雌激素及其受體激動(dòng)劑在制備抗肝細(xì)胞肝癌藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及雌激素及其受體激動(dòng)劑的新用途，尤其涉及雌激素及其受體激動(dòng)劑在制備抗肝細(xì)胞肝癌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肝細(xì)胞肝癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，居我國(guó)惡性腫瘤發(fā)生率的第四位。肝細(xì)胞肝癌惡性程度高，病情發(fā)展快，預(yù)后差，平均生存期6-8月，其死亡率占我國(guó)惡性腫瘤的第二位，僅次于肺癌。由于肝細(xì)胞肝癌對(duì)臨床上使用的化療藥物均不敏感，目前臨床上治療肝細(xì)胞肝癌有效的方法仍然是外科手術(shù)治療。但由于肝細(xì)胞肝癌病情發(fā)展快，大多數(shù)患者就診時(shí)由于較差的肝功能情況、基礎(chǔ)的肝臟疾病或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，已經(jīng)不適宜進(jìn)行外科手術(shù)治療。即使少數(shù)能進(jìn)行外科手術(shù)治療的病人，手術(shù)后仍然具有較高的復(fù)發(fā)率。而且，目前對(duì)肝細(xì)胞肝癌手術(shù)后的復(fù)發(fā)仍無(wú)有效的治療方法。近年來(lái)，隨著腫瘤細(xì)胞分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，人們?cè)谘芯繝?zhēng)對(duì)肝細(xì)胞肝癌的分子靶向治療。目前，索拉非尼(Sorafenib:是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血小板源生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子和胰島素生長(zhǎng)因子等多種激酶的抑制劑)已經(jīng)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)作為肝細(xì)胞肝癌的治療。但廣泛的臨床試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與安慰劑相比，索拉非尼延長(zhǎng)病人的生存期僅僅3月。而且，索拉非尼價(jià)格昂貴。因此，對(duì)于具有可怕預(yù)后的肝細(xì)胞肝癌，尋找其有效的治療藥物仍然是迫切需要的。
[0003]雌激素是一種女性激素，由卵巢和胎盤產(chǎn)生。腎上腺皮質(zhì)也產(chǎn)生少數(shù)雌激素。女性兒童進(jìn)入青春期后，卵巢開始分泌雌激素，以促進(jìn)陰道、子宮、輸卵管和卵巢本身的發(fā)育，同時(shí)子宮內(nèi)膜增生而產(chǎn)生月經(jīng)。雌激素還能促使皮下脂肪堆積，使體態(tài)豐滿；乳腺增生，乳頭乳暈著色，并產(chǎn)生性愛(ài)和性欲；促使體內(nèi)鈉和水的潴留，骨中鈣的沉積等。雌激素主要來(lái)源于卵泡內(nèi)膜細(xì)胞和卵泡顆粒細(xì)胞。在卵泡發(fā)育過(guò)程中，先經(jīng)LH刺激卵泡內(nèi)膜分泌睪酮，再經(jīng)顆粒細(xì)胞在FSH刺激下轉(zhuǎn)化為雌二醇，即“雙細(xì)胞雙促性素作用模式”。此外腎上腺皮質(zhì)、胎盤和雄性動(dòng)物睪丸也有分泌。這里雌激素的定義是雌二醇，卵巢功能衰竭后，雌二醇急劇下降引起更年期綜合征等雌二醇缺乏疾病。
[0004]已知的雌激素的用途主要是可以刺激卵泡發(fā)育，間接影響卵巢功能。它能加速卵子在輸卵管的運(yùn)行速度，還可對(duì)子宮內(nèi)膜和平滑肌的代謝有明顯促進(jìn)作用。另外，適量的雌激素為胚泡著床所必需。雌激素還可促進(jìn)陰道上皮基底層細(xì)胞增生、分化、成熟以及角化和引起核致密變化。雌激素不僅可以刺激人類乳腺導(dǎo)管的生長(zhǎng)，也能促進(jìn)乳腺腺泡的發(fā)育及乳汁生成。雌激素一方面可以刺激腎上腺皮質(zhì)激素分泌和對(duì)抗生長(zhǎng)激素的作用，表現(xiàn)為促進(jìn)蛋白分解；另一方面，對(duì)肝臟則有蛋白同化作用，可以刺激多種血漿蛋白的合成。有促進(jìn)骨質(zhì)致密的作用，但能使骨骺提早閉合和骨化而影響骨的長(zhǎng)度增加。絕經(jīng)期婦女可用雌激素治療骨質(zhì)疏松癥。在心血管方面，雌激素可以降低血管通透性，降低血清膽固醇。
[0005]但迄今為止，未發(fā)現(xiàn)雌激素在抗肝細(xì)胞肝癌藥物中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供雌激素及其受體激動(dòng)劑在制備治療肝細(xì)胞肝癌藥物中的應(yīng)用，它發(fā)現(xiàn)雌激素能有效的抑制肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的凋亡，可以成為治療肝細(xì)胞肝癌的新的藥物。
[0007]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:
1.本發(fā)明通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示雌激素抑制了人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)；
2.通過(guò)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示雌激素抑制了人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞在肝臟內(nèi)的生長(zhǎng)，抑制了人肝細(xì)胞肝癌組織內(nèi)Ki67和PCNA的表達(dá)，抑制了化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生。
[0008]3.通過(guò)進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示雌激素明顯的誘導(dǎo)了人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的凋亡。
[0009]雌激素主要通過(guò)雌激素受體發(fā)揮作用，雌激素受體激動(dòng)劑與雌激素可以獲得相同的作用。
[0010]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)雌激素能有效地抑制肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，抑制肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生，誘導(dǎo)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的凋亡。雌激素及其受體激動(dòng)劑是可以應(yīng)用于制備能有效治療肝細(xì)胞肝癌的藥物，而雌激素及其受體激動(dòng)劑在制備抗肝細(xì)胞肝癌藥物中的用途屬于首次公開，而且其在對(duì)于抑制人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)方面有意想不到的作用，因此具備了突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1展示了雌激素對(duì)人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞SMMC7721、H印G2、BEL7404、Huh7、MHCC-97L、MHHCC-97H、PLC/PRF/5、SK-HEP-l、HCCLM3 和 BEL7402 細(xì)胞增殖的影響。
[0012]圖2展示了雌激素對(duì)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞克隆形成能力和生長(zhǎng)曲線的影響。
[0013]圖3展示了雌激素對(duì)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞HepG2肝內(nèi)生長(zhǎng)以及細(xì)胞內(nèi)Ki67和PCNA表達(dá)的影響。
[0014]圖4展示了雌激素對(duì)小鼠肝細(xì)胞肝癌發(fā)生的影響。
[0015]圖5展示了雌激素對(duì)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞SMMC7721和!fepG2凋亡的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí)施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
[0017]實(shí)施例1:
本發(fā)明所涉及的雌激素片劑的制備:
取17 β-雌二醇20g，加入制備片劑的常規(guī)輔料180g，混勻，并用常規(guī)壓片機(jī)制備成片劑1000片。
[0018]實(shí)施例2:
本發(fā)明所涉及的雌激素膠囊劑的制備:
取17 β -雌二醇20g，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料180g，混勻，并裝膠囊制備成膠囊劑1000 粒。
[0019]實(shí)施例3:本發(fā)明所涉及的雌激素丸劑的制備: 取17 β-雌二醇20g，加入制備丸劑的常規(guī)輔料180g，混勻，制備成丸劑1000丸。
[0020]實(shí)施例:4:
本發(fā)明所涉及的雌激素注射液的制備:
取17 β -雌二醇lg，加入2ml無(wú)菌的溶液制備成雌激素注射液。
[0021]下面通過(guò)具體的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明雌激素及其受體激動(dòng)劑在抗肝細(xì)胞肝癌藥物中的活性。
[0022]實(shí)驗(yàn)例1:雌激素對(duì)人的肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞增殖的影響:
我們選用了 10株人的肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞株，分別在體外與不同劑量的17 β -雌二醇(Ε2)培養(yǎng) 24、48 和 72 小時(shí)，通過(guò) MTT [(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, 3- (4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽】方法分析不同劑量的17β-雌二醇(E2)在與這些細(xì)胞作用不同時(shí)間后對(duì)這些肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞增殖的影響。MTT方法是一種常用檢測(cè)細(xì)胞存活和增殖的方法，已廣泛用于大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)等。結(jié)果顯示17 β -雌二醇呈劑量和時(shí)間依懶性地抑制了人的肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的增殖(見(jiàn)圖1)。
[0023]圖1展示了雌激素對(duì)人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞SMMC7721、H印G2、BEL7404、Huh7、MHCC-97L、MHHCC-97H、PLC/PRF/5、SK-HEP-1、HCCLM3 和 BEL7402 細(xì)胞增殖的影響。17 β -雌二醇(Ε2)呈劑量和時(shí)間依賴性地抑制了人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的增殖。在每一系列中η = 6。
[0024]實(shí)驗(yàn)例2:雌激素對(duì)人的肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的克隆形成能力和生長(zhǎng)曲線的影響: 腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)均以克隆原細(xì)胞(干細(xì)胞)的增殖為基礎(chǔ)。集落形成實(shí)驗(yàn)反映了單個(gè)克隆活細(xì)胞的增殖能力，是測(cè)定抗癌藥活性最可靠的指標(biāo)。我們進(jìn)一步選用人的肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞SMMC7721和H印G2通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)研究雌激素對(duì)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞克隆形成能力的影響。在細(xì)胞與17β-雌二醇(Ε2)作用2周后，結(jié)果顯示隨著17 β-雌二醇(Ε2)濃度的升高，人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞SMMC7721和H印G2的集落形成能力逐漸下降。在17 β-雌二醇5 μ M和10μ M組，在兩個(gè)細(xì)胞株都完全沒(méi)有集落形成(見(jiàn)圖2中A部分)。提示雌激素對(duì)人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞HepG2及SMMC-7721的克隆原細(xì)胞具有明顯抑制作用。
[0025]我們進(jìn)