專利名稱：用于治療肝細(xì)胞癌的藥物組合物和藥劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供用于治療肝細(xì)胞癌(HCC)的包括Notch3抑制劑和化學(xué)療法藥劑的藥 物組合物，用于制備所述組合物的方法和包括對有需要的患者施用所述藥物組合物的醫(yī)學(xué) 治療。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞癌在全世界所有人類癌癥中發(fā)病率占第五位，每年引起一百萬人死亡。盡 管有很多有前途的治療方法可選擇，其包括外科切除、乙醇或射頻消融、化療栓塞、和肝移 植，但在晚期疾病患者中的長期預(yù)后依然不足。目前，栓塞是非切除性的HCC最廣泛使用的初級治療，其用于等待肝捐贈(zèng)的患者 以預(yù)防HCC的發(fā)展的最常使用的治療，所述HCC的發(fā)展會(huì)排除移植。栓塞劑通常與選擇性 的內(nèi)動(dòng)脈細(xì)胞毒素一起施用，其中最常使用的是阿霉素。盡管這種療法明顯推遲腫瘤進(jìn)程 以及血管入侵，這個(gè)方法僅在患者中得到部分響應(yīng)。盡管有新治療形式的近期發(fā)展，發(fā)現(xiàn)克服對HCC的化學(xué)療法藥劑的抵抗的治療分 子需要依然很緊迫。Notch受體包含在增殖、分化和凋亡中。由于在人類癌癥中Notch信號 通路的異常失控的增加的跡象，Notch受體為用于選擇性殺死惡性細(xì)胞的潛在標(biāo)靶。四個(gè)已知的Notch受體(Notchl-4)是單次跨膜受體，在發(fā)育的所有時(shí)期介導(dǎo)信號 從細(xì)胞表面至細(xì)胞核以調(diào)節(jié)增殖、分化和凋亡。Notch受體主要由Delta和Serrate/jagged 家族跨膜配體激活，跨膜配體在相鄰細(xì)胞表面表達(dá)。配體介導(dǎo)的Notch的活化誘導(dǎo)Notch 細(xì)胞內(nèi)區(qū)域(Ni⑶)的蛋白水解斷裂和核轉(zhuǎn)運(yùn)，NI⑶結(jié)合至轉(zhuǎn)錄因子CBFl/RBP-Jk反式激 活靶基因，包括HESl。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)在多種不同的人類腫瘤中失控的Notch受體的表達(dá)。已經(jīng)在人類的乳房 癌、胰腺癌以及霍奇金淋巴瘤中觀察到增加的Notchl蛋白的表達(dá)。已經(jīng)在惡性黑色素瘤、 胰腺癌和乳房癌中發(fā)現(xiàn)Notch3和Notch4的過量表達(dá)。Notchl信號通路在大白鼠肝臟再生中被激活，并發(fā)現(xiàn)Notchl的過量表達(dá)抑制體 外和體內(nèi)的HCC細(xì)胞生長?？磥鞱otchl的組成型活化可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞生長停止，在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中、前 列腺癌細(xì)胞中和小鼠皮膚中，作為腫瘤抑制物起作用。近期發(fā)現(xiàn)Notch3在人類H印G2肝癌細(xì)胞系中高度表達(dá)，但到目前為止，沒有關(guān)于 Notch3在HCC中的作用的研究。在腫瘤領(lǐng)域，基因治療代表新的以及有前途的策略，該策略依賴于將基因材料轉(zhuǎn) 移至細(xì)胞中以產(chǎn)生抵抗疾病的有益效果。小干擾RNA(SiRNA)是利用所有細(xì)胞的自然性質(zhì)， 通過促進(jìn)目標(biāo)mRNA的降解或翻譯的消除來指導(dǎo)特定基因沉默的新興技術(shù)。在過去的幾年 中，已開發(fā)多種手段來表達(dá)和傳遞短發(fā)夾環(huán)RNA(shRNA)，通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞的天然的RNA 加工機(jī)制有效地轉(zhuǎn)化成siRNA。因此，由于已確定的相對于它們靶mRNA的高特異性，研究特 異性shRNA以用于抵抗包括癌癥的多種人類疾病的潛在的新療法的開發(fā)。
盡管已知Notch受體，依賴于它們在多種細(xì)胞環(huán)境中的表達(dá)水平，在惡性細(xì)胞的 凋亡抵抗中起重要作用，它們的作用機(jī)理仍然很大程度上未知，因此限制了抵抗與所述受 體相關(guān)的腫瘤醫(yī)學(xué)治療的可能性。關(guān)于HCC，抵抗以上列出的所述疾病的醫(yī)學(xué)限制，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，加重了對提供抵抗 HCC惡性細(xì)胞的擴(kuò)散和存在的有效治療的藥物的需要。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明中，研究了人類HCC組織樣品和相鄰的無HCC組織中Notch受體的表達(dá)； 并且評估了在H印G2細(xì)胞中，通過shRNA消除Notch3表達(dá)的生理學(xué)效果。已發(fā)現(xiàn)Notch3 選擇性地在HCC中表達(dá)，而在周圍的無HCC組織中不表達(dá)。與之前在HCC細(xì)胞系中的研究一致，該研究表明Notchl過量表達(dá)通過p21上調(diào)抑 制細(xì)胞生長，本發(fā)明的作者通過免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，通過目標(biāo)shRNA敲除的Notchl表達(dá)的 缺失極大地減少了 P21蛋白表達(dá)(圖6)。但是，與基于已知技術(shù)和在HCC中獲得的Notch受體的其它結(jié)果相反，令人驚訝地 發(fā)現(xiàn)，通過目標(biāo)shRNA或通過抗Notch3抗體的Notch3活性的抑制，沒有改變IfepG2生長速 率。本文中，細(xì)胞生長參數(shù)在轉(zhuǎn)染后一周通過碘化丙啶染色和流式細(xì)胞儀估定。獲得的結(jié) 果顯示，在H印G2細(xì)胞中，Notch3的敲除引起磷酸化的p53的積聚和p21的抑制，對細(xì)胞生 長或存活沒有明顯效果。因此，與Notchl相反，Notch3沒有顯現(xiàn)出對人類HCC增殖的貢獻(xiàn)， 至少在這個(gè)體外環(huán)境中。引入注目地，通過臺(tái)盼藍(lán)染色排除試驗(yàn)顯示，穩(wěn)定表達(dá)Notch3shRNA (相比較于熒 光素酶shRNA陰性對照)的HepG2細(xì)胞的死亡率用阿霉素(或其它用于癌癥治療的分子) 處理6和24小時(shí)分別成兩倍和三倍(圖3)。另一方面，如圖10中所示，Notchl的消除對藥物誘導(dǎo)凋亡中沒有可論證的效果。因此，Notch3的表達(dá)，通過阻止p53依賴的凋亡的活化，至少部分地作為多藥抗性 的特定的陽性效應(yīng)物起作用，以及作為結(jié)果，造成HCC對化學(xué)療法或其它環(huán)境脅迫具有抗性。因此，本發(fā)明的目的是用于治療肝細(xì)胞癌的包括Notch3抑制劑、抗腫瘤化學(xué)療 法藥劑和藥物學(xué)合適載體的藥物組合物，用于所述組合物制備的方法以及包括向需要的患 者施用所述組合物的醫(yī)學(xué)治療。


圖1.相對于相鄰的無HCC肝臟組織，在HCC中增加的Notch3免疫反應(yīng)性。含有 HCC和周圍的無腫瘤肝臟的福爾馬林固定的石蠟切片用抗Notch3多克隆抗體免疫染色。免 疫反應(yīng)性用HRP兔子EnVision系統(tǒng)顯示，二氨基聯(lián)苯胺作為色原體(褐色沉淀物)。片段 用Mayer的蘇木精復(fù)染色。圖片是HCC(A、C)和周圍無HCC肝臟(B、D)用抗Notch3多克隆 抗體免疫染色的典型例子。圖2.蛋白和基因表達(dá)。(A)在!fepG2感染細(xì)胞中，Notch3、p53、p-p53、p21、 Gadd45 α、p27的Western印跡。密度計(jì)量分析顯示在Notch3細(xì)胞缺失的細(xì)胞中，p21水 平降低5倍，而p27 (2. 3倍)、Gadd45 (2倍)、p53 (5倍)和p-p53 (3. 2倍)的蛋白表達(dá)增力口。對于mRNA和蛋白水平，均使用β肌動(dòng)蛋白作為參考對照。(B)Western印跡表明兩個(gè) Notch3shRNA產(chǎn)生相等的滲透的Notch3敲除。(C)在表達(dá)shRNA的!fepG2細(xì)胞中，HESU P53和WAF的RT-PCR表達(dá)分析。進(jìn)行了兩次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。CS :GL2陰性對照shRNA，N3S Notch3shRNA。圖3.處理后細(xì)胞存活率。感染的細(xì)胞用100μ g/ml阿霉素處理預(yù)定次數(shù)。每次 阿霉素處理后，計(jì)算臺(tái)盼存活率重復(fù)兩次，每個(gè)樣品計(jì)算至少200個(gè)細(xì)胞。兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的 柱狀平均值；條紋，SE。CS :GL2陰性對照shRNA，N3S :Notch3shRNA。圖4.凋亡分析。培養(yǎng)的感染的H印G2細(xì)胞用100 μ g/ml阿霉素處理6小時(shí)、12小 時(shí)、18小時(shí)和24小時(shí)，然后進(jìn)行蛋白提取。蛋白通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分解，然后用單克 隆抗人分裂的PARP進(jìn)行western印跡分析。β肌動(dòng)蛋白用作蛋白水平參考對照。CS :GL2 陰性對照 shRNA，N3S :Notch3shRNA。圖5. DNA損傷和阿霉素吸收的分析。(A)通過彗星實(shí)驗(yàn)檢測DNA損傷。感染的 !fepG2細(xì)胞在含有100 μ g/ml阿霉素的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)1、3、6、12、18個(gè)小時(shí)，隨后用彗 星實(shí)驗(yàn)測量DNA鏈破損量?；A(chǔ)DNA損傷(沒有阿霉素)顯示陰性對照H印G2細(xì)胞具有 與Notch3缺失細(xì)胞一樣的損傷(P = 0. 6686)。(B)阿霉素吸收。感染的細(xì)胞用100 μ g/ ml阿霉素處理不同次數(shù)，通過FACS實(shí)驗(yàn)測量藥物吸收。Notch3缺失細(xì)胞比陰性對照吸 收明顯更高水平的阿霉素。兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的柱狀平均值；條紋，SE。CS 對照shRNA，N3S Notch3shRNA。圖6.在Notchl缺失細(xì)胞中減少的p21表達(dá)。Western印跡分析證明，相比于陰性 對照(CS)，在Notchl缺失細(xì)胞(NlS)中，p21的水平降低和p53及p-p53的水平未變化。圖 7· p53 短干擾 RNA。感染的細(xì)胞用 40nM p53siRNA 或 40nM零亂 siRNA(scRNA)轉(zhuǎn) 染，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)通過western印跡評估p53的敲除。N3S :Notch3shRNA ；CS :GL2 陰性對照 shRNA ；scRNA 零亂 RNA。1、7 :N3S/scRNA ；2、8 :CS/scRNA ；3、5 :N3S/p53siRNA ；4、 6 :CS/p53siRNA。圖8.在Notch3缺失細(xì)胞中，p53siRNA降低對阿霉素的靈敏度。轉(zhuǎn)染后48和72 小時(shí)的細(xì)胞用100 μ g/ml阿霉素處理24小時(shí)。每次阿霉素處理后，計(jì)算臺(tái)盼存活率重復(fù)兩 次，每個(gè)樣品計(jì)算至少200個(gè)細(xì)胞。兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的柱狀平均值；條紋，SE。CS:GL2陰性對 照 shRNA ；N3S :Notch3shRNA ；scRNA 零亂 RNA。圖 9. HESl 短干擾 RNA。！fepG2 細(xì)胞用 40nM HESlsiRNA 或 40nM 零亂 siRNA 轉(zhuǎn)染， 轉(zhuǎn)染后72小時(shí)通過RT-PCR和western印跡分別評估HESl的敲除和p21蛋白水平。1 零 亂 RNA ；2、3 不同的 HESlsiRNA。圖10.在Notchl缺失細(xì)胞中，阿霉素處理后細(xì)胞存活率。250X 103感染的細(xì)胞 用100 μ g/ml阿霉素處理24小時(shí)，每次阿霉素處理后，計(jì)算臺(tái)盼存活率重復(fù)兩次，每個(gè)樣 品計(jì)算至少200個(gè)細(xì)胞。兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的柱狀平均值，條紋，SE。CS 對照shRNA ；NlS NotchlshRNA。
具體實(shí)施例方式根據(jù)本發(fā)明，Notch3抑制能夠在轉(zhuǎn)錄后水平被誘導(dǎo)，通過與Notch3mRNA雜交的靶 標(biāo)siRNA或shRNA或靶標(biāo)的合成寡核苷酸(即，通過RNA干擾，RNAi)，因此抑制Notch3受體的合成。短發(fā)夾環(huán)RNA (shRNA)是穩(wěn)定發(fā)夾環(huán)形式的、在體內(nèi)通過RNA干擾沉默基因表達(dá)的RNA分子。shRNA發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)通過細(xì)胞加工機(jī)制剪切產(chǎn)生成熟的siRNA，其反義鏈被RNA誘導(dǎo) 的沉默復(fù)合體(RISC)特異吸收。之后的復(fù)合體結(jié)合mRNA并剪切mRNA，mRNA與包含在RISC 中的siRNA序列匹配，因此指導(dǎo)目標(biāo)RNA降解。因此，所述抑制形成一個(gè)特定時(shí)期，由于預(yù) 先存在的受體將最終用盡而不能有效補(bǔ)充新合成的Notch3受體，導(dǎo)致Notch3受體從目標(biāo) 細(xì)胞中缺失。可選地，受體可由使用抗Notch3抗體或分子抑制，抗Notch3抗體或分子影響 Notch3受體的功能，如，受體配體的拮抗劑。根據(jù)本發(fā)明的shRNA或siRNA可從已知的Notch3mRNA序列構(gòu)建，或選自PCT申請 W02004047731中描述的那些或序列號1和2中的序列。這些RNA長度一般是21-23核苷酸，如在現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)導(dǎo)的，長于30個(gè)核苷酸的 序列能夠引發(fā)抗病毒樣干擾素反應(yīng)，導(dǎo)致所有蛋白合成的停止。用于設(shè)計(jì)siRNA或shRNA的方案和操作可在線利用(例如http //www. genelink. com/sirna/shRNAi. asp、http//www. ambion. com/techlib/misc/psilencer_converter. html)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員在設(shè)計(jì)適于完成本發(fā)明的RNA時(shí)沒有問題。所述shRNA可以插入任何適于基因治療的載體。shRNA表達(dá)載體已經(jīng)使用病毒(包 括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和慢病毒載體)和質(zhì)粒系統(tǒng)制造。這些載體使用來自小類別pol. III 啟動(dòng)子的啟動(dòng)子以驅(qū)動(dòng)shRNA的表達(dá)。所有的載體必須包括人類polIII啟動(dòng)子。人類U6 啟動(dòng)子是研究的最好的常用于RNAi的類型III pol啟動(dòng)子。shRNA由Exportin5從核中輸出，Exportin5識別短RNA環(huán)。一旦在細(xì)胞質(zhì)中，通 過另一個(gè)術(shù)語為Dicer的RNaseIII酶剪切，前體miRNA和shRNA被加工成siRNA雙鏈復(fù)合 物。重要地，Dicer結(jié)合shRNA基部，在莖上剪切21或22nt，留下另一個(gè)3’突出的2nt，并 形成siRNA雙鏈復(fù)合物結(jié)構(gòu)。RNA雙鏈復(fù)合物由RNAi誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)吸收。RISC 放開雙鏈RNA和含有相關(guān)反義鏈的活化復(fù)合體。在逆轉(zhuǎn)錄病毒中的遺傳材料是RNA分子形式，而它們宿主的遺傳材料是DNA的形 式。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染宿主細(xì)胞，將把它的RNA和一些酶一起轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞。在它可以被認(rèn)作 是宿主細(xì)胞遺傳材料的一部分之前，這個(gè)來自逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA分子一定產(chǎn)生來自它的 RNA分子的DNA拷貝。從RNA分子產(chǎn)生DNA拷貝的過程定義為逆轉(zhuǎn)錄。它通過病毒中攜 帶的一種酶，叫做反轉(zhuǎn)錄酶實(shí)現(xiàn)。在這個(gè)DNA拷貝產(chǎn)生以及釋放在宿主細(xì)胞核中后，它一 定通過使用另一種攜帶在病毒中被稱為整合酶的酶融合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組中。使用逆 轉(zhuǎn)錄病毒的基因治療的一個(gè)問題是整合酶能夠?qū)⒉《具z傳材料插入宿主基因組的任何位 置。如果遺傳材料恰好被插在宿主細(xì)胞的一個(gè)原始基因的中部，這個(gè)基因?qū)⒈黄茐?插入 突變)。如果該基因恰好是調(diào)控細(xì)胞分裂，將產(chǎn)生不受控制的細(xì)胞分裂(如癌癥)。本領(lǐng) 域最新的技術(shù)已經(jīng)公開了使用鋅指核酸酶或包括特定序列例如β球蛋白基因座控制區(qū)以 指導(dǎo)在特定染色體位點(diǎn)融合的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的應(yīng)用。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以知道， 在本領(lǐng)域發(fā)展的水平中從哪里尋找跡象用于構(gòu)造適用于本發(fā)明的藥物組合物的載體。用 于所述RNA的表達(dá)和靶定的載體、試劑盒構(gòu)建載體和載體構(gòu)建的操作是本領(lǐng)域公知的，例如，INGENEX GeneSuppressorRetro構(gòu)造試劑盒，或線上可用的，或在以下文獻(xiàn)中描述的 GJ.等(2003) “表送用于基因功能的發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)的siRNAs的腺病毒載體”，《基因組研究 (Genome Res.)》，13 :2325_2332，證明基于腺病毒的shRNA在多種細(xì)胞類型中表達(dá)，包括 原始細(xì)胞。Matta，H等(2003) “用于小干擾RNA傳遞的慢病毒載體的應(yīng)用”，《癌生物治療 (Cancer Biol. Ther))), 2 :206_210，其中作者用 Invitrogen' spLenti6骨架表達(dá) shRNA盒。 Tiscornia, G.等(2003) “使用表達(dá)小干擾RNA的慢病毒載體在小鼠中基因敲除的常規(guī)方 法”《美國國家科學(xué)院院刊》，100 :1844-1848，證明了用于傳遞shRNA至細(xì)胞和小鼠的慢病 毒載體的效用。
有利地，本發(fā)明的載體可以包括僅在腫瘤中驅(qū)動(dòng)shRNA或SiRNA在細(xì)胞中表達(dá)的 腫瘤特異性啟動(dòng)子，或者可以替代地包括現(xiàn)有技術(shù)已知的肝臟特異性啟動(dòng)子，如清蛋白、 α 1抗胰蛋白酶、人類胰島素樣生長因子II。肝臟特異性啟動(dòng)子的詳細(xì)列表可以在肝臟特 異性啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(http://rulai.cshl.edu/LSPD)中找到，以使得本領(lǐng)域技術(shù)人員驅(qū)動(dòng) 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體僅在肝臟中表達(dá)，即是Notch3抑制劑。這個(gè)具體實(shí)施方式
是非常有利的， 因?yàn)镹otch3已經(jīng)在這里被證明僅僅在HCC細(xì)胞中被表達(dá)，在健康或甚至肝硬化肝臟細(xì)胞中 不表達(dá)。因此，根據(jù)本發(fā)明的Notch3的抑制可以不引起瘤節(jié)周圍無HCC的肝細(xì)胞中不想要 的分子改變。這是特別適用，由于在肝細(xì)胞癌患者中的高度的肝硬化。本發(fā)明的藥物組合 物能夠因此實(shí)現(xiàn)靶定的抗癌癥治療，與目標(biāo)為反向推進(jìn)慢性肝病進(jìn)程的方法結(jié)合，以達(dá)到 使多數(shù)患者長期生存。本發(fā)明包括這樣的載體的藥物組合物的優(yōu)點(diǎn)在于它能夠僅在腫瘤中增加化學(xué)療 法藥物的細(xì)胞凋亡效果的事實(shí)，從而明顯降低藥物對周圍健康的或甚至患病的非瘤細(xì)胞的 副作用。同樣適用于本發(fā)明的Notch3抑制劑表示為抗Notch3抗體或由這里描述的任何其 它實(shí)施方式。通常，本發(fā)明的藥物組合物非常有利，藥物的當(dāng)前使用劑量可以由于它僅在表達(dá) Notch3惡性細(xì)胞中的效果的增加而減少。合成的寡核苷酸在分子生物學(xué)的研究、醫(yī)療診斷、 以及新治療藥劑的開發(fā)中很有用。事實(shí)上，它們在基因治療中的應(yīng)用產(chǎn)生被定義為反義的 新領(lǐng)域，提供新一代藥物的合成。該過程基于通過寡核苷酸與mRNA的耦合來達(dá)到主體所表 達(dá)的蛋白被阻斷，因此通過不同途徑抑制基因表達(dá)。醫(yī)學(xué)中，在人類藥物試驗(yàn)中使用反義技 術(shù)已經(jīng)開始，特別是作為抗病毒和抗白血病藥劑。因此，作為對RNA干擾的選擇，Notch3可以通過使用合成寡核苷酸而被抑制。這 樣的合成寡核苷酸能夠裝載在脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體中，且通過門靜脈注射直接傳遞至肝臟。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，將本發(fā)明的合成寡核苷酸傳遞至細(xì)胞是通過脂質(zhì)體/DNA 復(fù)合體(lipoplexes)或多聚物(polyplex)的構(gòu)造完成，由于它們具有保護(hù)寡核苷酸在轉(zhuǎn) 染過程中避免不希望的降解的能力。寡核苷酸，可以在類似膠囊或脂質(zhì)體的組織結(jié)構(gòu)中用脂質(zhì)覆蓋。當(dāng)組織結(jié)構(gòu)與核 酸聯(lián)合，它被稱為脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體。有三種類型的脂質(zhì)，陰離子的(負(fù)電荷)、中性或陽 離子的(正電荷)。起初，陰離子和中性脂質(zhì)用于合成載體的脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體的構(gòu)造。 陽離子脂質(zhì)，由于它們的正電荷，自然地與負(fù)電荷核酸聯(lián)合；并且它們比中性脂質(zhì)的陰離子 消耗少的時(shí)間去制備。另外，由于它們的正電荷，它們也與細(xì)胞膜相互作用，推動(dòng)它們的細(xì)胞內(nèi)吞作用和隨后的細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的釋放。陽離子脂質(zhì)同樣保護(hù)經(jīng)由細(xì)胞的核酸避免降解。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易在本領(lǐng)域找到實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體的方案。脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體最常的應(yīng)用是基因向癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，其中提供的基因激活細(xì)胞中癌抑制劑控制基因和減少致癌基因的活性。新的研究已經(jīng)顯示脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體在 轉(zhuǎn)染的呼吸道上皮細(xì)胞中有作用，所以它們可以用于遺傳性的呼吸道疾病的治療，如囊腫 性纖維化。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，Notch3抑制可以通過使用作為抑制劑的如抗 Notch3抗體或Notch3受體拮抗劑或任何其它能夠阻滯Notch3受體的功能的分子完成。根據(jù)本發(fā)明，抗腫瘤化學(xué)療法藥劑可以從任何合適的已知的引起細(xì)胞凋亡或在細(xì) 胞增殖中起作用的化學(xué)療法藥劑中選擇，但是并不限于這些；化學(xué)療法藥劑可以在包括阿 霉素、5氟二氧嘧啶、紫杉醇、伊立替康、Patupilone、依維莫司、多激酶抑制劑(索拉非尼和 舒尼替尼)、EGFR抑制劑(西妥昔單抗、埃羅替尼、吉非替尼、Brivanib、拉帕替尼)的組中 選擇。本發(fā)明的藥物組合物可以以適于靜脈內(nèi)或組織內(nèi)注射的形式制備，它的制備包括將 Notch3抑制劑與一種或多種如本發(fā)明所定義的抗腫瘤藥物和藥物學(xué)接受的載體混合的步 馬聚ο可選地，兩種活性化合物從兩個(gè)分開的小瓶開始共同施用，或同時(shí)，或當(dāng)抑制劑通 過Notch3mRNA的轉(zhuǎn)錄后抑制起作用，抑制劑可以在抗腫瘤化學(xué)療法藥劑的前6_48小時(shí)施用。因此，本發(fā)明的目的同樣是用于治療肝細(xì)胞癌的、用于共施用Notch3抑制劑、抗 腫瘤化學(xué)療法制劑和藥物學(xué)可接受的載體的藥劑盒，所述藥劑盒包括兩個(gè)小瓶，其中一個(gè) 小瓶包含Notch3抑制劑和藥物學(xué)可接受的載體，另一個(gè)小瓶包含抗腫瘤化學(xué)療法藥劑和 藥物學(xué)可接受的載體。根據(jù)本發(fā)明，包含Notch3抑制劑的小瓶包含Notch3抑制劑，Notch3抑制劑從包括 與編碼Notch3的mRNA互補(bǔ)的siRNA、與編碼Notch3的mRNA互補(bǔ)的shRNA、與編碼Notch3 的mRNA互補(bǔ)的合成寡核苷酸或抗Notch3抗體或Notch3拮抗劑的組中選擇。所述siRNA或 shRNA將插入本發(fā)明的病毒載體中，而合成寡核苷酸將與合適的脂質(zhì)聯(lián)合形成脂質(zhì)體/DNA 復(fù)合體。包含化學(xué)療法藥劑的小瓶將包括化學(xué)療法藥劑，化學(xué)療法藥劑從包含阿霉素、5氟 二氧嘧啶、紫杉醇、伊立替康、Patupilone、依維莫司、多激酶抑制劑(例如索拉非尼和舒尼 替尼)、EGFR抑制劑(例如西妥昔單抗、埃羅替尼、吉非替尼、Brivanib、拉帕替尼)的組中 選擇。通常，當(dāng)組合物包括RNA Notch3抑制劑，所述RNA將插在如上描述的合適的病毒載 體中。因此，本發(fā)明的藥物組合物將包括上述提到的載體和在本說明書中指出的一種或 多種抗腫瘤藥劑。當(dāng)由本發(fā)明的寡核苷酸完成抑制，所述寡核苷酸將被復(fù)合進(jìn)脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體， 所述脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體將在藥物學(xué)可接受的適于靜脈內(nèi)注射溶液中與一種或多種抗腫瘤 化學(xué)療法藥劑(阿霉素、5氟二氧嘧啶、紫杉醇、伊立替康、Patupilone、依維莫司、索拉非尼、舒尼替尼、西妥昔單抗、埃羅替尼、吉非替尼、Brivanib、拉帕替尼)一起 懸浮。假設(shè)是抗Notch3抗體，該抗體將在藥物學(xué)可接受的適于靜脈注射的溶液中與一 種或多種所述的抗腫瘤藥劑一起懸浮。同樣用于當(dāng)Notch3拮抗劑或任何其它能夠封閉Notch3作用的分子被用作Notch3 抑制劑。本發(fā)明的抗腫瘤化學(xué)療法成分的劑量可以減少2-3倍，由于在Notch3抑制的環(huán)境 中所述藥物的效果2-3倍增加。本發(fā)明的藥物組合物可以有利地進(jìn)一步包括用于其它肝臟疾病治療的化合物，所 述其它肝臟疾病與HCC并存，例如用于肝硬化治療的化合物和其它。用于本發(fā)明的組合物的制備的方法因此包括以下步驟a.選擇功能性Notch3抑 制劑，所述抑制劑的特征為抑制Notch3受體的合成或抑制Notch3受體的功能；b.將a.中選擇的抑制劑與一種或多種抗腫瘤化學(xué)療法藥劑和藥物學(xué)可接受的載 體混合。當(dāng)抑制劑是RNA，所述RNA將插在之前指出的合適的載體中，以使得所述RNA在肝 細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明還包括上述藥劑盒制備的方法，包括步驟a.制備包含Notch3抑制劑和藥物學(xué)可接受的載體的第一個(gè)小瓶；b.制備包含一種或多種抗腫瘤化學(xué)療法藥劑和藥物學(xué)可接受的載體的第二個(gè)小瓶。抑制劑和化學(xué)療法藥劑將是本說明書中描述的那些。本發(fā)明的目的同樣是HCC的醫(yī)學(xué)療法，包括對需要的患者施用上述藥物組合物， 以治療上有效的劑量或共施用本發(fā)明的藥劑盒的小瓶的內(nèi)含物，其中第二個(gè)小瓶可以與第 一個(gè)小瓶一起施用或在第一個(gè)小瓶施用的6-48小時(shí)內(nèi)施用。在本發(fā)明的有利的實(shí)施方式中，醫(yī)學(xué)治療將通過注射本發(fā)明的藥物組合物或本發(fā) 明的藥劑盒的第一和第二個(gè)小瓶至門靜脈中以直接傳遞至肝臟而實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的HCC的治療同樣有利地與上面解釋的肝硬化的治療結(jié)合。實(shí)施例1、患者和方法20名進(jìn)行HCC手術(shù)的患者(12名男性和8名女性)進(jìn)入該研究。根據(jù)NIH的指導(dǎo) 方針和最新版的赫爾辛基宣言從每名患者處獲得知情同意。在分析之前，所有患者標(biāo)識符 從所有組織樣品中移除。組織樣品在10%福爾馬林中混合，并包埋在石蠟中用于組織病理 學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)。20個(gè)例子中13個(gè)存在肝硬化(CE)；剩余的例子表現(xiàn)出正常肝臟 (2個(gè)例子)或慢性活動(dòng)性肝炎(CAH，5個(gè)例子)。慢性肝炎的原因，9個(gè)例子歸結(jié)于HCV，5 個(gè)例子歸結(jié)于HBV，4個(gè)例子歸結(jié)于HBV和HCV共感染。由其它正常肝臟產(chǎn)生的HCC的2個(gè) 例子中沒有發(fā)現(xiàn)病毒標(biāo)記。根據(jù)埃德蒙森和斯坦納的標(biāo)準(zhǔn)(31)評價(jià)HCC的組織病理學(xué)等 級。1個(gè)例子被評估為G1，5個(gè)例子為G2，12個(gè)例子為G3，剩下2個(gè)例子為G4。2、免疫組織化學(xué)將福爾馬林固定、石蠟包埋的HCC及相鄰的無腫瘤肝臟切片(4i!m厚)免疫染 色，以探測Notch受體。識別Notch3、Notch4的一抗從SantaCruz生物技術(shù)(Santa Cruz,CA)中獲得，而用于Notchl的一抗從Abcam(Ab8925)中獲得。將多克隆一抗稀釋如下 Notchl(l 600)、Notch3(l 300)以及 Notch4(l 400)。用 HRP (辣根過氧化物酶)兔 子En Vision系統(tǒng)(DAKO，Denmark)和DAB (二氨基聯(lián)苯胺)作為色原體(Sigma，圣路易， 美國)顯示免疫反應(yīng)。固定好的載玻片通過光顯微鏡法檢查，并使用3級系統(tǒng)評估免疫反 應(yīng)，其中0表示沒有著色，1表示最小著色，2表示均質(zhì)和強(qiáng)烈著色。僅具有第2級免疫反應(yīng) 的樣品被認(rèn)為是陽性。3、細(xì)胞培養(yǎng)HCC IfepG2細(xì)胞系從美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物收集所(HB-8065，ATCC，洛克維爾，馬里蘭州， 美國)中獲得。細(xì)胞在補(bǔ)充有10%胎牛血清(FBS)、100U/ml的青霉素和100mg/ml的鏈霉 素(所有試劑均來自ATCC)的Eagle極限必需培養(yǎng)基(MEM)中，在37°C，5% C02培養(yǎng)器中保存。4、shRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)以shOligo表示的shRNA(短發(fā)夾環(huán)RNA)根據(jù)生產(chǎn)商的說明(OligoEngine， Seattle, WA) (32)插入在pSuper. pure表達(dá)載體中。對于Notch3和Notchl受體中 的每一個(gè)，我們制備了兩個(gè)shOligos，以排除非靶shRNA效應(yīng)的可能性。在Notch3和 Notchl 中兩對革巴序列如下Notch3(#l) :5，一ctcccctcaccacctaataaa—3，；Notch3 (#2) 5，-gggggacctgccgccgtggctata-3，；Notchl (#1) :5，-ggccgtcatctccgacttca-3，； Notchl (#2) :5’ -gcctcttcgacggctttga-3'。對于陰性對照，我們制備包含表達(dá)GL2熒光素 酶特異的shRNA的pSuper. puro前病毒的HepG2細(xì)胞群(33)。通過使用磷酸鈣沉淀方法(34)通過將pSuper. puro表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)Phoenix A 包裝細(xì)胞(由Gary Nolan博士友情提供)中制備逆轉(zhuǎn)錄病毒。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)收集病毒上清液，匯集、過濾(孔尺寸0.45i!m)并保 存在_80°C。感染前一天，每個(gè)平板6孔，每孔接種50-70，000個(gè)H印G2細(xì)胞。為達(dá)到 有效的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，將未稀釋的病毒在8 yg/ml聚凝胺(Sigma)存在下，通過 spinoculation(32°C、2200RPM離心45分鐘)施加于細(xì)胞，然后在32°C孵育5小時(shí)。病毒 上清液隨后用新鮮的完全培養(yǎng)基代替，細(xì)胞在37°C恢復(fù)48小時(shí)。在含有1. 8 u g/ml嘌呤霉 素的生長培養(yǎng)基中篩選穩(wěn)定感染的細(xì)胞群。嘌呤霉素的抗性通常在篩選4天后獲得，其中 變換兩次培養(yǎng)基。5、小干擾RNA的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，Notch3shRNA和GL2感染的細(xì)胞接種在無抗生素的MEM 的6孔板中。生長至40 %匯集的H印G2細(xì)胞用40nM的有效的p53siRNA和零亂 RNA(scRNA) (Invitrogen)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，馬上將培養(yǎng)基移除，根據(jù)生產(chǎn)商的建議，使用 Lipofectamine2000和Opti-MEM培養(yǎng)基(invitogen)完成轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后5小時(shí)，培養(yǎng)基用 新鮮的包含培養(yǎng)基的血清代替。通過用熒光素標(biāo)記的siRNA(Invitrogen)的轉(zhuǎn)染測定轉(zhuǎn)染 效率是90%以上。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)收集細(xì)胞，通過Western印跡或采用阿霉素 處理24小時(shí)以檢查p53蛋白的表達(dá)。隨后通過臺(tái)盼藍(lán)染色評估細(xì)胞的存活率。雙向合成用于沉默人類HES1的兩條siRNA序列，用40nM每種siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 HepG2細(xì)胞后72小時(shí)，評估HES1抑制。
6、阿霉素處理HepG2細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群接種在6孔器皿中，并附著24小時(shí)，清洗并培養(yǎng) 在含有100 ii g/ml阿霉素(Sigma)的新鮮的完全培養(yǎng)基中1、3、6、12、18和24小時(shí)。通過 FACS計(jì)算10，000個(gè)結(jié)果探測阿霉素融合。7、細(xì)胞死亡和細(xì)胞毒性分析用所附的阿霉素處理后，在培養(yǎng)基中收集懸浮H印G2細(xì)胞，離心成球，通過臺(tái)盼藍(lán) 染色估計(jì)細(xì)胞死亡程度。通過標(biāo)準(zhǔn)的、臨床LDH(乳酸脫氫酶)釋放試驗(yàn)估定細(xì)胞壞死，該 試驗(yàn)用未處理和阿霉素處理的細(xì)胞的培養(yǎng)基完成。8、RNA 分析根據(jù)生產(chǎn)商的說明，用Triazoldnvitrogen，Paisley，蘇格蘭)制備總細(xì)胞RNA。 4微克的總RNA用DNAsel (Invitrogen)處理以消除污染的基因組DNA。在30 yl反應(yīng)體系 中完成反轉(zhuǎn)錄至cDNAs，反應(yīng)體系包括1XRT緩沖液、0. 4mM dNTPs、5mM二硫蘇糖醇(DTT)、 0. 5iiM 寡聚 dT、3iiM 隨機(jī)引物、240U Superscript II (所有試劑均來自 Invitrogen)。RT 反應(yīng)在42°C、1小時(shí)下完成，然后95°C、5分鐘滅活酶。通過半定量終點(diǎn)PCR擴(kuò)增測定P53、 WAF1、Notchl、HES1和0肌動(dòng)蛋白基因的相對表達(dá)。PCR產(chǎn)物在用溴化乙錠染色的2%瓊 脂糖凝膠中分辨，通過熒光分析(Quantity one，Biorad，CA，美國)進(jìn)行分析。PCR引物如 T" :WAF1 ( JE(n] 5' -aagaccatgtggacctgtca-3‘以U^t^l 5' _ggcttcctcttggagaagat_3，)； P53 ( IE (n] 5' -gacccaggtccagatgaagct-3' Jk 5' -accgtagctgccctggtaggt-3')； HES1 (正向 5，-gctggtgctgtctggatg-3，以及反向 5，-cattcctgctctcgccttc-3，)。9、蛋白分析培養(yǎng)的細(xì)胞溶解在裂解緩沖液中，裂解緩沖液包括10mM Tris_HClpH7. 4、2. 5mM MgCl2U% TritonX lOOUmM DTT、0. ImM 苯甲基磺酰氟(PMSF)、lmM Na3V04、lmM NaF 和蛋白 酶抑制劑(Sigma化學(xué)公司，圣路易，M0)。溶解產(chǎn)物在4°C、15，000 X g離心15分鐘，通過 Bio-Rad蛋白試驗(yàn)(Bio-Rad)分析上清液的蛋白濃度。蛋白在1 XSDS(十二烷基硫酸鈉) loading buffer (65mM Tris_HCl、pH7. 5，65mM 2-巰基乙醇，1 % SDS，10%丙三醇和0. 003% 溴酚藍(lán))中95°C煮10分鐘，用聚丙烯酰胺凝膠分辨，點(diǎn)在硝化纖維膜(Hybond C Extra, Amersham Pharmacia, Little Chalfont，英國)上。膜用麗春紅溶液(Sigma)染色，在PBS 中 用5%脫脂奶粉封閉50分鐘，然后用適當(dāng)?shù)囊豢狗跤?。一抗和稀釋物如下抗Notch3多克 隆抗體(sc-5593，Santa Cruz 生物技術(shù))1 300，抗Gadd45 多克隆抗體(AB3863，Chemicon International, Temecula, CA) 1 1000，抗 p21 單克隆抗體(克隆 SX118，Dako) 1 100， 抗P53單克隆抗體(克隆D0-7，Dako)l 500，抗Kipl/p27單克隆抗體(克隆57，BD生 物科學(xué)，San Jose, CA) 1 2300，分裂的PARP單克隆抗體(9546，細(xì)胞信號技術(shù)，Beverly， MA) 1 200，抗 p-p53 多克隆抗體(sc-18079-R，Santa Cruz 生物技術(shù))1 300，抗 Notchl 多克隆抗體1 200和抗3肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(克隆AC-40，Sigma) 1 1000。在含有0. 吐溫20的PBS(PBST)中反復(fù)清洗后，使用EnVision右旋糖酐多聚 體顯示系統(tǒng)(Dako)將膜用抗鼠或抗兔的HRP結(jié)合的二抗孵育。將膜清洗，通過化學(xué)發(fā)光 反應(yīng)(ECL試劑，Amersham)獲得放射能照相。用Fluor-S多重圖像掃描儀(BioRad)獲 得放射能照相的數(shù)字圖像，信號以使用參考放射能照相的光標(biāo)度之后的吸收率單位、使用 Quantity-one密度計(jì)量學(xué)軟件(BioRad，Hercules, CA)測定數(shù)量。
10、彗星實(shí)驗(yàn)通過堿性彗星實(shí)驗(yàn)定量DNA鏈的斷裂。主要地，在接觸阿霉素之后的不同的時(shí)間 點(diǎn)，將105細(xì)胞植入0.7%低熔點(diǎn)瓊脂糖中，并轉(zhuǎn)移至蓋有顯微鏡載玻片的瓊脂糖上。隨 后，將載玻片在新鮮的裂解緩沖液(2. 5MNaCl、100mM Na2 EDTAUOmM Tris-HCl、1 % Triton X-100、pH 10. 0)中4°C孵育1小時(shí)。然后將載玻片置于充滿冷凍的堿性解鏈/電泳緩沖液 (300mM NaOH、lmM Na2EDTA、pH 13. 0)的水平凝膠電泳槽上，25 分鐘。電泳后(25V，300mA 25分鐘)，用0.4M Tris(pH 7. 5)清洗載玻片，在純乙醇中干燥2分鐘，然后用溴化乙錠 染色。使用熒光顯微鏡(尼康，美國)分析彗星，并通過使用CASP軟件測量“尾距”( ) (‘tailmoment’( ))測定數(shù)量。每個(gè)度量分析50個(gè)細(xì)胞以計(jì)算平均值。11、統(tǒng)計(jì)分析使用StatView 5. 0 (SAS Institute Inc，Cary NC)的統(tǒng)計(jì)功能分析數(shù)據(jù)。結(jié)果表 示為兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的原始數(shù)據(jù)的平均值+標(biāo)準(zhǔn)差(S.E.)。結(jié)果的統(tǒng)計(jì)顯著性使用Student 的t-檢驗(yàn)評價(jià)。P值小于0. 05被認(rèn)為是具有統(tǒng)計(jì)顯著性。12、Notch3蛋白表達(dá)的評價(jià)NotchUNotch 3和Notch 4受體的表達(dá)已通過免疫組織化學(xué)在20對HCC和周圍 組織的樣品中評價(jià)。正常的肝臟和慢性肝炎樣品不表達(dá)這三個(gè)Notch受體中的任何一個(gè)。 在CE和HCC肝臟樣品中，Notchl和Notch4的免疫反應(yīng)沒有顯著差異。但是，在HCC的20 個(gè)中的15個(gè)(75% )腫瘤肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Notch3陽性表達(dá)，而在所有例中CE樣品被認(rèn)為是 陰性，因?yàn)榕紶柨梢栽诜蛛x的肝細(xì)胞中看到Notch3(圖1)。沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤等級、病毒感染和 Notch3表達(dá)之間存在聯(lián)系，即使分析的例子大多數(shù)是高等級腫瘤。這個(gè)評估提供了第一個(gè)體內(nèi)證據(jù)，即上調(diào)的Notch3表達(dá)與肝細(xì)胞腫瘤特異性相 關(guān)聯(lián)，同樣顯示至少與Notchl和Notch4相比，Notch3可以選擇性地參與到HCC存活信號 和/或進(jìn)展中。13、在IfepG2細(xì)胞中Notch3的缺失對特定調(diào)節(jié)因子的影響HepG2細(xì)胞中Notch3的表達(dá)已經(jīng)通過穩(wěn)定的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)用Notch3特異的 shRNA消除，并檢查對細(xì)胞生長和阿霉素敏感性的相應(yīng)效果。相比較于不相關(guān)的GL2熒光特 異shRNA對照病毒，在H印G2細(xì)胞中Notch3蛋白水平通過兩個(gè)不同的Notch3特異shRNA 反轉(zhuǎn)錄病毒大幅度減少(見圖2A的Western印跡)。兩個(gè)Notch3的shRNA產(chǎn)生相等地滲 透 Notch3 敲除(圖 2A-B)。Notch3敲除有差別地影響了與細(xì)胞增殖、DNA修復(fù)和凋亡相關(guān)的特定細(xì)胞蛋白的 水平。如圖2A所示，p27和GADD45 a、P53和活性的p_P53的內(nèi)在水平在Notch3缺失后提 高2-5倍，而p21蛋白水平降低4倍。圖2C中呈現(xiàn)的RNA分析顯示p53和p21基因轉(zhuǎn)錄的 比較結(jié)果。此外，Notch細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的直接目標(biāo)的HES1的表達(dá)，同樣通過Notch3敲除而減 少。14、在阿霉素處理的H印G2細(xì)胞中Notch3敲除效果已經(jīng)研究過是否Notch3賦予H印G2肝癌細(xì)胞抗阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抗性。通 過在感染一周后用碘化丙啶染色和流式細(xì)胞儀評價(jià)(數(shù)據(jù)沒有顯示)，用任一 Notch3shRNA 的感染沒有改變H印G2生長率。但是，在對阿霉素分別處理6和24小時(shí)的反應(yīng)中，通過臺(tái)盼 藍(lán)染色排除顯示，穩(wěn)定表達(dá)Notch3shRNA的H印G2細(xì)胞的死亡率(與熒光素酶shRNA陰性對照比較)成兩倍和三倍(圖3)。阿霉素處理還引起了 PARP的分裂。PARP是包含在DNA 修復(fù)中的115kDa核蛋白，是在細(xì)胞凋亡反應(yīng)中分裂的最早的蛋白之一。在阿霉素處理6小 時(shí)后，在Notch3缺失細(xì)胞中，觀察到PARP細(xì)胞凋亡特異的89kDa分裂片段的積聚明顯增加 (圖 4)。彗星實(shí)驗(yàn)已大量用于測量對不同DNA破壞試劑的應(yīng)答中的DNA損傷。在這個(gè)實(shí)驗(yàn) 中，分裂的DNA從核中移動(dòng)形成顯現(xiàn)為具有圓形頭部和尾巴的細(xì)胞的彗星。通過彗星實(shí)驗(yàn) 測量的基礎(chǔ)DNA損傷顯示GL2對照細(xì)胞與Notch3缺失細(xì)胞具有相同的內(nèi)在DNA損傷度(P =0. 6686)。做時(shí)間過程分析以檢測在GL2對照和Notch3不足的細(xì)胞中由阿霉素誘導(dǎo)的 DNA鏈斷裂。這個(gè)分析顯示了在Notch3不足的細(xì)胞中，與明顯更高的DNA損傷水平一同獲 得的“TM”值有時(shí)間依賴性增加(圖5A)。在用阿霉素處理24小時(shí)后，Notch3缺失的細(xì)胞 強(qiáng)烈地?fù)p傷以至于不可能定量DNA分裂程度。FACS分析同樣顯示Notch3缺失細(xì)胞比GL2 陰性對照細(xì)胞獲得和/或保持更高的阿霉素水平，在阿霉素處理僅3小時(shí)后對阿霉素吸收 具有明顯不同(圖5B)。15、在阿霉素處理的IfepG2細(xì)胞中的Notchl缺失盡管不同的研究已證明高p21水平保護(hù)人類癌癥細(xì)胞在化學(xué)療法和放射療法治 療中免于凋亡，我們研究了在Notch3缺失細(xì)胞中下調(diào)的p21是否會(huì)涉及H印G2細(xì)胞對阿霉 素的敏感性。在先的HCC細(xì)胞系研究顯示Notchl的過量表達(dá)通過p21上調(diào)抑制細(xì)胞生長。 與這個(gè)觀察一致，通過免疫印跡分析已發(fā)現(xiàn)通過目標(biāo)shRNA敲除的Notchl表達(dá)的損失極大 地減少了 P21蛋白的表達(dá)(圖6)。但是，NotchlKD對p21表達(dá)的抑制效果與P53和p_P53 表達(dá)無關(guān)，因?yàn)樗鼈兊乃經(jīng)]有被Notchl缺失影響(圖6)。重要地，不同于Notch3的消 除，Notchl的損失未能使HepG2細(xì)胞對阿霉素介導(dǎo)的細(xì)胞死亡敏感(圖10)。因此我們在 HepG2細(xì)胞中的發(fā)現(xiàn)不能支持p21在HepG2細(xì)胞對阿霉素依賴的細(xì)胞凋亡的敏感性中的作 用。16、在阿霉素處理的Notch3缺失細(xì)胞中P53的消除在Notch3敲除細(xì)胞中消除P53的表達(dá)，以測定在對阿霉素處理的Notch3缺失細(xì) 胞增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡反應(yīng)中P53的重要性。在Notch3KD和GL2對照IfepG2細(xì)胞中消除內(nèi)源 P53表達(dá)，通過有效的陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染雞尾酒p53特異性siRNA對照不相關(guān)的siRNA 的零亂混合物(scRNA)。Western印跡顯示相比于scRNA陰性對照，轉(zhuǎn)染P53特異siRNA后， P53蛋白水平引人注意地分別在48小時(shí)減少，在72小時(shí)無法檢測到(圖7)。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用100ii g/ml的阿霉素處理24小時(shí)。有趣地，P53的下調(diào)明確地排 除了 Notch3缺失細(xì)胞的多數(shù)增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡反應(yīng)。如圖8所示，在阿霉素處理后，在轉(zhuǎn)染 p53siRNA的Notch3缺失細(xì)胞中細(xì)胞存活率為40%，相比于轉(zhuǎn)染scRNA的Notch3缺失細(xì)胞 中細(xì)胞存活率為75%。但是，P53的損耗沒有影響GL2感染細(xì)胞對阿霉素的敏感性(圖8)， 因此說明內(nèi)源Notch3阻止內(nèi)源P53擴(kuò)大阿霉素的死亡促進(jìn)效果的能力。
權(quán)利要求
一種用于治療肝細(xì)胞癌的藥物組合物，包括Notch3抑制劑、一種或多種抗腫瘤化學(xué)療法藥劑和藥物學(xué)可接受的載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述的Notch3抑制劑從包括與編 碼Notch3的mRNA互補(bǔ)的siRNA、與編碼Notch3的mRNA互補(bǔ)的shRNA、與編碼Notch3的 mRNA互補(bǔ)的合成寡核苷酸、抗Notch3抗體和Notch3拮抗劑的組中選擇。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于，所述的siRNA或shRNA插在包含腫 瘤特異啟動(dòng)子或肝臟特異啟動(dòng)子的病毒載體中。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于，所述的合成寡核苷酸插入在脂質(zhì) 體/DNA復(fù)合物中。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的藥物組合物，其特征在于，所述的抗腫瘤化學(xué)療 法藥劑是引起細(xì)胞凋亡或在細(xì)胞增殖中起作用的藥劑。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的藥物組合物，其特征在于，所述的抗腫瘤化學(xué)療 法藥劑在包括阿霉素、5氟二氧嘧啶、紫杉醇、伊立替康、Patupilone、依維莫司、多激酶抑制 劑、EGFR抑制劑的組中選擇。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述的多激酶抑制劑選自包括索 拉非尼和舒尼替尼的組，以及所述的EGFR抑制劑選自包括西妥昔單抗、埃羅替尼、吉非替 尼、Brivanib和拉帕替尼的組。
8.一種用于治療肝細(xì)胞癌的用于共施用Notch3抑制劑、抗腫瘤化學(xué)療法藥劑和藥物 學(xué)可接受的載體的藥劑盒，所述藥劑盒包括含有Notch3抑制劑和藥物學(xué)可接受的載體的 第一個(gè)小瓶，含有一種或多種抗腫瘤化學(xué)療法藥劑和藥物學(xué)可接受的載體的第二個(gè)小瓶或 更多小瓶，每一個(gè)小瓶包含抗腫瘤化學(xué)療法藥劑和藥物學(xué)可接受的載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥劑盒，其特征在于，所述的Notch3抑制劑從包括與編碼 Notch3的mRNA互補(bǔ)的siRNA、與編碼Notch3的mRNA互補(bǔ)的shRNA、與編碼Notch3的mRNA 互補(bǔ)的合成寡核苷酸、抗Notch3抗體和Notch3拮抗劑的組中選擇。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥劑盒，其特征在于，所述的siRNA或shRNA插在包含腫瘤 特異啟動(dòng)子或肝臟特異啟動(dòng)子的病毒載體中。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥劑盒，其特征在于，所述的合成寡核苷酸插在脂質(zhì)體/DNA 復(fù)合物中。
12.根據(jù)權(quán)利要求8-11任何一項(xiàng)所述的藥劑盒，其特征在于，所述的抗腫瘤化學(xué)療法 藥劑在包括阿霉素、5氟二氧嘧啶、紫杉醇、伊立替康、Patupilone、依維莫司、多激酶抑制 劑、EGFR抑制劑的組中選擇。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥劑盒，其特征在于，所述的多激酶抑制劑選自包括索拉 非尼和舒尼替尼的組，以及所述的EGFR抑制劑選自包括西妥昔單抗、埃羅替尼、吉非替尼、 Brivanib和拉帕替尼的組。
14. 一種用于權(quán)利要求1-7任何一項(xiàng)所述的藥物組合物的制備的方法，包括步驟a、選擇功能性Notch3抑制劑，所述的抑制劑的特征為抑制Notch3受體的合成或抑制 Notch3受體的功能，b、將a中選擇的抑制劑與一種或多種抗腫瘤化學(xué)療法藥劑和藥物學(xué)可接受的載體混合。
15.一種用于權(quán)利要求8-13任何一項(xiàng)所述的藥劑盒的制備的方法，包括步驟a、選擇功能性Notch3抑制劑，所述抑制劑的特征為抑制Notch3受體的合成或抑制 Notch3受體的功能，并將所述抑制劑與藥物學(xué)可接受的載體等分至第一個(gè)小瓶中，b、向第二個(gè)小瓶等分一種或多種抗腫瘤化學(xué)療法藥劑和藥物學(xué)可接受的載體。
16.一種HCC的醫(yī)學(xué)療法，包括對需要的患者施用治療上有效量的權(quán)利要求1-7任何一 項(xiàng)所述的藥物組合物。
17.—種HCC的醫(yī)學(xué)療法，包括對需要的患者共施用治療上有效量的權(quán)利要求8-13任 何一項(xiàng)所述的藥劑盒的第一個(gè)和第二個(gè)小瓶的內(nèi)含物或第一個(gè)和更多個(gè)小瓶的內(nèi)含物。
全文摘要
本發(fā)明提供用于治療肝細(xì)胞癌(HCC)的包括Notch3抑制劑和化學(xué)療法藥劑的藥物組合物，用于制備所述組合物的方法和包括對有需要的患者施用所述藥物組合物的醫(yī)學(xué)療法。
文檔編號A61P35/00GK101808648SQ200780100794
公開日2010年8月18日 申請日期2007年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月25日
發(fā)明者卡蒂亞·焦萬尼尼, 帕斯夸萊·基耶科, 肯尼思·馬爾庫, 路易吉·博倫迪 申請人:博洛尼亞大學(xué)阿爾瑪母校研究室