專利名稱：高遷移率族蛋白b2用作肝細胞癌標志物的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體地說，涉及高遷移率族蛋白B2的應用，更具體地 說，涉及高遷移率族蛋白B2作為肝細胞癌的蛋白質(zhì)分子標記的應用。
背景技術：
肝細胞癌是世界范圍內(nèi)第四位、我國第二位的常見惡性腫瘤，每年大約有250，000 名患者死于肝細胞癌。肝細胞癌惡性程度高，容易復發(fā)和轉移，預后差，而且早期診斷較困 難，往往延誤了最佳治療時期。西方發(fā)達國家肝癌的發(fā)病率較低，國際上對肝癌的基礎研究 仍較為薄弱，而我國是肝癌高發(fā)國家，發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升趨勢，且發(fā)病年齡構成年輕 化，每年用于肝癌治療的醫(yī)療支出大為增加，肝癌成了嚴重危害我國人民生命財產(chǎn)安全的 頭號敵人，并且是影響社會經(jīng)濟發(fā)展的一個重要因素，加大力度進行我國肝癌的基礎研究 具有戰(zhàn)略意義，而分離和鑒定新的肝癌相關基因是目前肝癌基礎研究中的前沿課題。到目前為止，已有不下20種的基因異常表達被確定與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關，但已 確定的肝癌相關基因在肝癌中的異常表達率并不高，肝癌的發(fā)病機制至今仍未闡明，肝癌 的早期診斷率仍有待提高。此外，傳統(tǒng)的肝癌手術加化療以及近年來配合使用的多種基因 治療方法仍沒有明顯提高肝癌患者的生存率，因而尋找新的肝癌相關基因、尤其是肝癌高 表達基因?qū)τ谔接懜伟┑陌l(fā)病機制具有重要意義。因此，研究和開發(fā)在肝細胞癌中高表達的基因和/或蛋白質(zhì)具有重要意義，尋找 新的在肝細胞癌中高表達的基因和/或蛋白質(zhì)也具有迫切需要性。B2(High mobility group protein B2, High mobility group protein 2，HMGB2, HMG2, HMG-2)的 NCBI 的登錄號為 NP_002120，Swissprot 登錄號為 P26583，IPI號為IPI00219097. 4(human3. 28version)。高遷移率族蛋白B2是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結 合的SET復合體的組成成份之一，其具有多種重要作用，如能夠直接與SET相互作用，能夠 優(yōu)先結合單鏈 DNA 以及解開雙鏈 DNA (http://www. uniprot. org/uniprot/P26583)等，但至 今只有少量研究結果表明高遷移率族蛋白B2在基因水平上與癌癥有關或在蛋白質(zhì)水平上 與癌癥有關，其中表明高遷移率族蛋白B2在基因水平上與癌癥有關的文獻主要有 Transcriptionalprofiling of medulloblastoma in children. J Neurosurg. 2003 ； 99 (3) 534-41 (通過cDNA芯片的方法來比較成神經(jīng)管細胞瘤和正常小腦樣品中基因的表 達水平，結果發(fā)現(xiàn)高遷移率族蛋白B2基因在成神經(jīng)管細胞瘤中表達水平較高),Molecular targets for tumour progression ingastrointestinal stromal tumours. Gut. 2004 ； 53(2) :235-40(通過定量RT-PCR發(fā)現(xiàn)高迀移率族蛋白B2基因在惡性胃腸基質(zhì)癌中過表 達)，f[ISET complex in serous epithelial ovariancancer. Int J Cancer. 2006 ； 119(9) 2119-26 (通過比較低惡性潛能和高惡性潛能的漿液性卵巢上皮性腫瘤(O級對3級)發(fā)現(xiàn) 高遷移率族蛋白B2基因在有擴散性的3級腫瘤中高表達，同時通過組織芯片結合免疫組織 化學研究發(fā)現(xiàn)高表達的高遷移率族蛋白B2與病人的預后有關)。
表明高遷移率族蛋白B2在蛋白質(zhì)水平上與癌癥有關的文獻為0VereXpreSSiOn of thehigh mobility group (HMG) B land B2 proteins directly correlates with the progression ofsquamous cell carcinoma in skin. Cancer Invest. 2008 ；26 (8) 843-51 (通過對皮膚鱗狀細胞癌的研究發(fā)現(xiàn)高遷移率族蛋白B2與腫瘤變化的程度直接相 關，并可能有效的刺激細胞分化、腫瘤生長以及轉移)。但是到目前為止，現(xiàn)有技術中尚未見到有關于高遷移率族蛋白B2與肝細胞癌的 相關性的報道。

發(fā)明內(nèi)容
通過篩選在人類肝細胞癌組織及相應的癌旁組織中差異表達的蛋白質(zhì)，本申請的 發(fā)明人找到了一種在人類肝細胞癌組織及相應的癌旁組織中存在差異表達的蛋白質(zhì)(在 癌組織中上調(diào)表達)，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為高遷移率族蛋白B2。免疫印跡實驗證實，高遷移率族蛋 白B2的確在肝細胞癌組織及相應的癌旁組織中存在差異表達(在癌組織中表達上調(diào))。利 用人肝細胞癌細胞株H印G2和人正常肝細胞株L02進行的免疫熒光實驗，證明高遷移率族 蛋白B2在這兩種細胞株間存在差異表達(在人肝細胞癌細胞株H印G2中表達上調(diào))。基于高遷移率族蛋白B2與肝細胞癌的這種相關性，這種蛋白質(zhì)可以作為一種蛋 白質(zhì)分子標記物對它的表達量進行檢測可以用于檢測肝細胞癌。 因此，本發(fā)明的首要目的在于，提供一種高遷移率族蛋白B2的應用，以用作檢測 肝細胞癌。本發(fā)明提供的高遷移率族蛋白B2的應用為，用作檢測肝細胞癌的蛋白質(zhì)分子標記。本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種高遷移率族蛋白B2的抗體的應用。本發(fā)明提供的高遷移率族蛋白B2的抗體的應用，包括單克隆抗體和多克隆抗體， 為用于制備檢測肝細胞癌的制劑和/或試劑盒。本發(fā)明的又一個目的在于提供一種體外檢測肝組織中高遷移率族蛋白B2的表達 是否異常的方法。本發(fā)明提供的體外檢測肝組織中高遷移率族蛋白B2的表達是否異常的方法為 用特異性抗高遷移率族蛋白B2的抗體檢測待測肝組織細胞中高遷移率族蛋白B2的數(shù)量， 并與正常肝組織中的高遷移率族蛋白B2的數(shù)量進行比較。高遷移率族蛋白B2在肝細胞癌的癌細胞和癌旁細胞中存在明顯的差異表達，因 此，可根據(jù)其在肝細胞中的表達量檢測患者是否患有肝細胞癌。同時，鑒于到目前為止，還 沒有高遷移率族蛋白B2的表達量與肝細胞癌的相關性報道。因此，本發(fā)明的這一發(fā)現(xiàn)將為 肝細胞癌的診斷和/或治療提供一條全新的途徑。


圖1為高遷移率族蛋白B2的免疫印跡分析結果，其中，泳道1-6為肝細胞癌組織 的檢測結果，泳道1’ -6’為與泳道1-6對應的癌旁組織的檢測結果。圖2為對圖1的免疫印跡圖譜進行數(shù)據(jù)分析得出的蛋白質(zhì)表達量相對分布圖，其 中，HCC為肝細胞癌患者的癌組織，non-HCC為癌旁組織，縱坐標IOD為蛋白質(zhì)表達量相對豐度。圖3為高遷移率族蛋白B2的免疫熒光實驗結果，其中，圖Al為HepG2細胞中蛋白 B2的分布情況，圖A2為H印G2的細胞核，圖A3為Al和A2的疊加圖，圖Bl為L02細胞中蛋 白B2的分布情況，圖B2為L02的細胞核，圖B3為Bl和B2的疊加圖。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本 發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人， 分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述 的條件，或按照制造廠商所建議的條件。在本發(fā)明的下述實施例中，尿素、3-[(3_膽酰胺丙基)_ 二乙銨]-1-丙磺酸 (CHAPS)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、三(羥甲基)氨基乙烷(Tris)、碘代乙 酰胺(IAA)購自Bio-Rad公司；CLM-2262L-Leu(U-13C6,98% )購自劍橋同位素實驗室；透 析胎牛血清購自Gibco公司；D9785細胞培養(yǎng)粉末、β -巰基乙醇、L-GlruL-Lys和L-Met購 自 Sigma 公司；胰蛋白酶(Trypsin，sequencing grade)購自 Promega 公司；SCX 柱禾Π SAX 柱以及PH緩沖液試劑盒購自Column Technology公司；!fepG2細胞株和L02細胞株購自中 國科學院上海生命科學研究院生物化學和細胞研究所的細胞庫。在本發(fā)明的下述實施例中，使用的溶液/培養(yǎng)基配方如下不含谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基5%透析胎牛血清，0.2mM苯甲基磺酰氟 (PMSF)，ImM EDTA,苯甲異惡唑青霉素25mg/mL，慶大霉素50mg/mL，青霉素100U/mL，鏈霉素 100mg/mL,兩性霉素 B 0. 25mg/mL,制霉菌素 50U/mL。裂解液8mol/L尿素、4% CHAPS、40mmol/L Tris 和 65mmol/L DTT。裂解緩沖液8mol/L尿素，40mmol/L Tris, 65mmol/L DTT。TBST =Tris 2. 42g/L，氯化鈉 8g/L, Tween_201ml/L，用 HCl 調(diào)節(jié) pH 到 7. 6。本申請的發(fā)明人用非酶解樣品制備法(nonenzymatic sample preparation, NESP)制備了肝細胞癌的癌組織與癌旁組織的蛋白質(zhì)樣品，并采用CDIT技術結合溶液內(nèi)酶 解及陰陽多維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學標記定量技術對其中的蛋白質(zhì)進行鑒定并 比較其表達量，結果發(fā)現(xiàn)高遷移率族蛋白B2在肝細胞癌組織中上調(diào)表達。免疫印跡實驗進 一步證實高遷移率族蛋白B2的確在肝細胞癌組織及相應的癌旁組織中存在差異表達。另 外，免疫熒光實驗也進一步證實了高遷移率族蛋白B2的確在人類肝細胞癌患者的癌組織 和癌旁組織中存在差異表達，具體如實施例所示。因此，以高遷移率族蛋白B2作為蛋白質(zhì) 分子標記物對它的表達量進行檢測可以用于檢測肝細胞癌，即高遷移率族蛋白B2可以用 作檢測肝細胞癌的蛋白質(zhì)分子標記。實施例1、肝細胞癌癌組織及癌旁組織蛋白質(zhì)樣品的制備從東方肝膽外科醫(yī)院獲取5例肝細胞癌患者的癌組織及癌旁組織，該5例患者，均 由2名病理科醫(yī)生確診，患有肝細胞癌，5例患者的病理資料如表1所示。表1、5例肝細胞癌標本的病理資料
權利要求
一種高遷移率族蛋白B2的應用，其特征在于，所述應用為所述高遷移率族蛋白B2用作檢測肝細胞癌的蛋白質(zhì)分子標記。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述用作檢測肝細胞癌的蛋白質(zhì)分子標記 是檢測高遷移率族蛋白B2在肝細胞組織中的表達量。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述檢測高遷移率族蛋白B2在肝細胞組織 中的表達量是檢測高遷移率族蛋白B2在肝細胞組織中是否均存在上調(diào)表達。
4.一種抗高遷移率族蛋白B2的抗體的應用，其特征在于，所述應用為用于制備檢測肝 細胞癌的制劑。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述抗高遷移率族蛋白B2的抗體包括單克 隆抗體和多克隆抗體。
6.一種抗高遷移率族蛋白B2的抗體的應用，其特征在于，所述應用為用于制備檢測肝 細胞癌的試劑盒。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于，所述抗高遷移率族蛋白B2的抗體包括單克 隆抗體和多克隆抗體。
8.—種體外檢測肝組織中高遷移率族蛋白B2的表達是否異常的方法，其特征在于，所 述方法為用特異性抗高遷移率族蛋白B2的抗體檢測待測肝組織細胞中高遷移率族蛋白 B2的數(shù)量，并與正常肝組織中的高遷移率族蛋白B2的數(shù)量進行比較。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗高遷移率族蛋白B2的抗體包括單克 隆抗體和多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高遷移率族蛋白B2的應用。本發(fā)明提供的高遷移率族蛋白B2的應用為高遷移率族蛋白B2作為檢測肝細胞癌的蛋白質(zhì)分子標記的應用。高遷移率族蛋白B2在肝細胞癌的癌細胞和癌旁細胞中存在明顯的差異表達，因此，可根據(jù)其在肝細胞中的表達量檢測患者是否患有肝細胞癌。
文檔編號G01N33/577GK101995471SQ20091005678
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月21日 優(yōu)先權日2009年8月21日
發(fā)明者徐孟杰, 曾嶸, 李辰, 武祎, 阮宏強 申請人:中國科學院上海生命科學研究院