專利名稱：針對活性肝生長因子激活劑的特異抗體和應(yīng)用該抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于特異地檢測活性肝細(xì)胞生長因子激活劑(HGFA)的抗體或單克隆抗體，應(yīng)用該抗體的方法和檢測試劑盒。本發(fā)明還涉及用活性的HGFA作為指示以檢測具有病理癥狀患者的疾病，特別是器官炎癥，腎小球腎炎，癌癥，心絞痛，心肌梗塞或血栓溶解的方法，并進(jìn)一步涉及收集適宜實施該方法的生物組分和血液的方法。
已知肝生長因子激活劑(此后簡寫為“HGFA”)是一種絲氨酸蛋白酶，在其活性中心有一絲氨酸殘基(Miyazawa等人.，生物化學(xué)雜志，268，pp.10024-10028，1993)。與包含于凝血/纖維蛋白溶解作用系統(tǒng)級聯(lián)體中的一般血液蛋白酶不同，HGFA具有作用于肝生長因子(此后簡寫為“HGF”)的獨有特性，已知肝生長因子是與肝細(xì)胞生長或器官再生相關(guān)的細(xì)胞因子(Naka等人，生物化學(xué)雜志267，pp.20114-20119，1992)，HGFA特異地且有限地分解HGF并由此激活它(Shimomura等人.，細(xì)胞技術(shù)，8，pp.219-229(1992))。但是，對于HGFA的作用，僅在用大鼠進(jìn)行的動物模型實驗或體外實驗(Miyazawa等人.，生物化學(xué)雜志，271，pp3615-3618，1996)中其對HGF的激活作用是已知的，HGFA在人病理條件下的作用和功能，以及其在血液中的水平與病理學(xué)癥狀之間的關(guān)系都不清楚。
對于HGFA，已知其中一個由SDS-PAGE確定的分子量約為96,000-98,000(此后簡寫為“98kDa HGFA”)，一個是分子量約為34,000-38,000(此后簡寫為“36kDa HGFA”)，后者是對該蛋白從翻譯起始氨基酸起算第372位的精氨酸和第373位的纈氨酸之間的鍵進(jìn)行有限的蛋白水解而得到的位于該蛋白C末端一側(cè)的肽。分子量的變化是由糖鏈結(jié)合量的異質(zhì)性引起的，而所測得的分子量的數(shù)值上的差異是由于SDS-PAGE測定是分別在還原或非還原條件下進(jìn)行而造成的，它們實質(zhì)上是相同的蛋白。而且，每一HGFA通常是作為非活性底物存在于血液中，但對其在從翻譯起始氨基酸起算第407位的精氨酸和第408位的異亮氨酸之間的鍵進(jìn)行有限的蛋白水解，可將其激活，從而使單鏈的HGFA轉(zhuǎn)化成由二硫鍵異源二聚體化的雙鏈HGFA。據(jù)認(rèn)為這一激活的HGFA可以特異地激活底物HGF(Shimomura等人.，生物化學(xué)雜志.，268，pp.22927-22932，1993)。
為分析HGFA血液水平和病理學(xué)癥狀之間的關(guān)系，存在于生物組分如人體組織，體液或血液中的活性HGFA需經(jīng)特異地測定。而且為特異地檢測或測定活性HGFA，必須獲得一種抗體，特別優(yōu)選的極為特異地識別活性的HGFA，而基本上不識別非活性的HGFA單克隆抗體。但任何具有此種特性的抗體至今未見報道。而且，沒有特異地用于檢測存在于生物組分，如人體血液中的活性HGFA的方法或試劑盒。
發(fā)明概述據(jù)此，本發(fā)明的一個目的是提供一種抗體，其可特異地識別活性的HGFA，而基本上不識別非活性的HGFA，一種應(yīng)用上述抗體檢測活性HGFA的方法，以及檢測與活性HGFA相關(guān)疾病的方法和試劑盒。
本發(fā)明的發(fā)明人構(gòu)建了一個對血液中的HGFA進(jìn)行定量的系統(tǒng)，用以分析血液中HGFA的水平和有關(guān)人體病理學(xué)癥狀的多種人類疾病之間的關(guān)系。首先，他們用已知的針對HGFA的現(xiàn)有的鼠單克隆抗體7E10，P1-4，A-1，A-6，A-23，A-32，A-51，A-75通過雙抗夾層方法(酶聯(lián)免疫吸附分析，此后簡寫為“ELISA檢測系統(tǒng)”)構(gòu)建了酶標(biāo)抗體檢測系統(tǒng)(Miyazawa等人.，生物化學(xué)雜志.，271，pp 3615-3618，1996)。而且，他們分析了在健康的供試者和具有多種疾病，包括器官疾病的患者血液(血漿和血清)中HGFA單克隆抗體的反應(yīng)性。但是用這些單克隆抗體通過ELISA檢測系統(tǒng)檢測，發(fā)現(xiàn)在包括正常供試者在內(nèi)的所有人體血樣中都呈現(xiàn)出一致的強反應(yīng)性，而沒有對人類疾病特異的反應(yīng)性，也就是說，沒有檢測到HGFA血液水平標(biāo)志性的變化。因此，本發(fā)明的發(fā)明人分析了目前存在的針對HGFA的單克隆抗體的對HGFA反應(yīng)性，以探究其中原因。
首先，由于存在兩種形式的HGFA，活性形式和非活性形式，因此分析了針對每一種HGFA的單克隆抗體對HGFA的反應(yīng)性。更特別地，將活性的和非活性的HGFA粘附于一個固相的盤中，分析了每種單克隆抗體與粘附于固相盤中的HGFA之間的反應(yīng)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些單克隆抗體具有與活性HGFA和非活性HGFA均起反應(yīng)的特性。這些結(jié)果表明，用目前存在的單克隆抗體通過ELISA檢測系統(tǒng)，檢測到了通常大量恒定存在于血液中的非活性的HGFA(Shimomura等人.，生物化學(xué)雜志.，268，pp.22927-22932，1993)，或同時檢測到痕量的活性HGFA和非活性HGFA。從而發(fā)現(xiàn)，用目前存在的單克隆抗體通過ELISA檢測系統(tǒng)根本不能揭示HGFA和人類疾病之間的關(guān)系。
其后，注意到HGFA存在兩種形式的事實，即活性形式和非活性形式，本發(fā)明的發(fā)明人特異地檢測到了激活狀態(tài)的HGFA存在于人的活體中，并檢測了多種人類疾病與具有這些疾病的患者血液中活性HGFA數(shù)量之間的關(guān)系。通過他們的辛勤工作，第一次成功地生產(chǎn)出了僅識別活性HGFA而基本上不識別非活性HGFA的多克隆抗體和單克隆抗體。而且，他們研究出了與存在于人體生物組分中的活性HGFA起反應(yīng)，而基本不與非活性的HGFA起反應(yīng)的方法和試劑盒，即用上述抗體通過免疫分析的方法特異地檢測活性HGFA的方法和試劑盒。
而且本發(fā)明人第一次發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用本發(fā)明的特異地檢測活性的HGFA方法和試劑盒時，可以觀察到與健康的供試者相比，具有器官紊亂的患者，包括腎小球腎炎患者和癌癥患者的血液中，活性HGFA的量顯著提高。而且他們還第一次發(fā)現(xiàn)，以血液中活性HGFA量升高為指示可以精確地預(yù)測血栓的形成，例如心絞痛，心肌梗塞和腦梗塞。
同時，檢測了存在于包括人體血液在內(nèi)的生物組分中的活性HGFA的量后，即需要一種具有良好再現(xiàn)性的方法，以穩(wěn)定地收集存在于其中的活性HGFA。本發(fā)明的發(fā)明人檢測了在這一方法中添加多種蛋白酶抑制劑等，發(fā)現(xiàn)通過添加一種選擇性的凝血酶抑制劑阿戈托班可以非常穩(wěn)定地測定出活性的HGFA，并具有良好的再現(xiàn)性。而且許多詳盡研究的結(jié)果表明即使將人體血液例如全部血液，血漿和血清的收集起來，阿戈托班也是有效的，在血液組分中用含枸櫞酸鹽的血漿可以獲得非常良好的結(jié)果。
本發(fā)明是在以上的發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上完成的，并提供下述內(nèi)容(1)識別活性肝生長因子激活劑(HGFA)而基本上不識別非活性的HGFA的抗體。
(2)如(1)所述的抗體，其對活性HFGA的解離常數(shù)為1×10-8M或更低。
(3)如(1)或(2)所述的抗體，其是單克隆抗體。
(4)如(3)所述的抗體，其識別由SDS-PAGE方法確定的分子量約為34,000-98,000的活性HGFA，而基本上不識別非活性的HGFA。
(5)如(4)所述的抗體，其識別由SDS-PAGE方法確定的分子量約為34,000-38,000的活性HGFA。
(6)如(4)所述的單克隆抗體，其由保藏號為FERM BP-7779的雜交瘤產(chǎn)生。
(7)識別活性HGFA而基本上不識別非活性的HGFA的單克隆抗體，所述的活性HGFA是通過非活性的HGFA在從翻譯起始氨基酸起算第407位的精氨酸和第408位的異亮氨酸之間進(jìn)行有限的蛋白水解從而將其激活而獲得的，所述非活性HGFA是活性HGFA的前體。
(8)識別活性HGFA而基本上不識別非活性的HGFA的單克隆抗體和活性HGFA與蛋白酶抑制劑的復(fù)合物。
(9)產(chǎn)生如(3)到(8)中任意一項的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
(10)測定活性HGFA的方法，包括用一種或多種依照(1)到(8)中任意一項中所述的抗體的免疫學(xué)方法特異性測定活性HGFA的步驟。
(11)如(10)項中所述的方法，其中待檢測活性HGFA的樣品是由疑有某種疾病的供試者或?qū)嶒瀯游镏惺占纳锝M分。
(12)如(11)項中所述的方法，其中所述疾病是器官炎癥，腎小球腎炎，癌癥，心肌梗塞，心絞痛，腦梗塞或血栓形成。
(13)檢測疾病的方法，包括檢測或測定由懷疑具有某種疾病的供試者收集的生物組分中的活性HGFA的步驟。
(14)如(13)項中的方法，其中所述疾病選自下面的組，該組包括器官炎癥，腎小球腎炎，癌癥，心肌梗塞，心絞痛，腦梗塞和血栓形成。
(15)如(13)或(14)項所述方法，其中生物組分是血液或其組分或其加工產(chǎn)品。
(16)如(15)項所述方法，其中的生物組分是血漿。
(17)如(16)項所述的方法，其中所述血漿為含枸櫞酸鹽的血漿。
(18)如(13)到(17)中任意一項的方法，其中將阿戈托班加入到生物組分中。
(19)檢測或測定活性HGFA的試劑盒，其中包括一種或多種如(1)到(8)項中任意一項所述的抗體。
(20)如(19)項所述的試劑盒，其用于診斷選自下列組中的疾病，該組包括器官炎癥，腎小球腎炎，癌癥，心肌梗塞，心絞痛，腦梗塞或血栓形成。
(21)如(19)或(20)項所述的試劑盒，檢測或測定由懷疑具有某種疾病的供試者收集的生物組分中的活性HGFA。
(22)如(19)到(21)項中任意一項所述的試劑盒，其中活性的HGFA通過免疫染色的方法進(jìn)行檢測或測定。
(23)用于收集血清，血漿或全部血液的血液收集管，其中加入阿戈托班。
(24)如(23)項所述的血液收集管，其收集用于活性HGFA測定的血清，血漿或全部血液。
在本說明書中，識別活性HGFA而基本上不識別非活性的HGFA的單克隆抗體指“活性HGFA特異性的單克隆抗體”，識別活性HGFA而基本上不識別非活性的HGFA的多克隆抗體指“活性HGFA特異性的多克隆抗體”。而且這些抗體總的稱為“活性HGFA特異性的抗體”?！白R別活性HGFA”是指通過抗原/抗體相互作用結(jié)合于活性HGFA，優(yōu)選地指對HGFA的解離常數(shù)為1×10-8M或更低，更優(yōu)選1×10-9M或更低。
“基本上不識別非活性的HGFA”是指基本上不通過抗原/抗體相互作用與非活性的HGFA結(jié)合。更特異地，“基本上不識別非活性的HGFA”是指非活性的HGFA不能通過常規(guī)的免疫分析檢測到，對非活性的HGFA的解離常數(shù)為1×10-5M或更高。
能根據(jù)本發(fā)明，其提供了特異結(jié)合于活性HGFA而基本上不與非活性的HGFA相結(jié)合的單克隆抗體和多克隆抗體。本發(fā)明所述的抗體可用于特異地檢測或測定活性HGFA。
本發(fā)明中特異地測定活性HGFA的方法可以用于診斷多種與活性HGFA在血液中的水平有關(guān)的疾病。
附圖簡要描述

圖1示出了單克隆抗體對活性HGFA和非活性HGFA的反應(yīng)性。
圖2示出活性HGFA與蛋白酶抑制劑的復(fù)合物與單克隆抗體之間的反應(yīng)性。
圖3示出由活性HGFA測定系統(tǒng)測定的活性HGFA和非活性HGFA與單克隆抗體之間的反應(yīng)性。圖3A示出HGFA的濃度在0-500ng/ml的范圍。在圖3B中，對圖3A中所示的0-55.6ng/ml的HGFA濃度范圍的放大。
圖4示出健康供試者血清中活性HGFA的量的頻率分布圖。
圖5示出在血清，枸櫞酸鹽血漿，肝素血漿和EDTA血漿中活性HGFA的儲存穩(wěn)定性的值，以及添加了阿戈托班的效果。
發(fā)明的詳細(xì)描述以下詳細(xì)闡述本發(fā)明。<1>免疫原和篩選用以生產(chǎn)抗活性HGFA的特異抗體的抗原本發(fā)明所用術(shù)語“活性HGFA”是指具有將其底物肝細(xì)胞生長因子(HGF)由非活性的單鏈HGF形式(Naka等人，生物化學(xué)雜志26720114-20119(1992))轉(zhuǎn)化成為活性的雙鏈HGF形式的能力的物質(zhì)。單鏈HGF指去除由HGF基因翻譯所得的蛋白前體上的信號肽后所得的蛋白，而雙鏈HGF是指異源二聚體，該異源二聚體是從翻譯起始氨基酸起算第494位的精氨酸和第495位的纈氨酸之間進(jìn)行有限的蛋白水解所形成的兩條鏈，經(jīng)二硫鍵異源二聚體化形成的。HGFA的活性是指將非活性的單鏈HGF轉(zhuǎn)化成活性的雙鏈HGF的活性。
活性HGFA特異地包括通過從翻譯起始氨基酸起算第407位的精氨酸和第408位的異亮氨酸之間進(jìn)行有限的蛋白水解而激活在日本公開待審專利申請(Kokai)No.6-153946所公開的HGFA前體蛋白而獲得的HGFA。通過SDS-PAGE測定這一活性蛋白通常的分子量約為34,000-98,000，而且已知活性的HGFA是通過N端部分進(jìn)行有限的蛋白水解而獲得的，因此表現(xiàn)為多種分子量(Mitsubishi Kasei R & D Review，8(1)，26-35(1994))。作為這樣的HGFA的例子有由還原條件下的SDS-PAGE方法測定分子量約為98,000的一種，與從翻譯起始氨基酸起算第88位的精氨酸和第89位的丙氨酸之間進(jìn)行有限的蛋白水解而獲得的C末端相對應(yīng)并且顯示HGFA的分子量為80,000的一種，與從翻譯起始氨基酸起算第372位的精氨酸和第373位的纈氨酸之間進(jìn)行有限的蛋白水解而獲得的C末端側(cè)肽相對應(yīng)并且顯示HGFA的分子量為36,000的一種。依所結(jié)合的糖鏈的量的異質(zhì)性，以及分子量的測定方法和純化方法的不同，前面提到的分子量為98,000的活性HGFA，其分子量可在約96,000到98,000的范圍，前面提到的分子量為36,000的活性HGFA，其分子量可在約34,000到38,000的范圍。因此，這里所指的活性HGFA并為其分子量所限，而是包含了那些對底物HGF具有激活作用的分子。
可依照Shimomura等人，生物化學(xué)雜志26822927-22932(1993))所述的方法等，用從人體血液純化的那些活性的或非活性的HGFA用作篩選單克隆抗體等的免疫原。而且，也可以利用由日本公開待審專利申請(Kokai)Nos.6-153966和6-153946，US5466593和US5677164公開的HGFA的cDNA和微生物例如大腸桿菌，及昆蟲細(xì)胞，酵母，動物細(xì)胞或動物所獲得的重組蛋白HGFA。
為了獲得對活性HGFA特異的抗體，具體說來，需要制備不含非活性HGFA的高純度活性HGFA和不含活性HGFA的高純度非活性HGFA作為免疫抗原或篩選用抗原。為了這些目的，優(yōu)選地使用由HGFA的cDNA獲得的重組蛋白作為本發(fā)明中所使用的活性HGFA和非活性HGFA。例如，重組蛋白可通過下述方法獲得，該方法包括將由日本公開待審專利申請(Kokai)Nos.6-153946公開的編碼全長或部分HGFA前體的HGFA cDNA插入合適的載體，將此載體引入微生物例如大腸桿菌，昆蟲細(xì)胞，酵母，動物細(xì)胞或動物，然后對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液，細(xì)胞內(nèi)容物，組織或體液進(jìn)行純化。
也可以不用細(xì)胞系統(tǒng)，而采用快速翻譯系統(tǒng)RTS 500(羅氏診斷)之類的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)來生產(chǎn)靶HGFA。
具體地說，可以用將編碼655個氨基酸的HGFA cDNA插入動物細(xì)胞表達(dá)載體啟動子下游所獲得的表達(dá)載體的方法，上述cDNA序列相應(yīng)于日本公開待審專利申請(Kokai)Nos.6-153946公開的包括信號肽序列的全長非活性HGFA前體；或應(yīng)用通過將合適的信號肽序列與編碼HGFA前體從翻譯起始氨基酸起算第373位的纈氨酸起的C末端部分的cDNA相連接所獲得的動物細(xì)胞表達(dá)載體的方法，上述的cDNA由日本公開待審專利申請(Kokai)Nos.6-153966所公開；或通過將合適的信號肽序列與編碼有發(fā)揮HGFA活性的能力的區(qū)域的cDNA相連接，所獲得的動物細(xì)胞表達(dá)載體的方法。HGFA重組蛋白可以通過下述方法獲得，即將上述任何一種表達(dá)載體引入動物細(xì)胞，然后選擇表達(dá)HGFAcDNA的細(xì)胞，在從細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中純化所需HGFA。
通過上述方法獲得的HGFA重組蛋白一般為非活性的HGFA?？梢詤⒖糞himomura等人.(生物化學(xué)雜志.，26822927-22932(1993))的方法，向非活性的HGFA中添加適量的凝血酶和葡聚糖硫酸脂或血管舒緩素和凝血酶來激活這種非活性的HGFA。通過凝膠過濾或用HPLC進(jìn)行親和層析進(jìn)行純化可以提高用上述方法激活的HGFA的純度。
經(jīng)純化的高純度活性HGFA和非活性HGFA不僅作為免疫原是重要的，其在通過親和純化選擇對活性HGFA特異的多克隆抗體或篩選對活性HGFA特異的單克隆抗體時也是非常重要的物質(zhì)。
作為本發(fā)明的發(fā)明人詳盡研究的結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)純化的非活性的HGFA非常不穩(wěn)定，通過摻入少量雜質(zhì)可以將其激活。若這樣使用摻有活性HGFA的非活性HGFA，或相反，使用摻有非活性HGFA的活性HGFA，將很難獲得對活性HGFA特異的多克隆抗體或?qū)钚訦GFA特異的單克隆抗體。因此，本發(fā)明的發(fā)明人研究了多種蛋白酶抑制劑作為制備非活性HGFA時防止人工激活作用的抑制劑。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)添加阿戈托班(Mitsubishi-Tokyo Pharmaceuticals)十分有效，阿戈托班是對HGFA選擇性的凝血酶抑制因子。也就是說，在純化非活性的HGFA或篩選單克隆抗體時，向非活性的HGFA中添加阿戈托班可以防止人工激活作用及活性HGFA的污染。用這種方法制備的活性HGFA，適宜作為在制備對活性HGFA特異的抗體的免疫學(xué)作用中的抗原，也可用作選擇和純化可識別活性HGFA而基本上不識別非活生的HGFA的抗體的材料。
另一方面，非活性的HGFA適合于作為制備可識別非活性的HGFA而基本上不識別活性HGFA的抗體的免疫反應(yīng)中的抗原，而且它可以用作選擇，吸收或去除除可識別活性HGFA而基本上不識別非活性HGFA的抗體之外的抗體的物質(zhì)。
可以用一種位于表現(xiàn)出活性HGFA和非活性HGFA之間一級結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)序列不同或構(gòu)象不同的位點的肽作為用于制備對活性HGFA特異的抗體的免疫反應(yīng)的抗原或篩選用抗原。例如，可以采用在僅暴露于活性HGFA蛋白表面而不暴露于非活性的HGFA蛋白表面的位點的肽。這樣的蛋白構(gòu)象通?？捎杀绢I(lǐng)域的技術(shù)人員所預(yù)測，其三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)也可以在活性和非活性的HGFA的氨基酸序列的基礎(chǔ)上通過計算機程序描繪出來。通過對兩種構(gòu)象進(jìn)行比較可以發(fā)現(xiàn)作為表現(xiàn)出對活性HGFA具有特異的反應(yīng)性的抗體結(jié)合位點的區(qū)域(抗原位點)，并將通過合成該區(qū)域的部分氨基酸序列所獲得的肽用作免疫原。
而且，也可能發(fā)現(xiàn)一個區(qū)域，該區(qū)域作為表現(xiàn)活性和非活性的HGFA之間不同的位點，上述不同為二者親水性或疏水性不同，基于Cho-Fasman方法或Robson方法等對其二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果不同，或基于用蛋白結(jié)構(gòu)分析軟件，例如GENETYX(SOFTWARE開發(fā)公司)對HGFA的氨基酸序列進(jìn)行分析的信息表明其抗原性不同，并可以將通過合成該區(qū)域的部分氨基酸序列所獲得的肽用作免疫原或篩選抗原。例如，活性的HGFA有通過在從翻譯起始位點起算第407位的精氨酸和第408位的異亮氨酸之間進(jìn)行有限的蛋白水解HGFA前體蛋白所獲得的氨基酸序列。另一方面，非活性的HGFA的氨基酸序列中第407位的精氨酸和第408位的異亮氨酸是相連的。因此，僅存在于活性的HGFA中，而不存在于非活性的HGFA中的氨基酸序列，即含第407位的精氨酸作為C末端的和幾個氨基酸存在于其N末端的肽可以被利用。下述是作為這種肽可選擇的例子。序列2到12的氨基酸序列是相應(yīng)與從序列1(SEQ ID NO1)N端進(jìn)行氨基酸殘基逐個缺失所形成的序列。
序列1GRRHKKRTFLRPR序列2 RRHKKRTFLRPR序列3 RHKKRTFLRPR序列4 HKKRTFLRPR序列5KKRTFLRPR序列6 KRTFLRPR序列7 RTFLRPR序列8 TFLRPR序列9FLOPR序列10LOPR
序列11 OPR序列12 PR另外，作為僅存在于活性HGFA中而不存在于非活性HGFA中的氨基酸序列，即含第408位的異亮氨酸作為其N末端和氨基酸存在于其C末端的肽，下述是可以選擇的例子。序列14到24的氨基酸序列是相應(yīng)與從序列13(SEQ IDNO2)C端進(jìn)行氨基酸殘基逐個缺失所形成的序列。
序列13IIGGSSSLPGSHP序列14IIGGSSSLPGSH序列15IIGGSSSLPGS序列16IIGGSSSLPG序列17IIGGSSSLP序列18IIGGSSSL序列19IIGGSSS序列20IIGGSS序列21IIGGS序列22IIGG序列23IIG序列24II另外，作為僅存在于非活性HGFA中而不存在于活性HGFA中的氨基酸序列，即含從翻譯起始位點起算，HGFA前體的第407位的精氨酸和第408位的異亮氨酸(序列25的第13和14位之間)相連的氨基酸序列的肽，例如序列25(SEQ ID NO3)是可選擇的。
序列25GRRHKKRTFLRPRIIGGSSSLPGSHP當(dāng)這些肽作為免疫作用的抗原時，通常期望利用那些結(jié)合于作為載體的蛋白或多聚體上，例如KLH(匙孔血藍(lán)蛋白)，BSA(牛血清白蛋白)和OVA(卵清白蛋白)的肽作為免疫作用的抗原。例如，可以合成包含序列1到12之一的肽，在其N末端添加半胱氨酸，包含序列13到24之一的肽，在其C末端添加半胱氨酸，包含序列25的肽，在其N末端或C末端添加半胱氨酸，與Imject馬來酰亞胺激活的載體蛋白(PIERCE)相連接，用作免疫作用的抗原。
而且，也可以用由相應(yīng)于序列1到25中任意一序列的cDNA與作為載體蛋白的cDNA相連接的cDNA編碼的融合蛋白，用遺傳工程的方法在多種細(xì)胞中表達(dá)包含由上述的兩部分編碼的肽的融合蛋白，并純化融合蛋白。包含序列1到24中任何一項的肽適于作為獲得對活性HGFA特異的抗體的免疫作用的抗原，也可以用作選擇和純化對活性HGFA特異的抗體的物質(zhì)。另一方面，類似序列25所示的肽適于作為獲得可識別非活性HGFA而基本上不識別活性HGFA的抗體的免疫作用的抗原，也可以用作吸收或去除除對活性HGFA特異的抗體之外的抗體的物質(zhì)。<2>識別活性HGFA而基本上不識別非活性的HGFA的單克隆抗體的生產(chǎn)為了獲得對活性HGFA特異的單克隆抗體抗體，經(jīng)常使用的免疫學(xué)方法是用前述的活性HGFA作為免疫反應(yīng)的抗原。例如，使用活性的98kDa HGFA，活性的36kDa HGFA，或二者的混合物。
而且，用上述的方法將含序列1到24中任意序列的肽與載體融合，一種或多種這樣的物質(zhì)可以混合起來用作免疫反應(yīng)的抗原。而且，可以使用含活性HGFA的特定抗原位點的肽。
用于免疫反應(yīng)的動物無需特別限定，兔，山羊，綿羊，小鼠，大鼠，豚鼠，雞等的任何一種均可使用。用于免疫反應(yīng)的抗原與弗氏完全佐劑、弗氏非完全佐劑等充分混合，然后通過皮下，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)方式接種于動物。每2到5周進(jìn)行一次接種，連續(xù)進(jìn)行直到所免疫動物體內(nèi)針對所接種抗原的抗體效價足夠高。然后僅將抗原通過靜脈內(nèi)方式注射于所免疫的動物，三天后，收集據(jù)認(rèn)為包含抗體產(chǎn)生細(xì)胞的脾和淋巴結(jié)，再將脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合。其后分離由細(xì)胞融合(雜交瘤)無限增殖的抗體生成細(xì)胞。雖然這里所用的腫瘤細(xì)胞與所制備的脾細(xì)胞或淋巴細(xì)胞應(yīng)源于同種的被免疫動物，但也可以用異種動物的腫瘤細(xì)胞。
可使用的腫瘤細(xì)胞的例子包括，骨髓瘤細(xì)胞例如p3(p3/x63-Ag8)，P3U1，NS-1，MPC-11，SP 2/0，F(xiàn)O，x63.6.5.3，S194和R210?？梢酝ㄟ^普通的方法進(jìn)行細(xì)胞融合，可依照例如“單克隆抗體實驗手冊”(Kodansha Scientifec，1987)中所述的方法進(jìn)行?？赏ㄟ^向懸浮有待融合細(xì)胞的融合培養(yǎng)基中添加細(xì)胞融合促進(jìn)劑進(jìn)行細(xì)胞融合。細(xì)胞融合促進(jìn)劑的例子包括仙臺病毒，平均分子量為1000到6000的聚乙二醇等。此種情況下，為進(jìn)一步提高融合效率還可以向融合培養(yǎng)基中添加輔助物質(zhì)，例如二甲亞砜，細(xì)胞因子，如IL-6等。至于腫瘤細(xì)胞與所免疫的脾細(xì)胞或淋巴細(xì)胞的混合比例，例如所使用的脾細(xì)胞或淋巴細(xì)胞的量可約10倍于相關(guān)腫瘤細(xì)胞。
對于前述的融合培養(yǎng)基，可以使用多種常用的培養(yǎng)基，如ERDF培養(yǎng)基，RPMI-1640培養(yǎng)基和MEM培養(yǎng)基，且在融合過程中一般應(yīng)從培養(yǎng)基中去除血清，如胎牛血清(FBS)。融合是通過下述方式進(jìn)行的，將預(yù)定量的用于上述免疫反應(yīng)的脾細(xì)胞或淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞在上述培養(yǎng)基中充分混合，添加約20％到50％量的預(yù)先保溫于約37℃的聚乙二醇，優(yōu)選地使其在30℃到37℃反應(yīng)約1分鐘到10分鐘。此后，重復(fù)進(jìn)行下列操作偶爾添加合適的培養(yǎng)基，離心培養(yǎng)基和去除上清。
靶雜交瘤在常規(guī)的選擇培養(yǎng)基，例如HAT培養(yǎng)基(含次黃嘌呤，氨基蝶呤，胸腺嘧啶脫氧核苷的培養(yǎng)基)中培養(yǎng)。培養(yǎng)物需在這種HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間，足以使除雜交瘤之外的細(xì)胞(非融合細(xì)胞等)被殺死，通常需要幾天到幾周。對于獲得對活性HGFA特異的單克隆抗體，技術(shù)上最關(guān)鍵的一點是其篩選?？梢杂们笆龅奈镔|(zhì)，如活性的HGFA和非活性的HGFA，通過多種免疫學(xué)方法進(jìn)行分析，來篩選產(chǎn)生對活性HGFA特異的單克隆抗體的雜交瘤。例如，可以通過活性或非活性的HGFA作為用于篩選的抗原，通過諸如ELILSA，Western印跡分析等酶免疫測試方法分析用于篩選的抗原與分泌于雜交瘤培養(yǎng)物上清液中的單克隆抗體的結(jié)合來篩選靶雜交瘤。
具體地說，活性HGFA附著于篩選平皿之類物體上，所述平皿用BSA之類封閉，然后加入上述的雜交瘤培養(yǎng)物上清液來篩選可分泌識別活性HGFA的抗體的雜交瘤。將所選出的雜交瘤加入附著于用BSA之類封閉的篩選平皿之類的物體上的非活性的HGFA，進(jìn)一步篩選能分泌不識別這一非活性HGFA的抗體的雜交瘤。例如，用于篩選的雜交瘤的培養(yǎng)物上清液加入進(jìn)行ELISA且附著有活性HGFA和非活性HGFA的平皿中，使其反應(yīng)，經(jīng)過充分洗滌操作后，向平皿中加入抗鼠IgG多克隆抗體進(jìn)一步反應(yīng)。清洗后，通過檢測標(biāo)記來篩選雜交瘤，該雜交瘤培養(yǎng)物上清液表現(xiàn)出對附著有活性HGFA的平皿有反應(yīng)性而對附著有非活性的HGFA的平皿沒有反應(yīng)性?？蛇x用多種酶，熒光底物，化學(xué)發(fā)光底物，放射性同位素，生物素，抗生物素蛋白等作為標(biāo)記，這將在后面進(jìn)行描述。
通過上述篩選，可以獲得產(chǎn)生識別活性HGFA而基本上不識別非活性HGFA的單克隆抗體的雜交瘤。而且，在篩選這種雜交瘤的過程中，可用與含上述的序列1到24中任一序列的肽反應(yīng)而不與含序列25的肽反應(yīng)的抗體作為標(biāo)記。對于通過這種方式篩選出的雜交瘤所產(chǎn)生的抗體，優(yōu)選地進(jìn)一步確證該抗體與活性HGFA反應(yīng)而不與非活性的HGFA反應(yīng)。
上述抗體的反應(yīng)性可通過測定其對活性或非活性HGFA的解離常數(shù)來確證。本發(fā)明的抗體對活性HGFA的解離常數(shù)優(yōu)選地為1×10-8M或更低，更優(yōu)選1×10-9M或更低。對非活性HGFA的解離常數(shù)優(yōu)選地為1×10-5M或更高。
所獲得的雜交瘤可以通過有限稀釋的方法克隆，以獲得產(chǎn)生單一種類單克隆抗體的雜交瘤克隆。這一雜交瘤克隆在添加了約1-5％已預(yù)先去除了其中的牛抗體的FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，或在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所獲得的培養(yǎng)物上清液可作為純化靶單克隆抗體的粗提物。進(jìn)而，可將所獲得的雜交瘤轉(zhuǎn)入預(yù)先用降植烷醇處理過的Balb/C小鼠或Balb/c小鼠(nu/nu)的腹腔內(nèi)，10到14天后抽提含高濃度單克隆抗體的腹水，用其作為純化靶單克隆抗體的粗提物。對于純化單克隆抗體的方法，可以用常規(guī)的純化免疫球蛋白的方法，可通過下述方法進(jìn)行，例如硫酸銨分級分離，聚乙烯分級分離，乙醇分級分離，離子交換層析，用蛋白A或蛋白G進(jìn)行親和層析等。<3>識別活性HGFA而基本上不識別非活性的HGFA的多克隆抗體的制備為獲得對活性HGFA特異的多克隆抗體，可以用活性HGFA或非活性的HGFA作抗原進(jìn)行免疫反應(yīng)，從源于所免疫動物的多克隆抗體中純化識別活性HGFA而基本上不識別非活性的HGFA的抗體。
而且，作為為了獲得多克隆抗體的免疫反應(yīng)的抗原，可以應(yīng)用上述包含對非活性HGFA特異的抗原位點的肽和載體的融合物。例如，一種或多種與載體蛋白或多聚體化合物相融合且含序列1到25中任意一序列的肽的物質(zhì)可以混合用作免疫反應(yīng)的抗原。用于免疫反應(yīng)的動物并沒有特別的限定，兔，山羊，綿羊，小鼠，大鼠，豚鼠，雞等中的任意一種均可使用。用于免疫反應(yīng)的抗原與弗氏完全佐劑、弗氏非完全佐劑等充分混合，然后通過皮下，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)方式接種于動物。每2到5周進(jìn)行一次接種，連續(xù)進(jìn)行直到所免疫動物體內(nèi)相對所接種抗原的抗體效價足夠高。然后僅將抗原通過靜脈內(nèi)方式注射于所免疫的動物，3到5天后，收集抗血清。
從所得抗血清中純化多克隆抗體的方法，可以用常規(guī)的純化免疫球蛋白的方法，可通過下述方法進(jìn)行例如，硫酸銨分級分離，聚乙烯分級分離，乙醇分級分離，離子交換層析，用蛋白A或蛋白G進(jìn)行親和層析等。
獲得活性HGFA特異的多克隆抗體的純化操作可以以任意的方法進(jìn)行，只要該方法可以分級分離或或純化識別活性HGFA而基本上不識別非活性HGFA的多克隆抗體，這樣的方法的例子包括，如離子交換層析，疏水層析，分子篩層析，反向?qū)游?，羥基磷灰石層析，親和層析，凝膠電泳，免疫電泳等。作為一種特異的方法，可以提及的是用固定有活性或非活性的HGFA的樹脂進(jìn)行的親和柱層析。例如用上述的方法獲得的多克隆抗體作為粗提物，用固定有活性或非活性的HGFA的樹脂進(jìn)行的親和層析。通過這種方法收集存在于非吸附組分中的不與非活性的HGFA結(jié)合的多克隆抗體。然后，這一非吸附組分用作進(jìn)行用固定有活性HGFA的樹脂進(jìn)行的親和柱層析的粗提物，由此收集存在于吸附組分中的結(jié)合于活性HGFA的多克隆抗體。
通過這些方法可以獲得對活性HGFA特異的多克隆抗體。而且，另一種親和層析方法，也可以用包含據(jù)認(rèn)為是對活性HGFA抗原位點特異性氨基酸序列的肽。例如，可以用結(jié)合有序列1到25中一種或幾種肽的樹脂進(jìn)行親和層析。例如結(jié)合有含序列1到24中任一序列的肽的樹脂可以用作純化活性HGFA特異性多克隆抗體的親和層析的固定化載體。另一方面，結(jié)合有序列25的肽等的樹脂可用作吸收或去除除對活性HGFA特異的抗體之外的抗體的親和層析的固定化載體。<4>特異地測定活性HGFA的方法特異地測定活性HGFA的方法是指，一種方法包括使對活性HGFA特異的抗體與活性HGFA反應(yīng)的步驟。因此這是一種以測定活性HGFA而基本上不測定非活性HGFA為特征的方法。這一方法可用作多種診斷方法，測定方法和分析方法，其中可以用本發(fā)明的對活性HGFA特異的抗體對生物樣品中的活性HGFA進(jìn)行定性或定量的測定。只要該方法是以檢測活性HGFA為目的，對這樣的方法并沒有其它特別的限定。這樣的方法的例子包括，如特異的檢測活性HGFA的組織染色法和免疫沉淀法，特異檢測活性HGFA的競爭結(jié)合分析法，直接或間接夾層分析法，雙抗夾層分析法等。而且，檢測方法的例子還包括酶免疫分析法，放射免疫分析法，熒光免疫分析法，化學(xué)發(fā)光免疫分析法，免疫印記法，免疫層析法，乳膠凝集法等等。
免疫印記應(yīng)用的例子包括那些應(yīng)用結(jié)合于微陣列或芯片上的對活性HGFA特異的抗體的方法。也可以用熒光標(biāo)記物標(biāo)記對對活性HGFA特異的抗體，用熒光去極化的方法或熒光相關(guān)差異法檢測其與活性HGFA的相互作用。也可以通過用表面胞質(zhì)團諧振裝置測定對活性HGFA特異的抗體與活性HGFA之間的相互作用。例如可以定量測定生物組分中活性的HGFA將含活性HGFA的生物組分流加到附著有該抗體的傳感芯片的表面胞質(zhì)團諧振裝置，并示蹤反應(yīng)信號隨時間的變化。
本方法中所用特異性測定活性HGFA的抗體，例如一種活性HGFA特異性抗體，可按自身使用，也可用作通過常規(guī)木瓜蛋白酶處理得到Fab形式的抗體，或者以通過胃蛋白酶處理得到的F(ab′)2或F(ab′)形式，進(jìn)一步說，一種具有識別活性HGFA而基本上不識別無活性HGFA特性的抗體片段也屬本發(fā)明的保護(hù)范圍。這樣的片段包括，例如一種包含一個互補決定子區(qū)(CDR)或在活性HGFA特異性抗體等等的重鏈和輕鏈可變區(qū)域高變區(qū)的片段雙抗體夾層測定法用于定量測定生物組分中活性HGFA可以是以下例子一種特異性測定活性HGFA的方法包括(1)反應(yīng)步驟，該步驟使含有一種或幾種活性HGFA特異性抗體的試劑與樣品中活性HGFA反應(yīng)以形成免疫反應(yīng)產(chǎn)物，(2)分離步驟，分離免疫反應(yīng)產(chǎn)物然后使其與標(biāo)記的能夠識別免疫反應(yīng)產(chǎn)物所含的HGFA的抗體反應(yīng)，和(3)測定步驟，測定與免疫反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)合的標(biāo)記抗體量，或一種特異性測定活性HGFA的方法包括(1)反應(yīng)步驟，使包含活性HGFA和一種或幾種活性HGFA特異抗體作為初級抗體的試劑與樣品中活性HGFA反應(yīng)，以形成免疫反應(yīng)產(chǎn)物，(2)分離步驟，分離免疫反應(yīng)產(chǎn)物然后使其與能夠識別免疫反應(yīng)產(chǎn)物中HGFA的二級抗體反應(yīng)，(3)分離步驟，分離免疫反應(yīng)產(chǎn)物然后使其與能夠識別免疫反應(yīng)產(chǎn)物中標(biāo)記的二級抗體反應(yīng)，和(4)測定步驟，測定與免疫反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)合的標(biāo)記抗體量。
進(jìn)一步的，活性HGFA特異性多克隆抗體或HGFA特異性單克隆抗體通過常規(guī)手段固定在固體相例如微量滴定板孔以及磁性微珠上，作為初級抗體，然后用小牛血清，脫脂牛奶，明膠等等阻斷固相表面的過量蛋白結(jié)合位點，然后加入帶有活性HGFA的生物組分，以在固相表面形成免疫反應(yīng)產(chǎn)物，再清洗固相表面。然后加入可識別HGFA的標(biāo)記多克隆抗體或標(biāo)記單克隆抗體，作為二級抗體進(jìn)行反應(yīng)。在這種情況下，當(dāng)單克隆抗體被用作初級抗體，帶有區(qū)別于初級抗體抗原決定部位的標(biāo)記活性HGFA特異性單克隆抗體可以作為二級抗體。然后，清洗后，可以測定標(biāo)記抗體的量，來測定生物組分中活性HGFA的量。
標(biāo)記所使用的多克隆抗體或單克隆抗體可以用酶，如堿性磷酸酶辣根過氧化物酶，β-半乳糖苷酶，脲酶和葡萄糖氧化酶，或一種熒光物質(zhì)，如熒光素衍生物和羅丹明衍生物。而且，標(biāo)記可以是化學(xué)發(fā)光物質(zhì)如吖啶酯或放射性同位素如125I，3H，14C和32P。就是說，本發(fā)明包括通過測定發(fā)光物質(zhì)，熒光物質(zhì)，化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或放射性的方法，定量測定生物組分中活性HGFA的量。本發(fā)明還包括一種方法，該方法包括生物素化二級抗體和檢測與抗生物素蛋白形成復(fù)合物的堿性磷酸酶，辣根過氧化物酶，β-半乳糖苷酶，脲酶和葡萄糖氧化酶，熒光素衍生物和羅丹明衍生物，化學(xué)發(fā)光物質(zhì)如吖啶酯或放射性同位素如125I，3H，14C和32P。(5)特異性測定或染色活性HGFA的試劑盒一種活性HGFA特異性測定試劑盒或一種活性HGFA特異性染色試劑盒是用于診斷特點為測定或檢測活性HGFA的疾病的試劑盒。所用術(shù)語“特異性”是指當(dāng)測定或檢測活性HGFA時，無活性的HGFA不影響活性HGFA的測定值或檢測值。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)通過測定活性HGFA，可診斷或預(yù)測病理狀況下的病人，如器官紊亂患者例如腎小球腎炎，腎炎，肝炎，胰腺炎，肺炎，腸炎和胃炎，癌癥患者，帶有血栓形成癥狀的病人，如心絞痛，心肌梗塞，大腦梗塞。所以，通過測定或檢測活性HGFA可以診斷以上所提及的各種不同疾病。本發(fā)明中，只要當(dāng)試劑盒是用于診斷疾病的一種活性HGFA特異性測定試劑盒，構(gòu)成本試劑盒的材料以及用來制造該試劑盒的方法并無特別局限。
進(jìn)一步說，試劑盒的例子包括那些使用電泳，HPLC，各種柱層析技術(shù)，各種陣列和芯片，表面胞質(zhì)基因共振儀等等測定或檢測活性HGFA來診斷疾病的試劑盒。更進(jìn)一步說，還可涉及一種試劑盒，該試劑盒采用利用抗體的免疫方法用于測定或檢測活性HGFA。所述抗體至少是一種或幾種以上提及的可識別活性HGFA而基本上不識別無活性HGFA的抗體。
例如當(dāng)本發(fā)明試劑盒是基于雙抗體夾層技術(shù)，試劑盒可以是一種特異性測定活性HGFA的試劑盒，用于包括以下步驟的方法(1)反應(yīng)步驟，使包括活性HGFA和一種或幾種活性HGFA特異性抗體的試劑與樣品中活性HGFA反應(yīng)，形成免疫反應(yīng)產(chǎn)物，(2)分離步驟，分離免疫反應(yīng)產(chǎn)物，然后使其與標(biāo)記的可識別免疫反應(yīng)產(chǎn)物中HGFA的抗體反應(yīng)，和(3)測定步驟，測定與免疫反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)合的標(biāo)記抗體量，或一種特異性測定活性HGFA的試劑盒，用于包括以下步驟的方法(1)反應(yīng)步驟，使包括一種或幾種活性HGFA特異性抗體的試劑作為初級抗體與樣品中活性HGFA反應(yīng)，以形成免疫反應(yīng)產(chǎn)物，(2)分離步驟，分離免疫反應(yīng)產(chǎn)物，使其與可識別免疫反應(yīng)產(chǎn)物中活性HGFA的二級抗體反應(yīng)，以形成一種免疫反應(yīng)產(chǎn)物，(3)分離步驟，分離免疫反應(yīng)產(chǎn)物，然后使其與可識別免疫反應(yīng)產(chǎn)物中二級抗體的標(biāo)記抗體反應(yīng)，和(4)測定步驟，測定結(jié)合到免疫反應(yīng)產(chǎn)物上的標(biāo)記抗體量。
該試劑盒包括至少一種活性HGFA特異性單克隆抗體或一種活性HGFA特異性多克隆抗體，還可進(jìn)一步包括檢測或測定活性HGFA方法所需的部分。所需的部分可包括活性HGFA或無活性HGFA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，酶，底物等等。試劑盒中單克隆抗體或多克隆抗體可以是用酶或類似物標(biāo)記的抗體，或者試劑盒可包括一個識別上述抗體的標(biāo)記抗體。更進(jìn)一步的，試劑盒可包括不同的緩沖液，稀釋抗原的溶液，稀釋反應(yīng)混合物的溶液，底物溶液，停止反應(yīng)的溶液等等。試劑盒還可包括檢測和定量測定活性HGFA所需的聯(lián)接標(biāo)記和封閉物質(zhì)的容器。一個合適的容器的例子包括玻璃或不同塑料材料如聚丙烯，聚苯乙烯，聚碳酸酯，尼龍和特氟隆。試劑盒優(yōu)選包括描述一種檢測或測定活性HGFA的方法建議，該方法與上述檢測或測定活性HGFA物質(zhì)及容器一同使用。
(6)與人類疾病相關(guān)的活性的HGFA抗體及其使用方法通過使用活性HGFA特異性抗體的本發(fā)明方法和試劑盒，病理狀況下的患者中收集得到生物組分中活性HGFA可被檢測出來甚至進(jìn)行定量測定。所用檢測活性HGFA的生物物質(zhì)并無特別限定，任何組織，血清，血漿，尿液，漿液，脊髓液，抽提組織等等都可在適當(dāng)?shù)念A(yù)處理后使用。通過檢測或定量測定從病理狀況下患者中收集得到生物組分中存在的活性HGFA，就可診斷，預(yù)測疾病或測知疾病的進(jìn)程。疾病可包括器官紊亂如腎小球腎炎，腎炎，肝炎，胰腺炎，肺炎，腸炎和胃炎；癌癥；血栓形成如心絞痛，心機梗塞，大腦梗塞等等。
腎炎的例子進(jìn)一步包括腎小球系膜增生性腎病，IgA腎病，膜性增生性腎小球腎炎，膜性腎病，多發(fā)性腎小球硬化，急性腎衰竭，鏈球菌感染后急性腎小球腎炎，慢性和急性間質(zhì)性腎炎，腎病并發(fā)癥等等。心絞痛和心肌梗塞包括穩(wěn)定性勞累心絞痛，非穩(wěn)定性心絞痛，急性心肌梗塞，慢性心肌梗塞和穩(wěn)定性心絞痛，還可以得知經(jīng)過冠狀介入，經(jīng)食管心回波描記術(shù)，末端動脈旁路手術(shù)或主動脈囊泵患者以及急性主動脈剖開等等患者的病理狀況或預(yù)后狀況。
更進(jìn)一步的，由于活性HGFA特異性抗體可以特異性抑制活性HGFA，可用做由活性HGFA引起疾病的藥物治療手段。例如，活性HGFA具有作用于無活性HGF從而將其激活的性質(zhì)，所以，抑制活性HGFA活性的抗體抑制生物活體中活性HGF分泌量的增加，可被用做活性HGF導(dǎo)致疾病的治療或預(yù)防藥物(WO96/38557；Genentech Incorporated，”HGF的分子醫(yī)學(xué)”，醫(yī)學(xué)綜述，1998)，例如，各種癌癥如胃癌，肺癌，結(jié)腸癌，脾癌和肝癌及其轉(zhuǎn)移瘤等，各種腎炎如腎小球腎炎等等。
抑制活性HGFA(單克隆抗體P1-4)的小鼠單克隆抗體的存在是由Miyazawa等人。(生物化學(xué)雜志.，2713615-3618(1996))披露的，本發(fā)明發(fā)明者通過研究闡明這個P4-1抗體與活性HGFA和無活性HGFA兩者都起反應(yīng)。由于無活性HGFA在生物體內(nèi)大量存在，可認(rèn)為需要極端大量的P4-1抗體才能抑制活性HGFA的活性。另一方面，由于本發(fā)明中活性類型特異性抗體被認(rèn)為是抑制活性HGFA活性的抗體，可以認(rèn)為作為藥物，只需少量就可以對上述疾病起到良好的治療效果。
針對這個目的，優(yōu)選采用遺傳工程技術(shù)人化的抗體。抗體的人化可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法，例如，日本(Tokuhyo)公開國際專利No.11-506327披露的方法等等。
(7)用于測定活性HGFA的血樣采集方法和血樣采集試管雖然檢測或測定活性HGFA的生物組分沒有特殊限制，通常是血液或其成分或其加工產(chǎn)物，但希望生物組分可以從容器方便收集，如血液，血清，血漿如檸檬酸鈉血漿，肝素血漿和EDTA血漿，其成分或其加工產(chǎn)物或尿液。在收集和儲存生物組分過程中，尤其是防止生物樣品中無活性HGFA人為地轉(zhuǎn)換成活性HGFA的操作是很必要的。例如，需要將收集到的血清或血漿，尿液等等應(yīng)該立即放入低溫環(huán)境如在冰水中冷卻。
進(jìn)一步地，為快速收集容器中的血液，血漿，檸檬酸鈉血漿，肝素血漿和EDTA血漿，需要使用血液收集試管。尤其是，用于檢測或測定活性HGFA的血液特別優(yōu)選的是血漿狀態(tài)，特別是檸檬酸鈉血漿，進(jìn)一步地，一種向用于檢測或測定活性HGFA生物組分中加入不同蛋白酶抑制劑的方法也是優(yōu)選的。例如阿戈托班，一種選擇性的凝血酶抑制劑，如果將其加入收集生物樣品以防止生物組分中無活性HGFA在生物組分收集或儲存過程中人為地轉(zhuǎn)化成活性HGFA，則取得了良好效果。特別優(yōu)選使用預(yù)先加入阿戈托班的試管來收集血液，血清，血漿，檸檬酸鈉血漿，肝素血漿和EDTA血漿。
(8)篩選活性HGFA蛋白酶抑制劑的方法通過使用識別活性HGFA的抗體，該抗體基本上不識別無活性HGFA，也不能識別活性HGFA和蛋白酶抑制劑的復(fù)合物，作用于活性HGFA的蛋白酶抑制劑可以被篩選出來。
一種帶有上述性質(zhì)的抗體可通過進(jìn)一步從活性HGFA特異性抗體中選擇一種不識別活性HGFA和蛋白酶抑制劑復(fù)合物的抗體來實現(xiàn)。
上述篩選方法特異性地包括，例如(1)混合步驟，將活性HGFA和一種蛋白酶抑制劑候選化合物混合，使其反應(yīng)，(2)向活性HGFA和蛋白酶抑制劑候選化合物的復(fù)合物中加入識別無活性HGFA但基本上不識別活性HGFA和蛋白酶抑制劑復(fù)合物的單克隆抗體的步驟，和(3)分離免疫反應(yīng)產(chǎn)物，然后測定由活性HGFA和蛋白酶抑制劑候選化合物復(fù)合物和抗體構(gòu)成的免疫反應(yīng)產(chǎn)物的減少量。
關(guān)于檢測免疫反應(yīng)產(chǎn)物減少量的方法，可以用酶免疫法，放射性免疫法，熒光免疫法，化學(xué)發(fā)光免疫法，電化學(xué)發(fā)光免疫法，免疫印記法，免疫層析法，膠乳黏結(jié)法，應(yīng)用免疫印記的微陣列法，和應(yīng)用熒光去極化法的方法，熒光聯(lián)系方差法或表面胞質(zhì)基因共振儀。例如，可以通過在表面胞質(zhì)基因共振儀中流動生物樣品，隨時間追蹤反應(yīng)信號的變化來篩選蛋白酶抑制劑，該共振儀帶有傳感器芯片，芯片上結(jié)合有能夠識別活性HGFA并且基本上不識別無活性HGFA以及不識別活性HGFA與蛋白酶抑制劑混合物的抗體。
本方法所用抗體可以本身使用，也可作為Fab形式的抗體使用，該形式是通過常規(guī)木瓜蛋白酶處理而得到的，或者以F(ab′)2或F(ab′)形式的抗體使用，該形式是通過胃蛋白酶處理得到的。進(jìn)一步，帶有本方法所用抗體性質(zhì)的抗體片段也可使用。
本發(fā)明最佳實施方式本發(fā)明可參考以下實施例進(jìn)一步解釋。但是本發(fā)明的范圍并不局限于這些實施例1制備無活性HGFA和活性HGFA無活性HGFA是通過使用編碼HGFA前體的HGFA cDNA來制備，該HGFA前體如日本待審專利公開號No.6-153946中所述，所用方法見日本待審專利公開號No.6-153966中重組無活性HGFA的制備。就是說，編碼全長度無活性HGFA前體的HGFA cDNA，655個氨基酸，按常規(guī)手段插入pcDNA3.1(Invitrogen)中CMV啟動子的下游，該pcDNA3.1是一種動物細(xì)胞表達(dá)載體。
得到的表達(dá)載體根據(jù)所附的說明使用Transfectam(BioSepra)導(dǎo)入CHO細(xì)胞，該細(xì)胞是起源于中國倉鼠卵巢細(xì)胞的一種動物細(xì)胞系。然后，表達(dá)HGFA cDNA的CHO細(xì)胞通過存在于被導(dǎo)入的表達(dá)載體上新霉素抗性基因特性被選擇出來。那即是說，選出在5％CO2，37℃條件下，在含有400μg/ml新霉素和5％小牛血清的ERDF培養(yǎng)基(Kyokuto Seiyaku)上能夠生長的細(xì)胞。進(jìn)一步，選出的表達(dá)HGFA cDNA的CHO細(xì)胞在含有100μM甲磺酸萘莫司他，400μg/ml新霉素和5％小牛血清的ERDF培養(yǎng)基上培養(yǎng)約10天，得到約5L培養(yǎng)上清液。
在過濾得到的培養(yǎng)上清液，加入含有10mM EDTA，10mM苯甲脒，100μM甲磺酸萘莫司他的蛋白酶抑制劑，大豆胰蛋白酶抑制劑和1000KIU/ml抑肽酶并進(jìn)一步加入0.5M醋酸鹽緩沖液(pH4.5)來調(diào)節(jié)培養(yǎng)上清液pH值到約5.8。將該培養(yǎng)上清液加到含有100mM NdCl磷酸鈉緩沖液(pH7.5)的50mM醋酸鹽緩沖液(pH5.5)平衡過的硫酸化Cellofine柱(Seikagaku Corporation)，并用含100mM NaCl的50mM乙酸鹽緩沖液(pH5.5)洗脫，然后，用50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)洗脫以得到無活性HGFA成分，該磷酸鈉緩沖液含有500mMNaCl，0.05％CHAPS(3-[(3-膽汁酰氨基丙基)二甲氨基]丙烷磺酸)。
得到的成分在含有150mM NaCl的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中透析，上樣A6單克隆抗體親和柱(Shimomura等人.，生物化學(xué)雜志，26822927-22932，1993)，再用50mM甘氨酸-HCl緩沖液(pH3.0)洗脫。得到的無活性HGFA成分緩沖液用含有100mM NaCl和0.05％CHAPS的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)代替。成分的一部分加入蛋白酶抑制劑阿戈托班，使其終濃度為40μM并作為無活性HGFA在-40℃保存。另一方面，未加入阿戈托班的無活性HGFA以1/100HGFA重量比率加入血漿舒血管素和凝血酶，在37℃下充分反應(yīng)以得到活性36kDa HGFA。
進(jìn)一步的，在未加入阿戈托班的無活性HGFA中按1/100的重量比率加入凝血酶，以及10μg/ml葡聚糖硫酸酯，然后37℃反應(yīng)20分鐘，得到活性98kDaHGFA。通過使用A6單克隆抗體親和柱層析再次純化每種活性HGFA成分，Asahipak GS520HQ柱(Showa Denko)進(jìn)行HPLC，該柱已用含有100mM NaCl和0.05％CHAPS的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.3)平衡，然后以活性36kDa HGFA和98kDa HGFA形式保存于-40℃。
實施例2制備ELISA板篩選活性HGFA特異性單克隆抗體將實施例1中制得活性36kDa HGFA或活性98kDa HGFA用生理鹽水配制的磷酸氫鹽緩沖液(PBS(-))稀釋至終濃度為1μg/ml，作為抗原來篩選雜交瘤，96-孔板每孔中加入100μl該溶液，4℃保存24小時，以使每種抗原都被吸附到96-孔板上。去除抗原吸附板上的溶液，然后每孔中加入250μl含5％小牛血清白蛋白的PBS(-)(以下簡寫為BSA)，再4℃過夜(約12小時)或37℃保存2小時或更長以封閉板，然后，將該板作為篩選活性HGFA的ELISA板保存在4℃。
分別的，實施例1中制備的無活性HGFA用PBS(-)稀釋到終濃度為1μg/ml作為抗原篩選雜交瘤，然后，向96孔板中的每一孔加入100μl該溶液，4℃保存24小時使抗原可吸附在96孔板上，去除抗原吸附板上的溶液，再在每孔中加入250μl含有5％小牛血清白蛋白的PBS(-)(以下簡寫為“BSA“)，4℃過夜(約12小時)或37℃保存2小時或更長以封閉板，然后，該板作為篩選無活性HGFA的ELISA板保存在4℃。這些ELISA板中的封閉液在使用前迅速去除。
實施例3制備活性HGFA特異性單克隆抗體實施例1中制得的含有100μ36kDa HGFA或100μg98kDa HGFA的溶液，對Bal b/c小鼠以皮下或腹腔方式給藥，并且與等體積的完全弗氏估劑一起給藥，每次給藥間隔兩周，共給藥六次，當(dāng)確定小鼠血清內(nèi)已產(chǎn)生抗體后，尾部血管給藥含有100μgHGFA的溶液，三天后，取出脾臟，利用聚乙二醇1500將脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞P3U1進(jìn)行融合，所用方法參見“單克隆抗體試驗手冊”(Kodansha Scientific，1987)，再將細(xì)胞加入到96孔板的孔中，加入HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)14天。
接下來，選擇出在培養(yǎng)基中產(chǎn)生相應(yīng)活性HGFA特異性的單克隆抗體雜交瘤，就是說，將選擇出的雜交瘤培養(yǎng)上清液加入到ELISA板，用于篩選實施例2中制得的36kDa HGFA或活性98kDa HGFA，分析培養(yǎng)上清液中單克隆抗體的反應(yīng)性。將選出的雜交瘤培養(yǎng)上清液以100μl/孔的量加入到ELISA板中，以篩選每種活性類型，并在4℃反應(yīng)2小時或更長。
然后，用含有0.05％吐溫20的PBS(-)溶液(以下簡寫為“PBST溶液”)充分洗滌該板，再向每孔中加入100μl含有1μg/ml HRP(辣根過氧化物酶)結(jié)合的羊抗鼠IgG/Fc多克隆抗體以及1％BSA的PBS(-)，室溫下反應(yīng)1小時，用PBST溶液充分清洗該板，加入含有0.4mg/ml鄰苯二胺(OPD，Sigma，P-9029)和0.015-0.03％過氧化氫溶液的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH5.0)，室溫下反應(yīng)顯色，然后，向反應(yīng)混合物中加入1N H2SO4溶液以停止反應(yīng)，在波長490nm，參考波長650nm下測定。
然后，用產(chǎn)生具有與36kDa HGFA或活性98kDa HGFA反應(yīng)性的單克隆抗體雜交瘤培養(yǎng)上清液以相同方式，在ELISA板上篩選實施例2中制得的無活性HGFA，以選出與無活性HGFA無反應(yīng)性的雜交瘤。通過這種篩選，得到產(chǎn)生識別活性36kDa HGFA而基本上不識別無活性HGFA單克隆抗體以及識別98kDa HGFA而不識別無活性HGFA(AHGA-A，AHGA-B，AHGA-C)單克隆抗體的雜交瘤。得到的每種雜交瘤經(jīng)過有限稀釋法進(jìn)行4次克隆收集上清液，用蛋白A(Amersham Pharmacia Biotec)親合層析純化單克隆抗體。
AHGA-A雜交瘤克隆于2001年10月19日保藏在國際專利生物體保藏機構(gòu)國家高級工業(yè)科學(xué)和技術(shù)研究院(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)，保藏號為FERM BP-7779。
實施例4活性HGFA特異性單克隆抗體的反應(yīng)特異性分析在實施例3中制備純化的活性HGFA特異性單克隆抗體中，分析雜交瘤克隆AHGA-A，AHGA-B和AHGA-C來源的單克隆抗體反應(yīng)活性，為達(dá)到該目的，向?qū)嵤├?中制得用于篩選活性36kDa HGFA和活性98kDa HGFA的ELISA板或用于篩選無活性HGFA的ELISA板上每孔中加入100μl含有1μgl/ml來源于每種雜交瘤克隆AHGA-A，AHGA-B，AHGA-C的單克隆抗體和1％BSA的PBS(-)，并在4℃反應(yīng)2小時或更長。
然后，用含有0.05％吐溫20的PBS(-)溶液(以下簡寫為“PBST溶液”)充分洗滌該板，再向每孔中加入100μl含有1μg/ml HRP結(jié)合的羊抗鼠IgG多克隆抗體(DAKO)以及1％BSA的PBS(-)，室溫下反應(yīng)1小時，用PBST溶液充分清洗該板，加入含有0.4mg/ml鄰苯二胺(OPD，Sigma，P-9029)和0.015-0.03％過氧化氫溶液的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH5.0)，室溫下反應(yīng)，顯色。
然后，向反應(yīng)混合物中加入1N H2SO4溶液以停止反應(yīng)，在測定波長490nm，參考波長650nm下進(jìn)行測定，測定結(jié)果如圖1所示。雜交瘤克隆AHGA-A和AHGA-B來源的單克隆抗體與活性36kDa HGFA進(jìn)行反應(yīng)，但不與無活性HGFA反應(yīng)。進(jìn)一步，來源于雜交瘤克隆AHGA-C的抗體與活性98kDa HGFA反應(yīng)，但不與無活性HGFA進(jìn)行反應(yīng)(圖1)。分別的，分析針對HGFA(7E10，P1-4，A-1，A-6，A-23，A-51，A-75)存在的單克隆抗體中與活性36kDa HGFA和無活性HGFA的反應(yīng)性，結(jié)果顯示，它們與活性HGFA和無活性HGFA的反應(yīng)性相同，并不具備本發(fā)明中單克隆抗體與活性HGFA的特異性反應(yīng)。
實施例5活性HGFA特異性單克隆抗體離解常數(shù)的測定。
實施例3中制備純化的活性HGFA特異性單克隆抗體中，測定來源于雜交瘤克隆AHGA-A單克隆抗體的離解常數(shù)。向固定活性HGFA及BSA封閉制成的活性HGFA固定板上加入不同濃度的抗體，進(jìn)行充分反應(yīng)直至達(dá)到平衡(2小時或更長)。
接下來，用含有0.05％吐溫20的PBS(-)溶液(以下簡寫為“PBST溶液”)充分洗滌該板，再向每孔中加入100μl含有1μgml HRP(辣根過氧化物酶)結(jié)合的羊抗鼠IgG/Fc多克隆抗體(ICN)以及1％BSA的PBS(-)，室溫下反應(yīng)1小時，PBST溶液充分清洗該板，加入含有0.4mg/ml鄰苯二胺(OPD，Sigma，P-9029)和0.015-0.03％過氧化氫溶液的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH5.0)室溫下反應(yīng)顯色。
然后，向反應(yīng)混合物中加入1N H2SO4溶液以停止反應(yīng)，在測定波長490nm，參考波長650nm下進(jìn)行測定，Schatchard plot測定離解常數(shù)，測定結(jié)果為4.05×10-10M。該結(jié)果提示本發(fā)明的抗體具有高親合性。
實施例6制備特異性識別活性HGFA并且不識別活性HGFA和蛋白酶抑制劑混合物的單克隆抗體。
將實施例3中選出的產(chǎn)生特異性識別活性HGFA并且不識別無活性HGFA單克隆抗體的雜交瘤進(jìn)一步按以下步驟進(jìn)行篩選。
去除實施例2中制備的篩選活性36kDa HGFA或活性98kDa HGFA所用板上的封閉液，每孔中加入20μl含有200μM甲磺酸萘莫司他蛋白酶抑制劑的PBS(-)，室溫下反應(yīng)1小時，以形成活性HGFA和甲磺酸萘莫司他混合物，然后，每孔中加入100μl選出的雜交瘤培養(yǎng)上清液，4℃反應(yīng)2小時。
接下來，用含有0.05％吐溫20的PBS(-)溶液(以下簡寫為“PBST溶液”)充分洗滌該板，再向每孔中加入100μl含有1μg/ml HRP結(jié)合的羊抗鼠IgG多克隆抗體(DAKO)以及1％BSA的PBS(-)，室溫下反應(yīng)1小時，再用PBST溶液充分清洗該板，加入含有0.4mg/ml鄰苯二胺(OPD，Sigma，P-9029)和0.015-0.03％過氧化氫溶液的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH5.0)室溫下反應(yīng)顯色。
然后，向反應(yīng)混合物中加入1N H2SO4溶液以停止反應(yīng)，在測定波長490nm，參考波長650nm下進(jìn)行測定，通過這種篩選，不識別活性36kDa HGFA和甲磺酸萘莫司他復(fù)合物的單克隆抗體被選出。產(chǎn)生選擇的單克隆抗體的雜交瘤克隆命名為AHGA-D。得到的每種雜交瘤經(jīng)過有限稀釋法進(jìn)行4次克隆操作，然后收集上清液，進(jìn)行利用蛋白A的親合層析來純化單克隆抗體。
實施例7分析特異性識別活性HGFA并且不識別活性HGFA與蛋白酶抑制劑復(fù)合物的單克隆抗體的特異性反應(yīng)分析來源于實施例6中選出的雜交瘤克隆AHGA-D單克隆抗體的反應(yīng)性。向?qū)嵤├?中制備的篩選活性36kDa HGFA ELISA板每孔中加入20μl含有甲磺酸萘莫司他的PBS(-)，濃度分別為0，0.820，7.40，22.20或2000μM，室溫下反應(yīng)1小時以形成活性HGFA和甲磺酸萘莫司他的復(fù)合物，然后，每孔中以不同的濃度(0，0.820，7.40，22.20和2000μM)加入100μl含有約1μg/ml來源于雜交瘤克隆AHGA-D的單克隆抗體，1％BSA和甲磺酸萘莫司他的PBS(-)，在4℃反應(yīng)2小時或更長。
然后，用含有0.05％吐溫20的PBS(-)溶液(以下簡寫為“PBST溶液”)充分洗滌該板，再向每孔中加入100μl含有1μg/ml HRP結(jié)合的羊抗鼠IgG多克隆抗體(DAKO)以及1％BSA的PBS(-)，室溫下進(jìn)一步反應(yīng)1小時，再用PBST溶液充分清洗該板，加入含有0.4mg/ml鄰苯二胺(OPD，Sigma，P-9029)和0.015-0.03％過氧化氫溶液的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH5.0)室溫下反應(yīng)顯色。
然后，向反應(yīng)混合物中加入1N H2SO4溶液以停止反應(yīng)，在測定波長490nm，參考波長650nm下進(jìn)行測定，測定結(jié)果如圖2所示。來源于雜交瘤克隆AHGA-D單克隆抗體與蛋白酶抑制劑甲磺酸萘莫司他結(jié)合HGFA的反應(yīng)性明顯的降低。
實施例8針對于HGFA多克隆抗體的制備及其標(biāo)記型式將各100μg的實施例1中制備的每種活性36kDa HGFA，活性98kDaHGFA和無活性HGFA的復(fù)合物對兔進(jìn)行皮下給藥，每次給藥間隔2周，共給藥7次，得到針對于HGFA的多克隆抗體。當(dāng)確定血清中已產(chǎn)生抗體后，10μg每種抗原進(jìn)一步靜脈給藥，5天后得到抗血清。進(jìn)一步，硫酸銨沉淀后，使用蛋白酶A柱純化得到抗-HGFA的多克隆抗體。然后，得到的HGFA多克隆抗體用生物素標(biāo)記，來制備生物素-標(biāo)記的抗-HGFA多克隆抗體。
實施例9構(gòu)建活性HGFA特異性測定系統(tǒng)實施例4中使用雜交瘤克隆AHGA-A來源的多克隆抗體作為初級抗體。該多克隆抗體以30μg/ml的濃度溶解于0.05M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中，再以100μl/孔的量加入到96孔板中，4℃反應(yīng)1天(約12小時或更長)。去除該初級抗體-覆蓋板上的初級抗體溶液，再以250-300μl/孔量加入含有1％BSA的PBS(-)液，4℃過夜(約12小時)或37℃反應(yīng)2小時或更長。去除該板上的封閉液，溶解于100μl含有0.15M NaCl，0.1％CHAPS，0.05％吐溫20，0.05％Az(疊氮化鈉)，0.1％BSA，20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中的活性36kDaHGFA或無活性98kDaHGFA以不同的濃度(0，0.69，2.1，6.2，18.5，55.6，167和500ng/ml)加入到板孔中，4℃反應(yīng)2小時或更長。
然后，用含有500mM NaCl，0.05％ 吐溫20和20mM Tris-HCl(pH7.5)的洗液充分洗滌該板，再向每孔中加入100μl含有1μg/ml實施例8中制得生物素-標(biāo)記抗-HGFA多克隆抗體的PBS(-)，培養(yǎng)箱中37℃反應(yīng)2小時。
然后，用上述洗液充分洗滌該板，向每孔中加入100μl含有1％BSA的PBS(-)，該PBS(-)中含有按1∶2000的比率稀釋的HRP-結(jié)合鏈霉抗生物素(Amersham Pharmacia Biotech，Code RPN1231)，再在室溫下反應(yīng)1小時。洗液充分洗滌該板，以100μl/孔量加入含有0.4mg/ml鄰苯二胺(OPD，Sigma，P-9029)和0.015-0.03％過氧化氫溶液的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH5.0)，室溫下反應(yīng)顯色。
然后，向反應(yīng)混合物中加入100μl/孔1N H2SO4溶液以停止反應(yīng)，在測定波長490nm，參考波長650nm下進(jìn)行測定，測定結(jié)果如圖3所示。圖3A顯示HGFA的濃度范圍為0-500ng/ml。圖3B中，詳述了圖3A中0-55.6ng/ml濃度范圍。
實施例10健康受驗者血中活性HGFA數(shù)量的測定利用實施例9中制備的活性HGFA特異性測定系統(tǒng)測定144名健康受驗者的血漿。收集每個健康受驗者的血漿，冷凍，保存，在本實驗前迅速解凍。首先，向?qū)嵤├?中制得覆蓋了初級抗體并被阻斷的96孔板的每孔中預(yù)先加入50μl含有0.15M NaCl，0.1％CHAPS，0.05％吐溫20，0.05％Az，0.1％BSA的20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)，再加入50μl健康受驗者血清或標(biāo)準(zhǔn)36kDa活性HGFA(0，0.69，2.1，6.2，18.5，55.6，167或500ng/ml)，4℃反應(yīng)2小時或更長。然后，用含有500mM NaCl，0.05％吐溫20和20mMTris-HCl(pH7.5)的洗液洗滌該板，再向每孔中加入100μl含有1μg/ml實施例8中制得生物素-標(biāo)記抗-HGFA多克隆抗體和1％BSA的PBS(-)，培養(yǎng)箱中37℃反應(yīng)2小時。接下來，用上述洗液充分洗滌該板，向每孔中加入100μl含有1％BSA的PBS(-)，該PBS(-)中含有按1∶2000的比率稀釋的HRP-結(jié)合鏈霉抗生物素(Amersham Pharmacia Biotech，Code RPN1231)，再在室溫下反應(yīng)1小時。
用洗液充分洗滌該板，加入100μl/孔含有0.4mg/ml鄰苯二胺(OPD，Sigma，P-9029)和0.015-0.03％過氧化氫溶液的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH5.0)，室溫下反應(yīng)顯色。然后，向反應(yīng)混合物中加入100μl/孔1N H2SO4溶液以停止反應(yīng)，在測定波長490nm，參考波長650nm下進(jìn)行測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)36kDa活性HGFA的濃度與顏色生成量之間的關(guān)系來繪制校正曲線，計算健康受驗者血清中的濃度。結(jié)果如圖4所示。正常受驗者血清中濃度范圍為0到58.5ng/ml，平均為19ng/ml。
實施例11不同人類疾病患者血中活性HGFA的測定根據(jù)實施例10中所用方法利用實施例9中制得活性HGFA特異性測定系統(tǒng)對不同人類疾病患者的血漿進(jìn)行測定。每種疾病患者5人，收集每種血清，冷凍，保存，在進(jìn)行本實驗前迅速解凍，實驗結(jié)果見表1?？梢钥闯?，與健康受驗者(樣品數(shù)9，平均值19ng/lm)相比，腎小球腎炎，胰腺炎，癌癥，心肌梗塞，心絞痛，和大腦梗塞患者血中活性HGFA的濃度高。
表1
實施例12收集測定活性HGFA血樣以及檢測穩(wěn)定性的方法。
收集正常受驗者的血清，檸檬酸血漿，肝素血漿或EDTA血漿，或制備含有終濃度為40μM阿戈托班的血清，檸檬酸血漿，肝素血漿，或EDTA血漿。每種均保存于4℃或37℃12小時。然后，實施例10中所述的方法測定活性HGFA的量。結(jié)果如圖5所示?？煽闯?，由于血漿或血清的保存帶來的血漿中活性HGFA數(shù)量的增加少于血清中活性HGFA的增加，而且阿戈托班的加入抑制了這種增加。
序列表<110>化學(xué)公司<120>抗活性肝細(xì)胞生長因子激活劑的特異性抗體及其使用方法<130>OP1261<140><141>2000-12-05<150>JP2000-370435<151>2000-12-05<160>3<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>13<212>PRT<213>人<400>1Gly Arg Arg His Lys Lys Arg Thr Phe Leu Arg Pro Arg1 5 10<210>2<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Ile Ile Gly Gly Ser Ser Ser Leu Pro Gly Ser His Pro15 10<210>3<211>26<212>PRT<213>人<400>3Gly Arg Arg His Lys Lys Arg Thr Phe Leu Arg Pro Arg Ile Ile Gly1 5 10 15Gly Ser Ser Ser Leu Pro Gly Ser His Pro20 2權(quán)利要求
1.一種抗體，該抗體可識別活性肝細(xì)胞生長因子激活劑(HGFA)并且基本上不識別無活性HGFA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗體，其中活性HGFA的離解常數(shù)為1×10-8M或更低。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述抗體，它是單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的抗體，該抗體可識別SDS-PAGE方法測定分子量為34,000-98,000的活性HGFA并且基本上不識別無活性HGFA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4中所述的抗體，該抗體可識別SDS-PAGE方法測定分子量為34,000-98,000的活性HGFA。
6.根據(jù)權(quán)利要求4中所述的單克隆抗體，該抗體由保藏號為FERM BP-7779的雜交瘤產(chǎn)生。
7.一種單克隆抗體，該抗體可識別由無活性HGFA有限蛋白水解作用激活的活性HGFA并且基本上不識別無活性HGFA，該無活性HGFA是活性HGFA的前體，該水解作用是在無活性HGFA翻譯起始氨基酸處計算，407位的精氨酸和408位的異亮氨酸之間的水解作用。
8.一種單克隆抗體，該抗體可識別活性HGFA，但基本上不識別無活性HGFA，也不識別活性HGFA與蛋白酶抑制劑復(fù)合物。
9.一種雜交瘤細(xì)胞系，該細(xì)胞系可產(chǎn)生如權(quán)利要求3到8中所述的任一單克隆抗體。
10.一種測定活性HGFA的方法，包括使用一種或幾種權(quán)利要求1到8中所述任一抗體進(jìn)行免疫方法特異性測定活性HGFA的步驟。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述方法，其中用于測定活性HGFA的樣品是從涉嫌患病實驗動物或受驗者收集的生物組份。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述方法，其中疾病是器官炎癥，腎小球腎炎，癌癥，心肌梗塞，心絞痛，大腦梗塞或血栓形成。
13.一種疾病的測定方法，包括檢測或測定收集自涉嫌患病的受驗者生物組份中活性HGFA的步驟。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述方法，其中疾病是選自器官炎癥，腎小球腎炎，癌癥，心肌梗塞，心絞痛，大腦梗塞和血栓形成。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14中所述方法，其中，生物組份是血液或其成分或其加工產(chǎn)物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述方法，其中生物組份是血漿。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述方法，其中血漿是檸檬酸血漿。
18.根據(jù)權(quán)利要求13到17所述方法任一種，其中生物組份中加入阿戈托班。
19.一種檢測或測定活性HGFA的試劑盒，該試劑盒包括一種或幾種權(quán)利要求1到8所述任一抗體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述試劑盒，該試劑盒用于診斷一種選自器官炎癥，腎小球腎炎，癌癥，心肌梗塞，心絞痛，大腦梗塞和血栓形成的疾病。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20所述試劑盒，該試劑盒用于測定收集自涉嫌患病的受驗者生物組份中活性HGFA。
22.根據(jù)權(quán)利要求19到21任一所述試劑盒，其中活性HGFA通過免疫染色測定。
23.一種用于收集血清，血漿或全血的血液收集試管，其中加入阿戈托班。
24.根據(jù)權(quán)利要求23中所述血液收集試管，用于收集測定活性HGFA所用血清，血漿或全血。
全文摘要
將利用編碼無活生HGFA前體的HGFA cDNA得到的重組無活性HGFA,以及蛋白酶處理無活性HGFA得到活性HGFA,用于篩選產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤,該單克隆抗體與活性HGFA具有反應(yīng)性,與無活性HGFA不具有反應(yīng)性,從獲得的雜交瘤培養(yǎng)上清液制備靶單克隆抗體。
文檔編號C07K16/40GK1384120SQ0114575
公開日2002年12月11日 申請日期2001年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月5日
發(fā)明者仲大地, 長池一博 申請人:三菱化學(xué)株式會社