專利名稱：促進(jìn)誘導(dǎo)血管分化的含肝細(xì)胞生長因子的制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及促進(jìn)誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的制劑，包括作為活性成分的肝細(xì)胞生長因子。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞生長因子(下文中為HGF)最初是作為成熟肝細(xì)胞的生長因子鑒定出來的，其基因(cDNA)已于1989年被克隆出來(參見非專利文獻(xiàn)1和2)。
迄今為止，HGF對多種細(xì)胞以及肝細(xì)胞發(fā)揮諸多生物學(xué)活性，例如細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞遷移，形態(tài)發(fā)生誘導(dǎo)，細(xì)胞死亡抑制等(參見非專利文獻(xiàn)3-6)。
HGF的生物學(xué)活性通過其受體，即c-Met酪氨酸激酶進(jìn)行表達(dá)。HGF具有多種生物學(xué)活性，并對遭受多種損傷的不同組織具有修復(fù)和保護(hù)的功能。
血管新生促進(jìn)活性是HGF對組織進(jìn)行再生和保護(hù)的功能之一。HGF不僅能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，還在體內(nèi)表現(xiàn)出顯著的血管新生誘導(dǎo)活性(參見非專利文獻(xiàn)7-10)。
然而，以上所涉及的文獻(xiàn)中沒有任意一篇對HGF促進(jìn)誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞有所描述。
JP-A-89869/1996[專利文獻(xiàn)2]JP-A-172207/1994[非專利文獻(xiàn)1]Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，1984，vol.122，p.1450-1459[非專利文獻(xiàn)2]Nature，1989，vol.342，p.440-443[非專利文獻(xiàn)3]The Journal of Cell Biology，1985，vol.129，p.1177-1185[非專利文獻(xiàn)4]The Journal of Biochemistry，1986，vol.119，p.591-600[非專利文獻(xiàn)5]International Review of Cytology，1999，vol.186，p.225-260[非專利文獻(xiàn)6]Kidney International，2001，vol.59，p.2023-2038[非專利文獻(xiàn)7]The Journal of Cell Biology，1992，vol.119，p.629-641[非專利文獻(xiàn)8]Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America，1993，vol.90，p.1937-1941[非專利文獻(xiàn)9]Circulation，1998，vol.97，p.381-390[非專利文獻(xiàn)10]Hypertension，1999，vol.33，p.1379-1384發(fā)明內(nèi)容近來，血管發(fā)生的概念發(fā)生了較大的變化。確切地說，認(rèn)為成年人中的血管發(fā)生只能從現(xiàn)有的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移形成，然而，目前認(rèn)為還存在著這樣一種可能性，即當(dāng)涉及到血流中的內(nèi)皮祖細(xì)胞時(shí)，認(rèn)為是僅發(fā)生在胚胎階段的血管發(fā)生型的血管再生有可能作為血管發(fā)生的結(jié)果而發(fā)生。基于這樣的假設(shè)，在今天看來，通過應(yīng)用內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)展治療血管再生的方法是可以期待的。
因?yàn)槌赡耆说膬?nèi)皮祖細(xì)胞來源于骨髓，因此本發(fā)明的目的就在于提供促進(jìn)誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的制劑。
本發(fā)明新近發(fā)現(xiàn)(1)通過HGF給藥在外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞的表達(dá)有所增加，(2)這樣的增加來源于骨髓細(xì)胞，和(3)HGF促進(jìn)誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞。在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人進(jìn)行了進(jìn)一步的研究并完成了本發(fā)明。
首先，本發(fā)明涉及促進(jìn)誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的制劑，其中包含HGF。
其次，本發(fā)明涉及通過向哺乳動(dòng)物施用HGF促進(jìn)誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的方法，并且還涉及HGF在生產(chǎn)用于促進(jìn)誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。
再者，本發(fā)明涉及與含有HGF的誘導(dǎo)分化制劑一起培養(yǎng)骨髓細(xì)胞，以及將從骨髓細(xì)胞分化而來的內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞移植入哺乳動(dòng)物的方法，或者是對骨髓細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，再將增殖的骨髓細(xì)胞移植入哺乳動(dòng)物，同時(shí)施用含有HGF的促進(jìn)誘導(dǎo)分化制劑，以及誘導(dǎo)移植的骨髓細(xì)胞分化成內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的方法。
此外，本發(fā)明還涉及用于促進(jìn)誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的基因藥物，包括引入HGF基因和HGF。
本發(fā)明的促進(jìn)誘導(dǎo)血管分化的制劑能夠加速誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞。內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞，而內(nèi)皮細(xì)胞則發(fā)揮源于血管發(fā)生型的血管新生或血管再生過程的作用。因?yàn)楸景l(fā)明的制劑能夠促進(jìn)誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞，因此其可用于治療需要血管新生或血管再生的疾病。
此外，通過在存在本發(fā)明中促進(jìn)誘導(dǎo)分化制劑的條件下培養(yǎng)骨髓細(xì)胞，可以產(chǎn)生從骨髓細(xì)胞分化而來的內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞。這樣得到的內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞可以在再生醫(yī)藥領(lǐng)域中作為血管新生或血管再生的移植細(xì)胞。


圖1所示為肺毛細(xì)血管受損的受體小鼠外周血中來自骨髓細(xì)胞部分的FlK-1抗體的表達(dá)分布。
圖2所示為肺毛細(xì)血管受損的受體小鼠肺部的組織學(xué)發(fā)現(xiàn)。
圖3所示為肺毛細(xì)血管受損的受體小鼠肺毛細(xì)血管的免疫熒光染色。
優(yōu)選實(shí)施方式本發(fā)明中使用的HGF是公知的物質(zhì)。采用多種方法制備的HGF可用于本發(fā)明中，只要其純度足以被用作醫(yī)用制劑。就HGF的生產(chǎn)過程而言，例如，HGF可通過培養(yǎng)產(chǎn)生HGF的原始培養(yǎng)細(xì)胞或已建立的細(xì)胞系的細(xì)胞，從培養(yǎng)上清液等中分離HGF并對所分離的HGF進(jìn)行純化得到。或者，也可以通過向合適的載體中整合編碼HGF的基因，將所述載體插入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞進(jìn)行其轉(zhuǎn)化并從所轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中收集目的重組HGF的遺傳工程技術(shù)獲得重組HGF(參見，例如JP-A-111382/1993；Biochem.Biophys.Res.Commun.，1989，vol.163，p.967)。
對上述宿主細(xì)胞并沒有特殊的限制，常規(guī)用于遺傳工程技術(shù)中的多種宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌，酵母，動(dòng)物細(xì)胞等都可以使用。所得到的HGF，只要其具有與天然HGF基本相同的作用可以在其氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)(例如幾個(gè))氨基酸的替換，缺失，添加和/或插入。類似地，HGF可以包含糖鏈的替換，缺失和/或添加。在本文中，在氨基酸序列中的“一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失，替換，添加或插入”是指某一數(shù)量的天然存在(一個(gè)至若干個(gè)氨基酸)的氨基酸可以通過諸如遺傳工程技術(shù)，位點(diǎn)特異性突變誘導(dǎo)等公知的技術(shù)方法缺失，替換，添加和/或插入所述氨基酸序列中。
同樣，“包含糖鏈的替換，缺失和/或添加的HGF”是指，例如，(1)通過用酶對天然糖基化的HGF進(jìn)行處理從而去除糖鏈獲得的糖基化缺失的HGF，(2)其氨基酸序列在糖基化位點(diǎn)發(fā)生了突變從而抑制糖基化的HGF，或(3)其氨基酸序列以在不同于天然糖基化位點(diǎn)的位點(diǎn)發(fā)生糖基化的方式進(jìn)行突變的HGF。
此外，HGF還包括與HGF的氨基酸序列具有至少60％或更高同源性，優(yōu)選80％或更高同源性，更優(yōu)選90％或更高同源性，以及更優(yōu)選95％或更高同源性的蛋白質(zhì)，并且具有誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的活性。上述的氨基酸序列之間的“同源性”通常是指當(dāng)對所述蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較時(shí)，構(gòu)成氨基酸序列的氨基酸殘基之間的同源性水平。
只要其具有與天然HGF基本相同的作用，應(yīng)用于本發(fā)明中的HGF可以具有在其C末端的羧酸根(-COO-)，酰胺基(-CONH2)或酯基(-COOR)以及羧基(-COOH)。在本文中，涉及到通常用作口服給藥的酯等，可被低級烷基(例如，甲基，乙基，丙基，環(huán)戊基，苯甲基，苯乙基等)，芳基(例如，苯基，α-萘基等)，新戊?；跫谆芜x取代的酯中的R。此外，可用于本發(fā)明中的HGF可以包括在其N-末端的甲硫氨酸殘基的氨基被保護(hù)基團(tuán)(例如，諸如甲酰基，乙?；鹊孽；?保護(hù)的HGF，其中通過體內(nèi)對N-末端進(jìn)行剪切產(chǎn)生的谷氨?；兂山构劝彼岬腍GF等等。
在本發(fā)明中，“內(nèi)皮祖細(xì)胞”是指分化成內(nèi)皮細(xì)胞，主要是分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞。
因?yàn)楸景l(fā)明中的促進(jìn)誘導(dǎo)分化的制劑能夠加速誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成參與血管發(fā)生型血管新生或血管再生的內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞，所以其可被用于包括人的哺乳動(dòng)物(例如，牛，馬，豬，綿羊，狗，貓等)需要血管新生或血管再生疾病中。這些疾病包括，例如，下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥，心肌梗塞，缺血性小腸炎，缺血性結(jié)腸炎，腦梗死等。因?yàn)檠苄律蜓茉偕窃谥委煙齻騽?chuàng)傷的過程中觀察到的血管生成中的生理現(xiàn)象之一，所以本發(fā)明的誘導(dǎo)血管分化的制劑也可以用來治療燒傷和創(chuàng)傷。
此外，由于內(nèi)皮祖細(xì)胞分化成了內(nèi)皮細(xì)胞，因此可以參與受損血管內(nèi)皮的修復(fù)。因此，誘導(dǎo)血管分化的本發(fā)明制劑可用于與血管內(nèi)皮損傷相關(guān)的如下疾病中血管內(nèi)皮的修復(fù)和再生例如彌散性血管內(nèi)凝血；小血管中的血小板性血栓形成；血栓癥；動(dòng)脈硬化；糖尿病的動(dòng)脈硬化；由諸如抗腫瘤制劑(例如，doxorubin等)引起的血管內(nèi)皮損傷；由吸煙毒性引起的血管內(nèi)皮損傷；諸如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多肌炎和多動(dòng)脈炎的自身免疫疾??；由諸如淋巴瘤，白血病，胃癌等惡性腫瘤疾病的并發(fā)癥引起的血管內(nèi)皮損傷；由細(xì)菌或病毒感染或免疫接種引起的血管內(nèi)皮損傷。
用于促進(jìn)誘導(dǎo)血管分化的本發(fā)明的制劑可采用多種劑型，例如液體制劑，固體制劑，膠囊等，然而，通常都是單獨(dú)用HGF，或用HGF以及常規(guī)載體配制成注射劑，吸入劑，栓劑或口服給藥的制劑。上述注射劑可以是水性注射劑或油性注射劑。
在水性注射劑的情況下，可以下方式進(jìn)行制備將HGF溶于，例如，通過適當(dāng)?shù)貙⒅T如如下物質(zhì)的藥用載體加入水性溶劑(例如，可注射的水，純凈水等)制備的溶液中，然后按公知的方法將所述溶液經(jīng)過濾器等過濾，滅菌，并填充于無菌容器中等滲制劑(例如氯化鈉，氯化鉀，甘油，甘露醇，山梨醇，硼酸，硼砂，葡萄糖，丙二醇等)，緩沖液(例如，磷酸緩沖液，乙酸緩沖液，硼酸緩沖液，碳酸緩沖液，檸檬酸緩沖液，Tris緩沖液，谷氨酸緩沖液，ε-氨基己酸(aminocarproic)緩沖液等)，防腐劑(例如，對-羥苯甲酸甲酯，對羥苯甲酸乙酯，對-羥苯甲酸丙酯，對-羥苯甲酸丁酯，氯丁醇，苯甲醇，苯扎氯銨，脫氫乙酸鈉，乙二胺四乙酸鈉，硼酸，硼砂等)，增稠劑(例如，羥乙基纖維素，羥丙基纖維素，聚乙烯醇，聚乙二醇等)，穩(wěn)定劑(例如，亞硫酸氫鈉，硫代硫酸鈉，乙二胺四乙酸鈉，檸檬酸鈉，抗壞血酸，二丁基羥基甲苯等)，pH調(diào)節(jié)劑(例如，鹽酸，氫氧化鈉，磷酸，乙酸等)。此外，也可以使用諸如醇(例如，乙醇等)，多元醇(例如，丙二醇，聚乙二醇等)，或非離子表面活性劑(例如，聚山梨醇酯80，聚氧乙烯氫化蓖麻油50等)的適當(dāng)?shù)脑鋈軇?br> 在油性制劑的情況下，可將蓖麻油，大豆油等用作油性溶劑，并可將苯甲酸芐酯，苯甲醇等用作增溶劑。所得的可注射溶液通常填充于安瓿或小管中。在所述注射制劑中，HGF的含量一般調(diào)節(jié)為約0.0002-0.2W/V％，優(yōu)選為約0.001-0.1W/V％。優(yōu)選地可將諸如注射液的液體制劑在經(jīng)過冷凍保存或冷凍干燥去除水分后進(jìn)行保存。在使用之前，可將所述冷凍干燥的制劑在可注射用的蒸餾水中重新溶解。
在可口服給藥制劑的情況中，劑型包括，例如，片劑，粒劑，細(xì)粒劑，粉劑，膠囊，液劑，乳劑，懸劑，糖漿等。這些制劑可通過常規(guī)方法制備。在粒劑和片劑的情況中，可通過使用諸如賦型劑(例如，乳糖，白砂糖，葡萄糖，淀粉，結(jié)晶纖維素等)，潤滑劑(例如，硬脂酸鎂，滑石，硬脂酸，硬脂酸鈣等)，崩解劑(例如，淀粉，羧甲基纖維素鈉，碳酸鈣等)，粘合劑(例如，淀粉糊，羥丙基纖維素溶液，羧甲基纖維素溶液，阿拉伯樹膠溶液，明膠溶液，海藻酸鈉溶液等)等的藥用添加劑進(jìn)行制備。同樣，粒劑或片劑可用適當(dāng)?shù)陌聞?例如，明膠，白砂糖，阿拉伯樹膠，巴西棕櫚蠟等)，腸衣劑(例如，醋酸鄰苯二甲酸纖維素，甲基丙烯酸共聚物，鄰苯二甲酸羥丙基纖維素，羧甲基乙基纖維素等)等進(jìn)行包衣。
在膠囊的情況中，可以適當(dāng)?shù)剡x擇增強(qiáng)流動(dòng)性和潤滑性的諸如硬脂酸鎂，硬脂酸鈣，滑石和輕質(zhì)無水硅酸的公知賦型劑；在壓力下增加流動(dòng)性的結(jié)晶纖維素或乳糖；以及上述的崩解劑?？蓪GF與上述的賦型劑均勻地混合或成粒，或者可將所述顆粒用適當(dāng)?shù)陌聞┻M(jìn)行包衣，然后填充入膠囊中，或者可將所述顆粒用加入甘油，山梨醇等賦予塑性增加的膠囊基質(zhì)(例如，明膠)進(jìn)行封裝。如果需要，可向所述膠囊制劑中加入著色劑或防腐劑(例如，二氧化硫，對-羥苯甲酸甲酯，對羥苯甲酸乙酯，對-羥苯甲酸丙酯，對-羥苯甲酸丁酯等)。除了常規(guī)的膠囊制劑，所述膠囊制劑還可采用腸衣膠囊，抗胃酸的膠囊，控釋膠囊等形式。
在腸衣膠囊制劑的情況下，將用腸衣劑包衣的HGF，或加入了適當(dāng)賦型劑的HGF填充至常規(guī)的膠囊中?；蛘?，可將HGF單獨(dú)，或加入了上述適當(dāng)賦型劑的HGF封裝入腸衣膠囊，或封裝入由含有腸聚合物的基質(zhì)材料形成的膠囊中。
在糖漿的情況中，可適當(dāng)?shù)倪x擇并使用穩(wěn)定劑(例如，乙二酸四乙酸鈉等)，懸劑(例如，阿拉伯樹膠，羧甲基纖維素等)，矯正劑(例如，簡單糖漿，葡萄糖等)，香味劑等。
此外，可使用常規(guī)的栓劑基質(zhì)(例如，可可脂，月桂油，甘油明膠，大粒凝膠(macrpgol)，Witepsol等)通過常規(guī)的配置方法等制備栓劑。
再者，可采用常規(guī)的配制方法生產(chǎn)吸入制劑。在吸入制劑的配制中，可以采用任意的添加劑，只要其通常被應(yīng)用于吸入制劑中。例如，除了促進(jìn)劑，還可以使用以上所述的賦型劑，粘合劑，潤滑劑，防腐劑，穩(wěn)定劑，等滲劑，pH調(diào)節(jié)劑和矯正劑(例如，檸檬酸，薄荷醇，甘草酸銨，甘氨酸，香料等)。作為促進(jìn)劑，液化氣體促進(jìn)劑，壓縮氣體等也可以使用。液化氣體促進(jìn)劑包括，例如，諸如選擇性的含氯氟烴(例如，HCFC-22，HCFC-123，HCFC-134a，HCFC-142等)，液化石油醚，二甲醚等的氟化烴。所述壓縮氣體包括，例如，可溶性氣體(例如，二氧化碳?xì)怏w，一氧化二氮?dú)怏w等)和惰性氣體(例如氮?dú)獾?。
此外，用于本發(fā)明中的HGF可與生物可降解的聚合物一起配制成緩釋制劑。在HGF的緩釋制劑中，可以期待維持血液水平，減少給藥頻率，緩解副作用等的效果?？梢愿鶕?jù)，例如，在Drug DeliverySystem(藥物傳遞系統(tǒng))第3章1986(CMC出版，日本)中描述的常規(guī)方法制備這種緩釋制劑。用于本發(fā)明的生物可降解聚合物可適當(dāng)?shù)貜墓纳锟山到饩酆衔镏羞x擇，其包括，例如，多糖(例如，淀粉，葡聚糖，脫乙酰殼多糖等)，蛋白質(zhì)(例如，膠原，明膠等)，聚氨基酸(例如，聚谷氨酸，聚賴氨酸，聚亮氨酸，聚丙氨酸，聚甲硫氨酸等)，聚酯(例如，聚乳酸，聚乙醇酸，乳酸/乙醇酸聚合物或共聚物，聚己酸內(nèi)酯，聚β-羥基丁酸，聚蘋果酸，聚酸酐，延胡索酸-聚乙二醇-乙烯吡咯烷酮共聚物等)，聚(原酸酯)，聚烷基氰基丙烯酸(例如，聚甲基-α-氰基丙烯酸等)，聚碳酸酯(例如，聚碳酸亞乙烯酯，聚碳酸亞丙基酯等)，其中優(yōu)選聚酯，并更優(yōu)選聚乳酸，乳酸/乙醇酸聚合物或共聚物。當(dāng)使用聚乳酸/乙醇酸聚合物或共聚物時(shí)，在為期兩周至三個(gè)月的緩釋時(shí)間，優(yōu)選為兩周至一個(gè)月的情況中，乳酸/乙醇酸的成分比(mol％)為約100/0-50/50，盡管這樣的比例會(huì)隨緩釋時(shí)間的變化而變化。這些聚乳酸/乙醇酸聚合物或共聚物的平均分子量通常為5,000-20,000?？蓞⒄展姆椒ǎ鏙P-A-28521/1986描述的方法，制備聚乳酸/乙醇酸聚合物或共聚物。雖然對HGF與生物可降解聚合物的混合比例沒有限制，但一般而言，所使用的HGF與所述生物可降解聚合物的比例為約0.01W/W％至30W/W％。
根據(jù)所述劑型，適應(yīng)癥，疾病的程度，年齡等等，可對上述制劑中的HGF含量進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)。
本發(fā)明的促進(jìn)誘導(dǎo)血管分化的制劑可包含適當(dāng)?shù)钠渌t(yī)藥用活性成分，只要這些成分不與本發(fā)明的目的相抵觸。這些活性成分的實(shí)例包括，例如，冠狀血管擴(kuò)張藥(亞硝酸戊酯，硝酸異山梨醇酯(isosorbidnitrate)，硝化甘油，唑嘧胺(trapidil)等)，β-阻斷劑(例如，氧烯洛爾(oxprenolol)，山羊豆苷(carteolol)，布庫洛爾(bucumolol)，布非洛爾(bufetolol)，心得安(propranolol)，吲哚洛爾(pindolol)等)，鈣抗拮劑(例如，硫氮草酮(diltiazem)，戊脈安(verapamil)，硝苯吡啶(nifedipine)，硝苯芐胺啶(nicardipine)等)，用于外周循環(huán)病癥的制劑(例如，前列地爾(alprostadil)，阿法環(huán)糊精(alfadex)，舒血管素(kallidinogenase)，生育酚(tocopherol)，煙酸環(huán)己醇酯(nicomol)等)，抗心律失常藥(例如，adimarin，普魯卡因酰胺(procaineamide)，利多卡因(lidocaine)等)，降血壓劑(例如，速尿靈(furosemide)，三氯噻嗪(trichloromethiazide)，肼苯噠嗪(hydralazine)，交感神經(jīng)阻滯藥，鈣拮抗劑等)，抗血脂制劑(例如，安妥明(clofibrate)，帕伐他丁(pravastatin)，辛伐他汀(simvastatin)，洛伐他汀(lovastatin)，尼可莫爾(nicomol)等)，抗凝血?jiǎng)?例如，肝素，殺鼠靈(warfarin)，雙香豆素(dicumarol)，阿斯匹林等)，血栓溶解劑(例如，尿激酶等)，抗糖尿病制劑(例如，甲苯磺丁脲(tolbutamide)，氯磺丙脲(chlorpropamide)，acetahexamide，格列本脲(glibenclamide)，甲福明二甲雙胍(metformin)，阿卡波糖(acarbose)等)，抗炎藥(例如，雙氯高滅酸鈉(diclofenac sodium)，布洛芬(ibuprofen)，茚甲新(indomethacin)等)，抗生素(例如，頭孢克肟(cefixime)，頭孢地尼(cefdinir)，氧氟沙星(ofloxacin)，tosfloxacin等)，抗真菌藥(例如，氟康唑(fluconazole)，伊曲康唑(itraconazole)等)，等等。
同樣，含有這些活性成分的制劑可以與本發(fā)明的制劑組合使用。只要可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，對這些藥物活性成分就沒有限制，且可以適當(dāng)?shù)幕旌媳壤蚪M合比例對這些活性成分進(jìn)行使用。
根據(jù)其劑型，可通過適當(dāng)?shù)慕o藥途徑對本發(fā)明的促進(jìn)誘導(dǎo)血管分化的制劑進(jìn)行給藥。例如，可通過靜脈內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，皮下或肌內(nèi)等途徑注射給藥。注射劑量為通?；贖GF為0.001mg至1000mg，優(yōu)選0.01mg至100mg，其可以通過分開的方式，以每天一次或每天幾次的方式進(jìn)行適當(dāng)給藥，盡管可根據(jù)患者的病癥，年齡，體重等進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)。
本發(fā)明的促進(jìn)誘導(dǎo)血管分化的制劑可在體外用于促進(jìn)骨髓細(xì)胞分化成內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞。至于骨髓細(xì)胞，任意哺乳動(dòng)物包括人類的骨髓細(xì)胞都可以使用，雖然優(yōu)選使用游走的骨髓細(xì)胞。例如，可通過公知的方法收獲人骨髓細(xì)胞，將其懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中，接種于塑料培養(yǎng)皿中，并進(jìn)行培養(yǎng)從中僅收集游走細(xì)胞。隨后，將所述游走的骨髓細(xì)胞與本發(fā)明的促進(jìn)誘導(dǎo)血管分化劑共培養(yǎng)。至于細(xì)胞培養(yǎng)液，可以使用常規(guī)的培養(yǎng)液，例如，DMEM，MEM，RPMI1640，IMDM等。盡管可以向上述的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入諸如胎牛血清的常用于細(xì)胞培養(yǎng)的添加劑，從移植免疫學(xué)的方面考慮優(yōu)選地還是使用無血清的細(xì)胞培養(yǎng)液。在促進(jìn)誘導(dǎo)血管分化的制劑中，HGF的濃度為約1ng/mL至約100ng/mL。培養(yǎng)條件采用的是在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)中的條件，例如，在約35℃±2℃，5％二氧化碳存在的條件等。將如此培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞培養(yǎng)一至五周，使其分化成內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞。根據(jù)以上獲得的源自骨髓細(xì)胞的誘導(dǎo)分化的內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞可用作器官移植所需要的細(xì)胞。
更具體地，從患有下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥(arteriosclerotic obliterans)的患者的骨髓細(xì)胞分化和增殖的內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞可以，例如，對由下肢動(dòng)脈硬化性閉塞癥引起的患者肌體的壞死潰瘍部分進(jìn)行肌肉注射來進(jìn)行移植。根據(jù)這一過程，有可能從所述患者本身的骨髓細(xì)胞獲得大量患有下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥患者移植所需要的內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞。
此外，移植還包括另一實(shí)施方案，包括培養(yǎng)骨髓細(xì)胞，將所獲得的增殖、未分化的骨髓細(xì)胞作為用于移植的細(xì)胞，以及給受體施用本發(fā)明的促進(jìn)誘導(dǎo)血管分化的制劑。根據(jù)這一方法，由于從患有下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥患者收集的少量骨髓細(xì)胞可以被培養(yǎng)和增殖，而大量所得的骨髓細(xì)胞可以在施用本發(fā)明的促進(jìn)血管分化制劑的同時(shí)重新返回患者，因此可在所述患者體內(nèi)有效地發(fā)生誘導(dǎo)移植的骨髓細(xì)胞分化成內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞。
至于那些用于上述移植中的骨髓細(xì)胞，從移植免疫學(xué)的角度考慮，優(yōu)選那些從待移植的個(gè)體自身收集來的細(xì)胞。
近年來，已有關(guān)于使用HGF進(jìn)行基因治療的報(bào)道(參見Circulation，1997，vol.96，No.3459；Nature Medicine，1999，vol.5，p.226-230；Circulation，1999，vol.100，No.1672；Gene Therapy，2000，vol.7，p.417-427)，并建立了這種基因治療的技術(shù)。本發(fā)明包括基因治療方法，包括導(dǎo)入用于誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的HGF基因，以及施用上述HGF。下文將對HGF基因治療進(jìn)行詳細(xì)描述。
在本文中，“HGF基因”是指能夠表達(dá)HGF的基因。更具體地，本發(fā)明列舉了一種基因，其中HGF的cDNA被整合入合適表達(dá)載體(非病毒載體，病毒載體)中，如非專利文獻(xiàn)2；日本專利2,777,678；Biochem.Biophys.Res.Commun.，1989，vol.163，p.967；或Biochem.Biophys.Res.Commun.，1990，vol.172，p.321.所述。編碼HGF的cDNA堿基序列在以上文獻(xiàn)中已有描述，且也在諸如Genebank的數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行了注冊。根據(jù)以上序列數(shù)據(jù)，例如，可以通過使用適當(dāng)?shù)腄NA片段作為PCR引物，對來自肝臟等的mRNA進(jìn)行RT-PCR，從而進(jìn)行HGF的cDNA克隆。本領(lǐng)域技術(shù)人員基于諸如Molecular Cloning，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版(1989)的基礎(chǔ)書籍可以很容易完成這樣的克隆。
此外，用于本發(fā)明中的HGF不僅限于上述的基因，任意的HGF基因都可以用作本發(fā)明的HGF基因，只要其表達(dá)與HGF具有基本相同活性的蛋白質(zhì)。換言之，在可與上述cDNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的DNA，和編碼由上述cDNA所編碼的氨基酸序列中一至多個(gè)氨基酸(優(yōu)選幾個(gè)氨基酸)被替換，缺失，添加和/或插入的蛋白質(zhì)的DNA中，任意編碼具有HGF活性的蛋白的DNA都包含在本發(fā)明所使用的HGF基因的范圍中。這樣的DNA可方便地通過常規(guī)的雜交方法，PCR方法等獲得，尤其是參考諸如上述的Molecular Cloning的基礎(chǔ)文獻(xiàn)。
應(yīng)用于本發(fā)明中HGF基因可采用與上述HGF蛋白相同的方式施用，用來誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成肺泡細(xì)胞。
當(dāng)給患者施用含有作為活性成分的HGF基因的基因治療劑時(shí)，可以采用諸如在Basic Technology of Gene Therapy，Separate Volume ofExperimental Medicine published by Yodosha，日本，1996；GeneIntroduction and Expression Analysis Method，Separate Volume ofExperimental Medicine，Yodosha出版，日本，1997；Gene TherapyDevelopment Research Handbook，edited by The Japan Society of GeneTherapy，NTS出版，日本，1999中描述的常規(guī)方式進(jìn)行這種施用。
劑型可包括多種適用于上述每種給藥方式的公知形式。根據(jù)患者的目標(biāo)疾病，年齡和體重等，可以對所述制劑中的DNA含量進(jìn)行適當(dāng)?shù)目刂?，通常，本發(fā)明中的DNA含量為0.0001至100mg，優(yōu)選為0.001至10mg。
此外，HGF基因和HGF可以各自獨(dú)立地使用或組合使用。
下面，通過以下實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行說明，但并非是對本發(fā)明的限制。除非另有說明，百分?jǐn)?shù)(％)是指重量百分?jǐn)?shù)％。
實(shí)施例1受體小鼠在日本大阪大學(xué)，建立了轉(zhuǎn)有增強(qiáng)綠色熒光蛋白(GFP)的C57BL/6轉(zhuǎn)基因小鼠品系。根據(jù)Morishita等人在Hypertension，1999，vol.33，p.1379-1384中的描述，將收集到的13.5天GFP胚胎的胎肝的肝細(xì)胞移植入在移植前用12Gy劑量輻射過的C57BL/6雄性小鼠體內(nèi)。移植三周之后，超過95％的循環(huán)白細(xì)胞(外周白細(xì)胞)都完全被GFP小鼠來源的骨髓細(xì)胞所替換的那些小鼠被用作該實(shí)驗(yàn)中的受體小鼠。
肺毛細(xì)血管損傷的誘導(dǎo)和治療向受體小鼠鼻內(nèi)灌注豬胰腺彈性蛋白酶(200單位/kg，Sigma，StLouis，MO)。彈性蛋白酶灌注三周之后，所述受體小鼠在其肺部表現(xiàn)出了肺氣腫，并觀察到了受損的肺毛細(xì)管。此時(shí)，將誘導(dǎo)成肺氣腫的受體小鼠隨機(jī)分成兩組，即介質(zhì)給藥組和HGF給藥組，對這兩組小鼠分別進(jìn)行腹膜內(nèi)注射均衡飲食和每天一次，每次1mg/kg的劑量的HGF，共12天。
組織學(xué)解剖在20cm H2O的壓力下，使用4％的低聚甲醛-PBS(磷酸緩沖鹽水)對所述受體小鼠的肺進(jìn)行固定，根據(jù)常規(guī)方法制備石蠟包塊切片，用蘇木精-曙紅(HE)對石蠟切片染色。使用抗-GFP抗體(Abcam，劍橋，英國)檢測GFP并用3，3’-二氨基聯(lián)苯胺顯色。
為了鑒定GFP-陽性細(xì)胞的表型，可使用抗-CD34和抗-CD45抗體(Pharmingen，圣迭戈，加利福尼亞州)對所述冷凍切片進(jìn)行免疫熒光染色。
使用具有抗-Sca-1包衣微珠的磁細(xì)胞分揀系統(tǒng)(Miltenvi Biotec，Bergisch Gladbach，德國)對從每只小鼠收集到的Sca-1+外周血細(xì)胞(得自骨髓細(xì)胞的表面抗原)進(jìn)行分離。使用FACS Calibur(自動(dòng)細(xì)胞分析和分揀裝置，BD，圣何塞，加利福尼亞州)進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)，在所分離到的Sca-1+外周血中測定內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞分布，其中作為血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGF)之一的Sca-1和Flk-1的表達(dá)可用作指數(shù)。使用熒光素異硫氰酸酯標(biāo)記的抗Sca-1抗體檢測Sca-1，而使用藻紅蛋白(熒光紅色素)標(biāo)記的抗-Flk-1抗體(Pharmingen)可以檢測Flk-1。
結(jié)果在肺毛細(xì)血管受損的受體小鼠中Flk-1陽性細(xì)胞的分布如圖1所示。與對照組[HGF(-)]相比，HGF給藥組[HGF(+)；灰線]中的整個(gè)細(xì)胞分布都向右遷移。該結(jié)果說明Flk-1陽性細(xì)胞，即內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞在HGF給藥組中有所增加。
在對受體小鼠的肺組織切片觀察中發(fā)現(xiàn)，在接受彈性蛋白酶的受體小鼠的肺毛細(xì)管受到破壞，而在HGF給藥組中，可以觀察到肺毛細(xì)管幾乎與沒有接受彈性蛋白酶的對照組的受體小鼠的肺毛細(xì)管具有基本相同的程度(參見圖2)。通過免疫熒光染色對所述受體小鼠進(jìn)行的組織學(xué)觀察結(jié)果說明，在HGF給藥組中的肺毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞是從GFP-小鼠的骨髓細(xì)胞分化而來的(參見圖3)。
這樣的結(jié)果說明從骨髓細(xì)胞分化而來的內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞可進(jìn)一步被誘導(dǎo)分化成新的再生肺毛細(xì)血管。
實(shí)施例2方法從每只小鼠獲得總共0.5-1.0ml外周血。通過Ficoll-Hypaque密度梯度(Lymphosepal；IBL，Gunma，日本)分離出外周血單核細(xì)胞(PBMC)。使用RBC裂解緩沖液(0.15M NH4Cl，0.01M KHCO3，0.1mM EDTA-2Na，pH 7.2)去除紅細(xì)胞。用FITC標(biāo)記的抗鼠Sca-1抗體(BD Pharmingen，圣迭戈，加利福尼亞州)，PE標(biāo)記的抗鼠胎肝激酶1/血管內(nèi)皮生長因子受體2(Flk-1/VEGF-R2)(BD Pharmingen)和APC標(biāo)記的抗c-kit抗體(BD Pharmingen)對與外周EPC一致的Sca-1+/Flk-1+/c-kit+細(xì)胞進(jìn)行染色，并使用FACSCalibur(BD，圣何塞，加利福尼亞州)進(jìn)行分析。
結(jié)果與鹽水處理的小鼠相比，HGF處理使得含有EPC類群的PBMC的數(shù)量有所增加。在HGF處理小鼠中，循環(huán)的Sca-1+/Flk-1+/c-kit+細(xì)胞的數(shù)目有所增加(表1)。這些結(jié)果說明HGF誘導(dǎo)了從骨髓進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的，與EPC表型一致的，外周Sca-1+/Flk-1+/c-kit+細(xì)胞數(shù)量的增加，且肺實(shí)質(zhì)也因此接受了更多來自骨髓的祖細(xì)胞。
表1在鹽水處理和HGF處理小鼠中PBMC和Sca-1+/Flk-1+/c-kit+細(xì)胞的數(shù)量

所示值為平均值±SEM×105細(xì)胞/ml。*表示與鹽水處理的小鼠有顯著性差異(P＜0.05)。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的促進(jìn)誘導(dǎo)血管分化的制劑可用作促進(jìn)誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的醫(yī)用制劑。因?yàn)槭褂眠@樣的內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生血管新生或血管再生，所以本發(fā)明的促進(jìn)誘導(dǎo)血管分化的制劑可應(yīng)用于再生藥物的領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.促進(jìn)誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化成內(nèi)皮祖細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞的制劑，包括作為活性成分的肝細(xì)胞生長因子。
全文摘要
本發(fā)明提供了促進(jìn)誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞向能夠分化成內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行分化的制劑，包括作為活性成分的肝細(xì)胞生長因子，且這樣的制劑可應(yīng)用于藥物療法或再生藥物領(lǐng)域中。
文檔編號A61K38/18GK1929856SQ20058000743
公開日2007年3月14日 申請日期2005年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月9日
發(fā)明者久保裕司, 石沢興太, 佐佐木英忠, 中村敏一 申請人:株式會(huì)社東北宏橋技術(shù), 克霖固魯制藥股份有限公司