體β鏈單克隆抗體、其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，尤其涉及一種單克隆抗體，具體來說是一種抗人白介 素-6受體3鏈單克隆抗體及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 分子量為130kD，其細(xì)胞外部由6個連續(xù)的0片層結(jié)構(gòu)域組成，分別為免疫球蛋 白樣結(jié)構(gòu)域（功能域1)，CHR分子（功能域2,功能域3)及3個纖連蛋白III樣結(jié)構(gòu)域（功 能域4-6)，不同的結(jié)構(gòu)域在配體連接及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中均發(fā)揮重要作用。白介素-6受體@鏈 作為白介素-6家族細(xì)胞因子-白介素_6,細(xì)胞抑制因子（LIF)、抑癌素M(OSM)、睫狀神 經(jīng)營養(yǎng)因子（CNTF)、白介素-11、心肌營養(yǎng)因子l(cardiotrophin-l)及白介素-27的共受 體，通過介導(dǎo)不同炎癥因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而參與到多種疾病中，例如在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)， 巨大淋巴增生病，炎癥性腸病，多發(fā)性骨髓瘤，銀屑病，糖尿病，哮喘，肥胖及腫瘤等疾病的 發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。隨著研究的深入，人們逐漸關(guān)注到白介素-6受體0鏈相關(guān)信 號通路可能會成為臨床免疫干預(yù)和治療的新靶點(diǎn)。2009年在美國舉行的國際抗體會議已有 研究者報告和提出白介素-6受體P鏈的診斷和治療性抗體具有良好的應(yīng)用前景，因此無 論是從免疫藥理還是藥物開發(fā)角度，針對白介素-6受體3鏈系統(tǒng)中白介素_6受體3鏈、 其相應(yīng)配體或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白的調(diào)控分析都是目前研究熱點(diǎn)。
[0003] 白介素_6是白介素-6受體0鏈的重要配體之一，與慢性炎癥性疾病、自身免疫 性疾病及腫瘤等的發(fā)生密切相關(guān)。白介素-6受體包括特異性白介素-6受體a鏈（gp80) 及白介素-6受體P鏈（gpl30)。白介素-6受體ct鏈的表達(dá)主要局限于肝細(xì)胞，白細(xì)胞 亞群，巨核細(xì)胞等細(xì)胞表面，而白介素-6受體3鏈則表達(dá)于所有細(xì)胞表面。白介素_6通 過傳統(tǒng)途徑及反式信號途徑兩種方式向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)信號。經(jīng)典途徑中白介素-6先與膜連 接白介素_6受體a鏈結(jié)合，之后誘導(dǎo)白介素-6受體3鏈同源二聚化，形成高親和力白介 素-6/白介素-6受體a /白介素-6受體0鏈復(fù)合體，從而進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。反式途徑中可 溶性形式的游離白介素-6受體a鏈與白介素-6結(jié)合后直接與白介素-6受體3鏈形成 復(fù)合體，因此在不表達(dá)膜連接白介素-6受體a鏈的細(xì)胞仍可通過白介素-6起反應(yīng)。研究 者認(rèn)為游離白介素-6受體a鏈及反式信號的存在使得白介素-6成為參與炎癥過程中最 為重要的細(xì)胞因子之一，其參與多種自身免疫疾病及腫瘤的發(fā)生發(fā)展，尤其是白介素-6在 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的作用機(jī)制，一直是臨床研究的熱點(diǎn)。
[0004] 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種以滑膜增生及關(guān)節(jié)進(jìn)行性破壞為特征的自身免疫性疾病， 在我國的發(fā)病率約為0.4% -1.0%，重癥類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者最終罹患以四肢關(guān)節(jié)為主的 全身各關(guān)節(jié)嚴(yán)重?fù)p傷，致殘率高達(dá)15%。傳統(tǒng)制劑甲氨蝶呤、來氟米特等藥物的針對性不 強(qiáng)，療效常常不盡如人意。近年來免疫學(xué)新的干預(yù)手段與臨床經(jīng)典治療方法的協(xié)同對于抑 制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展起到了一定效果?，F(xiàn)今進(jìn)入臨床前或臨床研究的治療類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)免疫抑制劑主要可分為兩大類：1)細(xì)胞因子干預(yù)制劑：主要是腫瘤壞死因 子（TNF)阻斷劑（阿達(dá)木單抗等）、白介素-6受體a鏈阻斷劑（塔西單抗TCZ) ;2)蛋白激 酶抑制劑：如JAK抑制劑、SYK抑制劑。然而由于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的個體化差異，對現(xiàn) 有的生物制劑反應(yīng)不一，大部分患者還是經(jīng)歷了從骨關(guān)節(jié)炎癥向類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)展，最 終罹患嚴(yán)重的關(guān)節(jié)損傷而致殘。因此亟需我們繼續(xù)深入研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制， 研制新的藥物靶點(diǎn)。
[0005] 大量研究表明：白介素_6信號系統(tǒng)與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎存在密切關(guān)聯(lián)性。類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎患者血清及滑液中白介素-6及游離白介素_6受體鏈a的濃度升高，且白介素-6 水平與疾病活動性因子（類風(fēng)濕因子，血沉，C反應(yīng)蛋白）的表達(dá)水平，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患 者臨床表現(xiàn)（如X線改變，受累關(guān)節(jié)數(shù)量，晨僵的持續(xù)時間）密切相關(guān)。緩解關(guān)節(jié)骨破壞是 治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者最關(guān)鍵問題，而破骨細(xì)胞比例增高被認(rèn)為是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者 骨關(guān)節(jié)損害的重要因素。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中相關(guān)炎癥細(xì)胞因子激活破骨細(xì)胞前體細(xì)胞 的增殖分化，破骨細(xì)胞生成比例增高，造成患者骨代謝失衡，而白介素-6信號系統(tǒng)在對破 骨細(xì)胞調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。
[0006] 已有研究工作證明：抑制白介素-6過表達(dá)或白介素-6信號系統(tǒng)異常的拮抗劑可 有效地調(diào)控白介素-6介導(dǎo)的免疫紊亂性疾病。臨床研究顯示，針對白介素-6信號系統(tǒng)的 拮抗劑，在一定程度上能緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者/類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎樣動物模型的發(fā)病進(jìn) 程。以白介素-6為靶點(diǎn)的拮抗劑（如lokizumab)，由于抗白介素-6抗體結(jié)合游離的白介 素-6不能從體循環(huán)中被清除，然而發(fā)生白介素-6堆積（近毫克水平）所帶來的副作用，一 直限制和阻礙了其在的臨床廣泛應(yīng)用。以白介素-6受體鏈a為靶點(diǎn)的單抗藥物塔西單抗 是唯一通過臨床III期試驗的白介素-6信號通路相關(guān)生物制劑。臨床實驗中，類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎患者使用塔西單抗治療后，可觀察到患者疾病活性指標(biāo)顯著持續(xù)性降低，局部關(guān)節(jié)癥 狀及體征改善明顯，C反應(yīng)蛋白快速恢復(fù)至正常水平，并且對有些腫瘤壞死因子治療無效的 患者有高反應(yīng)性，因此被認(rèn)為是晚期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的有效治療手段。然而深入研究 發(fā)現(xiàn)塔西單抗同時作用于經(jīng)典信號以及反式信號，全面阻斷了白介素-6的活性，因而也帶 來了一系列的副作用，如感染的發(fā)生，血中谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平升高，血總膽固醇、高密度脂蛋 白及低密度脂蛋白水平升高，心血管疾病發(fā)生風(fēng)險增加等，也因此阻礙了其在臨床上的廣 泛應(yīng)用。另一種以游離白介素6受體鏈0為靶點(diǎn)的單抗制劑（sgpl30)，由于在體內(nèi)會形成 大量聚集物，目前僅停留在實驗研究。
[0007] 考慮到白介素_6信號在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的多重作用及白介素-6受體鏈a的單 克隆抗體（塔西單抗）對TNF拮抗劑無效患者、晚期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的改善作用，抗人 白介素_6受體鏈P功能域單抗的研制可能成為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者新手段。隨著 白介素_6受體P鏈與其配體的偶聯(lián)位點(diǎn)的進(jìn)一步明確，并證實白介素_6家族不同細(xì)胞 因子需通過與各自的特有受體連接后再與白介素-6受體鏈0不同的結(jié)構(gòu)域結(jié)合而發(fā)揮 功能，抗白介素-6受體P鏈不同功能域的單克隆抗體具有不同的生物學(xué)功能，也使制備白 介素-6受體P鏈單一配體信號的拮抗劑成為可能，并有望為治療單抗藥物的研發(fā)提供有 力工具。為了驗證上述科學(xué)問題，我們通過抗膠原II功能域抗體誘導(dǎo)建立類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 樣小鼠模型（collagen antibody induce arthritis, CAIA)，結(jié)果表明抗人白介素-6受體 3鏈單抗能抑制模型小鼠的疾病發(fā)生發(fā)展，維持小鼠骨平衡等；應(yīng)用鼠抗人/抗鼠的單克 隆抗體，分析其針對抗人白介素-6受體3鏈單抗不同功能域和表位的效價、競爭抑制、親 和力和針對不同抗原靶點(diǎn)的生物學(xué)特性；完成了針對鼠抗人/抗鼠的單克隆抗體進(jìn)行全基 因測序；初步揭示了上述單抗調(diào)控類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎樣模型小鼠發(fā)病與轉(zhuǎn)歸的免疫病理學(xué)機(jī) 制；同時應(yīng)用已建立的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者病灶滑膜滑膜成纖維細(xì)胞細(xì)胞介導(dǎo)破骨細(xì)胞前 體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化技術(shù)，初步闡明了抗人白介素-6受體0鏈單抗調(diào)控類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎患者免疫學(xué)功能紊亂和骨代謝失衡的實質(zhì)表明本專利申請的抗人白介素-6受體3鏈單 抗的有效生物學(xué)活性和具有干預(yù)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者發(fā)病的潛在臨床應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了解決上述科學(xué)和技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種抗人細(xì)胞表面或血清游離的單 克隆抗體，所述抗體分子Fab段抗原結(jié)合部位的輕鏈可變區(qū)的cDNA及氨基酸序列如下所 示，重鏈可變區(qū)的cDNA及氨基酸序列如下所示。
[0009] 所沭抗人白介素-6夸體13鏈單克降抗體分子的cDNA及氨某酸序列如下，并分別 對應(yīng)序列表中的序列1、2、3和4 :
[0010] 輕鏈可變區(qū)(cDNA序列1和氨某酸序列2):
[0011]
[0013] 重鏈可奪區(qū)（cDNA序列