專利名稱：新的單克隆抗體以及d二聚體的免疫學測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于準確測定穩(wěn)定化血纖蛋白(特別是人穩(wěn)定化血纖蛋白)的纖溶酶分解產(chǎn)物(D 二聚體)的新的單克隆抗體以及使用該單克隆抗體的免疫學分析方法。本說明書中的術語“分析”包括判定分析對象物質(zhì)是否存在的“檢測”和對分析對象物質(zhì)的量或活性進行定量或半定量確定的“測定”。
背景技術：
穩(wěn)定化血纖蛋白的各種蛋白酶分解產(chǎn)物作為臨床診斷方法中的診斷標記物有用。例如如圖I所示，穩(wěn)定化血纖蛋白(交聯(lián)血纖蛋白(cross-linked fibrin))的纖溶酶分解產(chǎn)物(作為別稱，例如可總稱為“D 二聚體”、“D- D 二聚體”、“DD/E復合物”、“XDP”)、S卩，基本單元DD/E單體及其聚合物(DD/E聚合物，例如DXD/YY、YXY/DXXD、DXXY/YXXD)作為彌散性血管內(nèi)凝血綜合征(DIC)的診斷標記物而被廣泛使用。 另外，各種蛋白酶也可以分解存在于血液中的血纖蛋白原，例如，通過纖溶酶生成包含D 二聚體的構成要素一D結構域、E結構域的片段X、片段Y、片段D1、片段E3等血纖蛋白原分解產(chǎn)物(可總稱為FgDP)。因此，血栓形成患者的血液中可混合存在由于蛋白酶使穩(wěn)定化血纖蛋白分解而生成的D 二聚體、和由于蛋白酶使血纖蛋白原分解而生成的血纖蛋白原分解產(chǎn)物(FgDP)?？蓪⒋藘烧呖偡Q為FDP (以上參照圖I)。另外，以往認為血栓形成患者血漿中的D 二聚體是分子量約23萬的DD/E組分為主成分，但近年來實際了解到DXD/YY組分、YXY/DXXD組分、DXXY/YXXD組分等的更高分子量的多聚體為主成分(參照非專利文獻I)。近年來，因血栓形成和/或栓塞死亡的基礎疾病顯示增加傾向，用于檢測血栓形成的臨床檢查日益進步。最初是將使用血纖蛋白原(Fbg)的多克隆抗體來測定血清中血纖蛋白/血纖蛋白原分解產(chǎn)物的FDP測定用于診斷，但在進行脫血纖蛋白原處理時，該操作仍不足夠，所以存在顯示假高值的問題。后來，為了解決該問題，人們尋求與FDP的測定平行、不與血纖蛋白原反應、而只測定作為DD/E復合物的穩(wěn)定化血纖蛋白分解產(chǎn)物(D 二聚體)的D 二聚體試劑。例如，D 二聚體的測定方法已知有將識別D 二聚體的單克隆抗體固定于膠乳顆粒、塑料板等固相上，基于與D 二聚體結合的抗原抗體反應的方法，即膠乳凝集法或ELISA法等(專利文獻I)。但是，在基于抗原抗體反應的方法中，目前所使用的與固相結合的單克隆抗體與D二聚體具有反應性，同時對于與D 二聚體具有類似結構的片段X和/或片段Y和/或片段Dl和/或片段E3也可能具有反應性。如果使用上述單克隆抗體，則與固相結合的單克隆抗體在測定時也與D 二聚體以外的片段結合，可能無法準確測定。另外，人們也公開了用于解決上述問題的以下的方法。但是，以下試劑中所使用的單克隆抗體仍不能說是D 二聚體特異性的。例如專利文獻2中報道了一種D 二聚體測定試齊U，該D 二聚體測定試劑與DD/E組分的多聚體和DD/E組分的單體反應，但不與X組分、Y組分、D組分、E組分反應，并且對于DD/E組分的四聚體的反應性至少具有10%的對于DD/E組分的反應性。但是專利文獻2中具體給出的DD-M1653(保藏號FERM P-19687號)在專利文獻3中已經(jīng)明確是與DD/E組分的多聚體和DD/E組分的單體以及X組分和Y組分反應，但不與D組分和E組分反應，仍不能說是D 二聚體特異性的。專利文獻2中并未顯示可特異性且準確地測定檢樣中的D 二聚體。專利文獻3公開即使使用上述對D 二聚體反應特異性較低的單克隆抗體，通過將含有對D 二聚體具有反應性的單克隆抗體的液狀試劑、與固定有對D 二聚體具有反應性的單克隆抗體的載體或含有該載體的溶液組合而成的D 二聚體測定用試劑盒，可更為準確地測定實際的D 二聚體的量，但仍無法簡便、特異性且準確地測定檢樣中的D 二聚體。近年來，由于醫(yī)學的進步、治療和治療藥物的進步，例如對血栓形成患者等的治療使用了溶栓劑，如上所述，以被認為在生理環(huán)境下不會發(fā)生的狀態(tài)發(fā)生纖溶 ，這樣就無法忽視含有片段D的血纖蛋白原分解產(chǎn)物的存在。因此，專利文獻4中公開在檢樣中存在片段D時，片段D會干擾膠乳凝集反應，使原本的凝集受到抑制，為了避免獲得比原本的值更低的值的結果，是預先人為地使過量的片段D共存，以不受來自檢樣的不確定的片段D的影響，由此可以準確測定D 二聚體。但是，只通過I種抗體的反應特異性并不能特異性且準確地測定檢樣中的D 二聚體。如上所述，人們需求穩(wěn)定化血纖蛋白分解產(chǎn)物(D 二聚體)特異性的D 二聚體試齊U，但是，使用I種單克隆抗體、可特異性且準確地測定D 二聚體的抗體或含有該抗體的試劑尚未見報道。并且，目前的主流是使用血漿檢樣測定FDP、D 二聚體，但也偶有FDP和D 二聚體顯示假高值的問題。非專利文獻2中顯示，由于采集患者血漿時的操作技術使得凝固、纖溶亢進，可能顯示FDP、D 二聚體為偽高值。現(xiàn)有技術文獻 專利文獻
專利文獻I :日本特開昭63-79900號公報 專利文獻2 :日本特開2006-105633公報 專利文獻3 :日本特開2006-234676公報 專利文獻4 :日本特開2001-21557公報 非專利文獻
非專利文獻 I :Charles ff. Francis, Victor J. Marder 和 Grant H. Barlow;Plasmic Degradation of Crossl inked Fibrin: CHARACTERIZATION OF NEWMACR0M0LECULAR SOLUBLE COMPLEXES AND A MODEL OF THEIR STRUCTURE (交聯(lián)血纖蛋白的降解新的大分子可溶性復合物及其結構模型的表征).J. Clin. Invest. (1980)66(5) : 1033 1043.
非專利文獻2 :高田章美、前川芳明、山本慶和、松尾收二 ；血漿検體&用^ 測定L· tzF D P杉J t/ D夕M ^ —偽高値O原因(使用血漿檢樣測定的FDP及D 二聚體假高值的原因)· JJCLA. (2005) 30(5) :721-726。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明鑒于上述問題而完成，其目的在于通過使用至少I種不受存在于檢樣中的血纖蛋白原及其分解產(chǎn)物一片段X、片段Y、片段Dl和片段E3的影響、且不與使DD/E單體解離而成的片段DD、以及片段El和片段E2反應的抗體，提供可特異性且準確地測定穩(wěn)定化血纖蛋白分解產(chǎn)物(D 二聚體)的方法和測定試劑。本發(fā)明人針對上述現(xiàn)狀進行了深入的研究，結果發(fā)現(xiàn)通過使用至少I種不與存在于檢樣中的血纖蛋白原及其分解產(chǎn)物一片段X、片段Y、片段Dl和片段E3、和使DD/E單體解離而成的片段DD、以及片段El和片段E2反應的抗體，則不會與D 二聚體以外的分子反應，不會顯示比實際的D二聚體值低的值或假高值。根據(jù)該認識，本發(fā)明完成了特異性且準確地測定穩(wěn)定化血纖蛋白分解產(chǎn)物(D 二聚體)的方法以及測定試劑。因此，本發(fā)明涉及
[I]抗D 二聚體抗體，其特征在于與穩(wěn)定化血纖蛋白的纖溶酶分解產(chǎn)物D 二聚體特異性反應，但不與血纖蛋白原及其纖溶酶分解產(chǎn)物片段X、片段Y、片段Dl和片段E3、和使DD/E單體解離而成的片段DD以及片段El和片段E2反應。[2] [I]的抗體的片段；
[3]雜交瘤,該雜交瘤生成[I]的抗體。[4]免疫學測定生物體試樣中的D 二聚體的方法，該方法是使用[I]的抗體或[2]的抗體片段。[5]D 二聚體的免疫學測定試劑，該試劑含有[I]的抗體或[2]的抗體片段。通過使用本發(fā)明的抗體，即使在纖溶強烈亢進、推測大量存在血纖蛋白原分解產(chǎn)物(FgDP)的檢樣中，也可以特異性且準確地測定穩(wěn)定化血纖蛋白分解產(chǎn)物(D 二聚體)。另夕卜，在使用本發(fā)明的抗體制備的膠乳試劑中，可以避免DD/E單體對膠乳反應的抑制，可進行更準確的穩(wěn)定化血纖蛋白分解產(chǎn)物(D 二聚體)的測定。通過本發(fā)明的抗體，可以特異性地只測定由于疾病引起的纖溶亢進所形成的D 二聚體，因此，可以避免可能人為生成的分子(例如DD/E單體解離形成的DD、后述實施例7所示的改性的D二聚體等)的影響。附圖
簡述
圖I是模式表示血纖蛋白原的纖溶酶分解產(chǎn)物(FgDP)和穩(wěn)定化血纖蛋白的纖溶酶分解產(chǎn)物(D 二聚體)的結構的說明圖。圖2是在使用各種抗D 二聚體抗體的膠乳凝集法中，表示存在于檢樣中的DD/E單體的影響的圖表。圖3是在使用各種抗D 二聚體抗體的膠乳凝集法中，表示存在于檢樣中的片段Dl影響的圖表。圖4是在使用各種抗D 二聚體抗體的ELISA法中，表示與DD/E單體或其各構成片段、血纖蛋白原分解產(chǎn)物(FgDP)—片段Dl或片段E3、或這些片段的混合物的反應性的圖表。圖5是在使用各抗D二聚體抗體的膠乳凝集法中，表示存在于檢樣中的DD/E單體的影響的圖表。圖6是在使用各種抗D 二聚體抗體的膠乳凝集法中，表示存在于檢樣中的片段Dl的影響的圖表。圖7是在使用本發(fā)明的抗D 二聚體抗體的膠乳試劑、和以往的市售D 二聚體試劑中，表示存在于檢樣中的片段Dl的影響的圖表。圖8是將冷凍溶解的血漿檢樣用本發(fā)明的抗體(比較是使用以往的抗體)進行吸收操作，將所得的上清(S)、抗體結合物(B)[對照使用未處理血漿(P)]進行電泳，表示蛋白質(zhì)印跡(用抗Fbg抗體檢測)的結果的圖像。實施發(fā)明的方案
對于本發(fā)明的特異性測定D 二聚體(包含DD/E單體和DD/E聚合物)的方法，可通過 至少不與血纖蛋白原及其纖溶酶分解產(chǎn)物片段X、片段Y、片段D1、片段E3、和使DD/E單體解離而成的片段DD、以及片段El和片段E2反應，只與D 二聚體特異性反應的抗體實施。(I)抗體
本發(fā)明的抗體可通過公知的方法獲得。只要具有上述反應性，可以是單克隆抗體(MoAb)，也可以是多克隆抗體(PoAb)，優(yōu)選單克隆抗體。抗體并不限于來自小鼠，還可例舉大鼠、倉鼠、兔、山羊、馬等，優(yōu)選小鼠?？贵w并不限于IgG，還可以是IgM、IgA、IgE、IgD等。本發(fā)明的抗體例如可通過將生成所需MoAb的雜交瘤在培養(yǎng)基或哺乳動物的腹腔內(nèi)培養(yǎng)來制造。這里所使用的雜交瘤通?？砂凑誎ohler和Milstein的細胞融合的基本方法[參照nature，256，495 (1975)]，使免疫了 D 二聚體的小鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行細胞融合獲得。培養(yǎng)上述雜交瘤的培養(yǎng)基只要是適合雜交瘤培養(yǎng)的培養(yǎng)基即可，優(yōu)選使用ERDF (極東制藥制造)中含有牛血清(Gibco制造)、D-葡萄糖(和光純藥制造)、碳酸氫鈉(和光純藥制造)、培養(yǎng)基添加劑RD-I (極東制藥制造)的培養(yǎng)基。上述雜交瘤的培養(yǎng)在培養(yǎng)基中進行時，可在5% 二氧化碳濃度且37°C的條件下進行約3天。在小鼠的腹腔內(nèi)培養(yǎng)時，可以進行約14天?？梢园凑盏鞍踪|(zhì)的分離和純化中常規(guī)使用的方法，由上述得到的培養(yǎng)液或哺乳動物的腹水中分離和純化上述單克隆抗體。上述方法可舉出硫酸銨鹽析、使用離子交換纖維素的離子交換柱層析、使用分子篩凝膠的分子篩柱層析、使用結合A蛋白的多糖類的親和柱層析、透析、冷凍干燥等。作為本發(fā)明的抗體片段、即本發(fā)明MoAb的片段、含有與D 二聚體特異性反應的抗原結合部位的抗體片段中例如含有Fab、Fab’、F(ab’)2*Fv等。這些片段例如可通過常規(guī)方法、用蛋白質(zhì)分解酶對本發(fā)明的單克隆抗體進行消化，接著，按照蛋白質(zhì)的分離、純化的常規(guī)方法獲得。用于制作本發(fā)明的抗體的抗原例如可使用DD/E單體或DD/E聚合物。DD/E聚合物可舉出2-5聚體，如果為6聚體以上則難以溶于水。該抗原還可按照公知的方法，由血纖蛋白原制備。還可以由人等純化獲得，還可以通過基因工程的方法獲得。并且可使用市售商品O對于本發(fā)明的抗體，可通過確認所制作的抗體至少不與血纖蛋白原及其纖溶酶分解產(chǎn)物一片段X、片段Y、片段D1、片段E3、和使DD/E單體解離而成的片段DD、以及片段El和片段E2反應，只與D 二聚體特異性反應來獲得。上述確認方法可采用實施例所示的公知的免疫學測定方法。
并且認為，D 二聚體根據(jù)為DD/E單體或為DD/E聚合物，其分子大小或結構不同，因此，由于空間位阻等會對抗體的反應性有影響。因此，D二聚體的各分子種類的存在比例對于測定值是否有影響，這例如可如實施例所示，通過對一定量的DD/E聚合物添加各種量的DD/E單體來確認。(2)測定方法和試劑
本發(fā)明的測定方法和試劑可通過至少不與血纖蛋白原及其纖溶酶分解產(chǎn)物一片段X、片段Y、片段D1、片段E3、和使DD/E單體解離而成的片段DD、以及片段El和片段E2反應，只與D 二聚體特異性反應的抗體來實施。另外，本發(fā)明的抗體即使單獨使用也可以特異性且準確地測定D 二聚體，但還可以將多種抗體例如識別部位不同的抗體適當組合使用。
本發(fā)明的測定方法除了使用本發(fā)明抗體之外，還可以使用公知的免疫學測定方法。具體來說，可舉出免疫比濁法(TIA)、酶免疫測定法(EIA)、放射免疫測定法(RIA)、膠乳凝集反應法、熒光免疫測定法、免疫色譜法等。對于本發(fā)明的抗體，也可以利用將2種以上本發(fā)明的抗體與除此以外的與D二聚體反應的抗體組合使用的上述免疫學測定方法，不過，只用本發(fā)明的抗體也可以特異性測定D 二聚體，因此可以將2種以上本發(fā)明的抗體組合使用，更優(yōu)選可利用只使用I種本發(fā)明的抗體的該免疫學的測定方法。使用不溶性載體的免疫學凝集法更具體如下記述。根據(jù)原理，如果該免疫學凝集法含有非特異性反應的抗體，則容易發(fā)生非特異性凝集，不能進行準確的測定，因此，優(yōu)選只利用本發(fā)明的抗體。不溶性載體可舉出有機高分子顆粒、無機物顆粒、紅細胞等。有機高分子顆粒例如可舉出不溶性瓊脂糖、不溶性葡聚糖、纖維素、膠乳顆粒?？蓛?yōu)選舉出膠乳顆粒，可舉出聚苯乙烯、苯乙烯/甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯/(甲基)丙烯酸縮水甘油基酯共聚物、苯乙烯/苯乙烯磺酸鹽共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、丙烯腈丁二烯苯乙烯共聚物、氯乙烯/丙烯酸酯共聚物、聚乙酸乙烯基酯丙烯酸酯等顆粒。無機物顆?？膳e出二氧化硅、氧化鋁等。顆粒的平均粒徑可根據(jù)測定儀器等適當選擇，可舉出O. 05-0. 50 μ m。將抗體擔載于不溶性載體上的方法有物理吸附法和化學結合法，從擔載操作簡便性考慮，優(yōu)選使用物理吸附法。可適當添加緩沖液、增敏劑、表面活性劑、無機鹽。緩沖液優(yōu)選在PH5-10、特別是PH6-9下具有緩沖作用，可舉出磷酸緩沖液、Tris緩沖液、咪唑緩沖液、三乙醇胺·鹽酸、Good緩沖液等，Good緩沖液可舉出MES緩沖液、Bis-Tris緩沖液、ADA緩沖液、PIPES緩沖液、Bis-Tris-丙烷緩沖液、ACES緩沖液、MOPS緩沖液、BES緩沖液、TES緩沖液、HEPES緩沖液、HEPPS緩沖液、Tricine緩沖液、Bicine緩沖液、TAPS緩沖液。為了促進凝集速度等，可添加增敏劑。增敏劑沒有特別限定，可舉出聚乙烯基吡咯烷酮、聚陰離子、聚乙二醇、多糖類等。表面活性劑可舉出非離子性表面活性劑、陰離子性表面活性劑、陽離子性表面活性劑、兩性表面活性劑。為了抑制檢樣中鹽濃度的影響等，可以添加無機鹽。無機鹽可舉出氯化鈉、氯化 丐等。測定檢樣中的D 二聚體濃度時，測定試劑除了含有第I試劑和第2試劑的雙試劑體系的試劑形態(tài)之外，也可以是含有一種試劑的試劑形態(tài)。從測定精度的觀點等考慮，優(yōu)選含有第I試劑和第2試劑的雙試劑體系，以下例舉。第I試劑含有緩沖液，第2試劑含有抗體致敏膠乳顆粒，可適當添加增敏劑、表面活性劑、無機鹽等。優(yōu)選的例子可舉出第I試劑含有緩沖液、增敏劑和無機鹽，第2試劑為含有抗體致敏膠乳顆粒的試劑。使用上述測定試劑測定時，可采用將第I試劑和檢樣在反應池中混合，然后添加第2試劑，光學測定抗體致敏膠乳顆粒的凝集程度的方法；或者是將第I試劑和第2試劑在反應池中混合，然后添加檢樣，光學測定抗體致敏膠乳顆粒的凝集程度的方法等?？捎帽景l(fā)明進行分析的檢樣例如可舉出液體生物體試樣,例如血液、血漿、血清或尿液等。例如使用上述例舉形式的試劑進行凝集反應，分別光學觀察已知濃度的D 二聚體 溶液和檢樣分別發(fā)生的凝集程度，進行比較，由此可測定檢樣中的D二聚體濃度。具體來說，首先測定兩個濃度(優(yōu)選包含D 二聚體濃度為O μ g/mL的溶液)以上的已知濃度的D 二聚體溶液，由所得光學密度變化量和D 二聚體濃度的關系制作校正曲線。接著，測定檢樣，利用校正曲線、由其光學密度變化量求出濃度，以該值作為D 二聚體濃度。光學檢測抗體致敏膠乳顆粒的凝集程度的方法中，測定是用測定散射光強度、吸光度或透射光強度的光學儀器進行。測定波長可由300-2400nm、優(yōu)選300_1000nm、更優(yōu)選300_800nm的范圍選擇適當?shù)牟ㄩL。測定方法是按照公知的方法，通過所使用的抗體致敏膠乳顆粒的大小或濃度選擇、反應時間的設定來測定散射光強度、吸光度或透射光強度的增加或減少來進行。也可以將這些方法結合使用。免疫反應的條件可采用公知的條件，反應時的溫度為10_50°C，特別優(yōu)選20-40°C?？蛇m當確定反應時間。
實施例以下通過實施例具體說明本發(fā)明，但它們并不限定本發(fā)明的范圍。《實施例I:抗原和各種分子的制備》
(I)D 二聚體的制備
D 二聚體的制備主要是按照Stephanie A. Olexa和Andrei Z. Budzynski的方法(1978)、Circulation, Suppl. 58, 119, Olexa 等人的方法(1979)、以及 Biochim. Biophys.Acta 576，39-50進行。在人血纖蛋白原(Enzyme Research Laboratories制造)中加入牛凝血酶(持田制藥制造)和氯化鈣，在37°C下反應2小時，使血纖蛋白原變成血纖蛋白。將其離心，從非凝固性物質(zhì)中分離血纖蛋白。將血纖蛋白懸浮于含有氯化鈣的Tris鹽酸緩沖液pH7. 8中。在37°C環(huán)境下,在懸浮液中添加人纖溶酶(Chromogenix制造)。加入抑酶肽，使分解反應終止，然后過賴氨酸瓊脂糖柱，除去纖溶酶。該通過液為分子量不同的D 二聚體的混合物。接著，通過用含有氯化鈣的Tris鹽酸緩沖液pH7. 5 (溶液A)展開的分子篩色譜，將之前所得的通過液用溶液A平衡的S印hacryl ( -fc 7 r ^ -j ^ ) S-300 (S-300)柱進行分級。將該組分通過SDS-PAGE的電泳法、蛋白質(zhì)印跡法，鑒定并分離D 二聚體組分。上述制備的各D 二聚體組分作為免疫原、或作為用于篩選抗D 二聚體單克隆抗體生成性雜交瘤的酶聯(lián)免疫測定(ELISA)或膠乳(LTX)用抗原使用。(2)片段DD、片段El和片段E2的制備
將上述得到的分子量最小的D 二聚體組分(DD/E單體)在3mol/L尿素-50mmol/L檸檬酸(pH5. 5)溶液中、在37°C下保溫4小時。接著，填充于用50mmol/L Tris-鹽酸緩沖液(pH7. 4)-28mmol/L檸檬酸鈉-O. lmol/L氯化鈉溶液平衡的瓊脂糖CL-6B柱中，用上述溶液展開。將分級得到的片段DD和片段El和片段E2通過SDS-PAGE的電泳法、蛋白質(zhì)印跡法鑒定、分離。(3)人血纖蛋白原的纖溶酶分解產(chǎn)物的制備
在人血纖蛋白原(Enzyme Research Laboratories制造)中加入氯化I丐，然后添加人纖溶酶(Chromogenix制造)，在37°C下反應2小時。反應終止是通過加入抑酶肽(Pentapharm制造)進行。將反應終止后的產(chǎn)物填充于用Tris鹽酸緩沖液(ρΗ7· 5)平衡的Sephacryl ( -fc 7 r ^ -j ^ ) S-300 (S-300)柱中，通過凝膠過濾法分級為片段X、片段Y、 片段D1、片段E3。這些片段作為用于篩選抗D 二聚體單克隆抗體生成性雜交瘤的ELISA或LTX用抗原使用?！秾嵤├?:單克隆抗體的制備》
(I)免疫的脾細胞的制備
將實施例I中制備的DD/E單體溶液與等量的弗氏完全佐劑混合，直至乳化(免疫原混合液)，通過小鼠皮內(nèi)給予進行免疫(第I次免疫)。經(jīng)過2周后，按照上述與小鼠同樣的方法將免疫原混合液進行小鼠皮內(nèi)給予(第2次免疫)。以后每隔2周對小鼠皮內(nèi)給予免疫原混合液,共計進行4次免疫。第4次免疫開始經(jīng)過2周后，將實施例I中制備的DD/E單體溶液與等量的氫氧化鋁凝膠混合，將該混合液給予上述小鼠的脾臟內(nèi)(最終免疫)。最終免疫開始經(jīng)過3天后，由小鼠取出脾臟，用于細胞融合。(2)細胞融合
將脾細胞由上述無菌摘取的上述脾臟中回收至ERDF培養(yǎng)基中。將該脾細胞收集于離心管內(nèi)進行離心，將所得沉淀用ERDF培養(yǎng)基懸浮，計測存活的脾細胞數(shù)。另一方面，將預培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細胞(骨髓瘤細胞)P3U1與上述脾細胞混合，離心。將該沉淀在PEG1500、接著在ERDF培養(yǎng)基中依次懸浮，使細胞融合。將沉淀在含有牛血清、次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷、RD-I的ERDF培養(yǎng)基中懸浮。將該細胞懸浮液在96孔細胞培養(yǎng)板上、在37°C下、在含有5% 二氧化碳的二氧化碳培養(yǎng)容器中培養(yǎng)。(3)雜交瘤的構建
培養(yǎng)約13天后，收集培養(yǎng)上清，使用ELISA法確認有否目標抗體。在96孔ELISA板上分注用磷酸緩沖液(PBS)稀釋的抗小鼠免疫球蛋白抗體，在4°C下放置過夜。將其用含
O.05% Tween-20的磷酸緩沖液(T-PBS)洗滌4次。洗滌后分注培養(yǎng)上清，在4°C下放置過夜。接著，分注用T-PBS洗滌4次的、用T-PBS稀釋的實施例I中制備的DD/E單體組分，在室溫下反應2小時。用T-PBS洗滌4次后，分注用T-PBS稀釋的過氧化物酶(HRP)標記抗人血纖蛋白原多克隆抗體，在室溫下反應I小時。將其用T-PBS洗滌4次，然后分注TMB試劑(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.制造)，在室溫下反應10分鐘。向其中分注lmol/L磷酸溶液，終止反應，測定450nm的吸光度。同樣也對血纖蛋白原、片段Dl確認反應性，對于生成了雖然與DD/E單體組分反應、但不與血纖蛋白原、片段Dl反應的抗體的雜交瘤，通過極限稀釋法進行克隆，進行克隆的構建。采用該方法進行3次細胞融合，免疫3只小鼠，共構建18個克隆。(4)單克隆抗體的制造
接著，對腹腔內(nèi)預先給予了降植烷的BALB/c小鼠腹腔內(nèi)給予上述得到的雜交瘤。約2周后收集腹水。將腹水離心，然后向上清中緩慢加入固體硫酸銨，將混合物在冰冷卻下攪拌30分鐘，然后放置60分鐘，進行離心。將所得沉淀溶解于少量的Tris鹽酸緩沖液pH7. 5 (溶液B)中。將其填充于用溶液B平衡的Q瓊脂糖柱。將抗體用含有O. 16mol/L NaCl的溶液B溶出，得到純化的抗D 二聚體抗體。(5)抗D 二聚體抗體的ELISA法篩選
對于所得純化抗體，使用ELISA來確認與血纖蛋白原相關片段的反應性，進行雜交瘤的選擇?？乖褂醚w蛋白原(Fbg)、DD/E單體(DD/E mono)、DD/E聚合物(DD/E poly)、 片段X、片段Y、片段D1、片段E3。結果如表I所不。另外,表不吸光度值的、表I中使用的符號的定義如表2所不?？纱_認所得的18個克隆的抗體不與血纖蛋白原和血纖蛋白原分解產(chǎn)物(片段X、Y、D1、E3)反應
[表I]
權利要求
1.抗D二聚體抗體，其特征在于與穩(wěn)定化血纖蛋白的纖溶酶分解產(chǎn)物D 二聚體特異性反應，但不與血纖蛋白原及其纖溶酶分解產(chǎn)物片段X、片段Y、片段Dl和片段E3，和使DD/E單體解離而成的片段DD以及片段El和片段E2反應。
2.權利要求I的抗體的片段。
3.雜交瘤,該雜交瘤生成權利要求I的抗體。
4.免疫學測定生物體試樣中的D二聚體的方法，該方法是使用權利要求I的抗體或權利要求2的抗體片段。
5.D 二聚體的免疫學測定試劑，該試劑含有權利要求I的抗體或權利要求2的抗體片段。
全文摘要
本發(fā)明提供可以特異性且準確地測定穩(wěn)定化血纖蛋白分解產(chǎn)物(D二聚體)的抗體、以及使用該抗體的D二聚體的測定方法和測定試劑。上述抗體與穩(wěn)定化血纖蛋白的纖溶酶分解產(chǎn)物D二聚體特異性反應，但不與血纖蛋白原及其分解產(chǎn)物片段X、片段Y、片段D1和片段E3、和使DD/E單體解離得到的片段DD以及片段E1和片段E2反應。
文檔編號G01N33/563GK102822338SQ201180017910
公開日2012年12月12日 申請日期2011年3月31日 優(yōu)先權日2010年4月1日
發(fā)明者長濱裕, 野崎順子, 櫻井錠治 申請人:三菱化學美迪恩斯株式會社