專利名稱：用于對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行診斷的單核苷酸多態(tài)性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于對(duì)肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)、使用該SNP對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的微陣列或測(cè)試試劑盒、以及篩選減少肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的藥物的方法。
背景技術(shù)：
從癌癥發(fā)育和死亡的角度來(lái)看，在韓國(guó)，肝細(xì)胞癌(HCC)是所有惡性腫瘤中第三常見(jiàn)且嚴(yán)重的癌癥。肝細(xì)胞癌是最富血管性的腫瘤之一。對(duì)HCC進(jìn)行治療的最有效的方式是外科切除術(shù)或肝移植。然而，由于不能移除的腫瘤的大小和數(shù)量、肝功能不良、各種肝內(nèi)轉(zhuǎn)移或肝外轉(zhuǎn)移等原因，只有10%-20%的肝細(xì)胞癌患者能進(jìn)行手術(shù)。即使對(duì)于可進(jìn)行手術(shù)的肝細(xì)胞癌患者來(lái)說(shuō)，頻繁的術(shù)后復(fù)發(fā)也是長(zhǎng)期 生存率的主要限制因素。肝細(xì)胞癌的發(fā)育和快速發(fā)展涉及多種機(jī)制。其中，通過(guò)缺氧促進(jìn)血管生成起了非常重要的作用。另外，在肝中的缺氧環(huán)境下，轉(zhuǎn)移性腫瘤抗原I (MTAl)通過(guò)在結(jié)構(gòu)上使缺氧誘導(dǎo)因子I (HIF I)穩(wěn)定來(lái)增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)，從而有助于惡性腫瘤的血管生成(MoonEJ 等，2004 ；Moon EJ 等，2006)。同時(shí)，在感染乙型肝炎病毒后，約有5%_10%變成慢性乙型肝炎，其中一些可能會(huì)發(fā)展成肝硬化或肝細(xì)胞癌。像這樣，可以理解的是，感染乙型肝炎病毒后所表現(xiàn)出的各種臨床發(fā)展取決于每個(gè)個(gè)體的遺傳易感性(genetic predisposition)的差異和病毒自身的差
巳遺傳易感性意味著在個(gè)體間的不同基因中存在細(xì)微差異。近年來(lái)，通過(guò)基因組研究報(bào)道了不同個(gè)體間的差異水平。在遺傳變異中，已知單核苷酸多態(tài)性(SNP)改變基因功能，并且迄今為止在人類基因組中已報(bào)道了約1100萬(wàn)個(gè)SNP中的710，000個(gè)多態(tài)性(NCBI，dbSNP)。近年來(lái)，為了確定堿基序列中的細(xì)微變化是否確實(shí)影響對(duì)某些疾病的敏感性(susceptibilities)、以及為了發(fā)現(xiàn)對(duì)疾病易感的遺傳變異，正在積極地進(jìn)行著大量研究(Ludwig JA 和 Weinstein JN, 2005 ；Suh Y 和 Vijgj，2005 ;Chanock S，2001)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題為解決傳統(tǒng)技術(shù)中的上述問(wèn)題，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SNP表現(xiàn)出與肝細(xì)胞癌術(shù)后的復(fù)發(fā)具有有意義的相關(guān)性。由此完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明的目的是提供用于對(duì)肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)0另外，本發(fā)明的另一目的是提供使用單核苷酸多態(tài)性(SNP)對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的微陣列。
另外，本發(fā)明的另一目的是提供對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的測(cè)試試劑盒。另外，本發(fā)明的另一目的是提供使用單核苷酸多態(tài)性(SNP)對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的方法。另外，本發(fā)明的另一目的是提供使用單核苷酸多態(tài)性(SNP)篩選預(yù)防肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的藥物的方法。技術(shù)方案為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的示例性實(shí)施方式提供了用于對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中，所述SNP包括選自于由下列多核苷酸或者它們的互補(bǔ)核苷酸所組成的組中的至少一種多核苷酸IGF2基因的-291C/G(rs3213221)[SEQ ID NO. I]中的C等位基因(CC基因型或GC基因型);IGF2基因的-13021C/T(rs3741208) [SEQ IDN0. 2]中的T等位基因(CT基因型或TT基因型)；FGF2基因的66378C/T (rsl048201) [SEQ IDNO. 3]中的T等位基因(CT基因型或TT基因型);FGF2基因的50012A/G (rs6534367) [SEQ ID NO. 4]中的G等位基因(GG基因型或GA基因型)；IGF2基因的6310 (rs2585) [SEQ IDNO. 5] /4702 (rs3802971) [SEQ ID NO. 6]中的 GC 單倍型；IGF2 基因的-11228 (rs2239681)[SEQ ID NO. 7]/-13021 (rs3741208) [SEQ ID NO. 2]中的純合 CC 單倍型；以及 IGF2 基因的-11228 (rs2239681) [SEQ ID NO. 7]/-13021 (rs3741208) [SEQ ID NO. 2]中的 CT 單倍型。肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)可能與經(jīng)根治性外科切除術(shù)治療的HCC患者的根治性外科切除術(shù)后的肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)相關(guān)。另外，本發(fā)明的示例性實(shí)施方式提供了用于對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的微陣列，其中，所述微陣列包含用于對(duì)根治性外科切除術(shù)后的肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的多核苷酸、由該多核苷酸編碼的多肽或其cDNA。另外，本發(fā)明的示例性實(shí)施方式提供了用于對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的測(cè)試試劑盒，所述試劑盒包含所述微陣列。除本發(fā)明的微陣列外，本發(fā)明所述的測(cè)試試劑盒可進(jìn)一步包含引物組，所述引物組用于從臨床樣本中分離和擴(kuò)增出包含相關(guān)SNP的DNA。另外，本發(fā)明的實(shí)施方式提供了用于對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的測(cè)試試劑盒，所述試劑盒利用單堿基延伸(SBE)反應(yīng)對(duì)SNP進(jìn)行基因分型。對(duì)利用單堿基延伸反應(yīng)來(lái)預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的測(cè)試試劑盒進(jìn)行設(shè)計(jì)，以證實(shí)是否存在下述基因型IGF2基因的-291C/G(rs3213221)[SEQID NO. I]中的C等位基因(CC基因型或 GC 基因型);IGF2 基因的-13021C/T (rs3741208) [SEQ ID NO. 2]中的 T 等位基因(CT基因型或 TT 基因型);IGF2 基因的 6310 (rs2585) [SEQ ID NO. 5]/4702 (rs3802971) [SEQID NO. 6]中的純合GC單倍型；以及 IGF2基因的-11228(rs2239681)[SEQ ID NO. 7]/-13021(rs3741208) [SEQ ID NO. 2]中的 CT 單倍型。本發(fā)明的實(shí)施方式提供了用于對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的測(cè)試試劑盒，所述試劑盒利用了單堿基延伸反應(yīng)，所述試劑盒包含用于擴(kuò)增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區(qū)的正向引物；用于擴(kuò)增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區(qū)的反向引物；用于對(duì)IGF2基因的-13021 (rs3741208)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物；用于擴(kuò)增IGF2基因的6310 (rs2585)區(qū)的正向引物；用于擴(kuò)增IGF2基因的6310(rs2585)區(qū)的反向引物；用于對(duì)IGF2基因的6310(rs2585)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物；用于擴(kuò)增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區(qū)的正向引物；用于擴(kuò)增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區(qū)的反向引物；用于對(duì)IGF2基因的-11228(rs2239681)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物；用于擴(kuò)增IGF2基因的4702 (rs3802971)區(qū)的正向引物；用于擴(kuò)增IGF2基因的4702 (rs3802971)區(qū)的反向引物；用于對(duì)IGF2基因的4702(rs3802971)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物；用于擴(kuò)增IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區(qū)的正向引物；用于擴(kuò)增IGF2基因的-291C/G(rs3213221)區(qū)的反向引物；以及用于對(duì)IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物。根據(jù)實(shí)施方式，在用于對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的測(cè)試試劑盒中，用于擴(kuò)增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區(qū)的正向引物可為引物SEQ IDN0. 17 ;用于擴(kuò)增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區(qū)的反向引物可為引物SEQ ID NO. 18 ;用于對(duì)IGF2基因的-13021(rs3741208)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物可為引物SEQ ID NO. 35 ;用于擴(kuò)增IGF2基因的6310(rs2585)區(qū)的正向引物可為引物SEQ ID NO. 20 ;用于擴(kuò)增IGF2基因的6310 (rs2585)區(qū)的反向引物可為引物SEQ ID NO. 21 ;用于對(duì)IGF2基因的6310 (rs2585)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物可為引物SEQ ID NO. 36 ;用于擴(kuò)增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區(qū)的正向引物可為引物SEQ ID NO. 37 ;用于擴(kuò)增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區(qū)的反向引物可為引 物SEQ ID NO. 38 ;用于對(duì)IGF2基因的-11228 (rs2239681)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物可為引物SEQ ID NO. 39 ;用于擴(kuò)增IGF2基因的4702 (rs3802971)區(qū)的正向引物可為引物SEQ IDNO. 40 ;用于擴(kuò)增IGF2基因的4702 (rs3802971)區(qū)的反向引物可為引物SEQ ID NO. 41 ;用于對(duì)IGF2基因的4702 (rs3802971)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物可為引物SEQ IDN0. 42;用于擴(kuò)增IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區(qū)的正向引物可為引物SEQ ID NO. 43 ;用于擴(kuò)增IGF2基因的-291C/G(rs3213221)區(qū)的反向引物可為引物SEQ ID NO. 44 ;以及用于對(duì)IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物可為引物SEQ ID NO. 45。另外，本發(fā)明提供了用于對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的方法，所述方法包括從臨床樣本中獲得核酸樣品的步驟；以及測(cè)定選自于由下列多核苷酸或者它們的互補(bǔ)核苷酸所組成的組中的至少一種多核苷酸的至少任何一個(gè)多態(tài)性區(qū)的核苷酸序列的步驟IGF2基因的-291C/G (rs3213221)中的C等位基因(CC基因型或GC基因型);IGF2基因的-13021C/T(rs3741208)中的T等位基因(CT基因型或TT基因型);FGF2基因的66378C/T(rsl048201)中的T等位基因(CT基因型或TT基因型)；FGF2基因的50012A/G (rs6534367)中的G等位基因(GG基因型或GA基因型)；IGF2基因的6310 (rs2585) /4702 (rs3802971)中的GC單倍型；IGF2 基因的-11228 (rs2239681) /-13021 (rs3741208)中的純合 CC 單倍型；和IGF2 基因的-11228 (rs2239681) /-13021 (rs3741208)中的 CT 單倍型。測(cè)定多態(tài)性區(qū)的核苷酸序列的步驟可包括如下步驟使所述核酸樣品與固定有多核苷酸或其互補(bǔ)核苷酸的微陣列進(jìn)行雜交的步驟；以及對(duì)由此得到的雜交結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)的步驟。另外，本發(fā)明提供了篩選用于預(yù)防肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的藥物的方法，所述方法包括如下步驟使多肽與候選材料相接觸的步驟，所述多肽由對(duì)肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的多核苷酸或其互補(bǔ)核苷酸編碼；以及對(duì)所述候選材料是否具有增強(qiáng)或抑制該多肽功能的活性進(jìn)行測(cè)定的步驟。技術(shù)效果
根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)利用對(duì)肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，可開(kāi)發(fā)出用于對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的微陣列或測(cè)試試劑盒；并且，通過(guò)篩選用于減少肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的藥物可預(yù)防肝細(xì)胞癌的術(shù)后復(fù)發(fā)。


圖I示出了取決于IGF2基因的-291C/G (rs3213221)位點(diǎn)的基因型的肝細(xì)胞癌
累積復(fù)發(fā)率；圖2示出了取決于IGF2基因的-13021C/T (rs3741208)位點(diǎn)的基因型的肝細(xì)胞
癌累積復(fù)發(fā)率；圖3 示出了取決于 IGF2 基因的 6310 (rs2585) /4702 (rs3802971)的 GC 單倍型 的肝細(xì)胞癌累積復(fù)發(fā)率；圖 4 示出了取決于 IGF2 基因的-11228 (rs2239681)/_13021 (rs3741208)的 CC單倍型的肝細(xì)胞癌累積復(fù)發(fā)率；圖 5 示出了取決于 IGF2 基因的-11228 (rs2239681)/_13021 (rs3741208)的 CT單倍型的肝細(xì)胞癌累積復(fù)發(fā)率；以及圖6-圖8示出了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，使用用于預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的測(cè)試試劑盒進(jìn)行基因分型的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了用于對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，所述SNP包括選自于由下列多核苷酸或者它們的互補(bǔ)核苷酸所組成的組中的至少一種多核苷酸IGF2基因的-291C/G(rs3213221)[SEQ ID NO. I]中的C等位基因(CC基因型或 GC 基因型);IGF2 基因的-13021C/T (rs3741208) [SEQ ID NO. 2]中的 T 等位基因(CT基因型或TT基因型);FGF2基因的66378C/T (rsl048201) [SEQ ID NO. 3]中的T等位基因(CT基因型或TT基因型);FGF2基因的50012A/G(rs6534367)[SEQ ID NO. 4]中的G等位基因(GG 基因型或 GA 基因型);IGF2 基因的 6310 (rs2585)[SEQ ID NO. 5]/4702 (rs3802971)[SEQ ID NO. 6]中的 GC 單倍型；IGF2 基因的-11228 (rs2239681) [SEQ ID NO. 7]/-13021(rs3741208) [SEQ ID NO. 2]中的純合 CC 單倍型；以及 IGF2 基因的-11228 (rs2239681)[SEQ ID NO. 7]/-13021 (rs3741208) [SEQ ID NO. 2]中的 CT 單倍型。另外，肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)可能與經(jīng)根治性外科切除術(shù)治療的肝細(xì)胞癌患者的肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)相關(guān)。另外，本發(fā)明提供了用于對(duì)肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的微陣列，所述微陣列包含用于對(duì)肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的多核苷酸、由所述多核苷酸編碼的多肽或其cDNA?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的通用方法制造用于對(duì)肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的微陣列，例如，可將包含于對(duì)肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)進(jìn)行診斷的微陣列中的多核苷酸固定至包被有活性基團(tuán)的基底上，所述活性基團(tuán)選自于由氨基硅烷、聚-L-賴氨酸和醛所組成的組，并且所述基底可選自于由硅片、玻璃、石英、金屬和塑料所組成的組。將多核苷酸固定至基底的方法可包括采用壓電方式的微量移液方法、采用針式點(diǎn)樣器(spotter of pin type)的方法等。另外，本發(fā)明提供了對(duì)肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的測(cè)試試劑盒，所述試劑盒包含所述微陣列。除包含本發(fā)明的微陣列外，本發(fā)明的測(cè)試試劑盒可進(jìn)一步包含引物組，所述引物用于從臨床樣本中分離和擴(kuò)增出包含相關(guān)SNP的DNA。參考本發(fā)明的序列，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地設(shè)計(jì)出合適的引物組。另外，本發(fā)明的實(shí)施方式提供了對(duì)肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的測(cè)試試劑盒，所述試劑盒利用單堿基延伸(SBE)反應(yīng)來(lái)對(duì)SNP進(jìn)行基因分型。在這種情況下，應(yīng)該為所述單堿基延伸(SBE)設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增(正向和反向)和延伸(基因分型)的引物。 利用單堿基延伸反應(yīng)對(duì)肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的測(cè)試試劑盒可為利用SNaPshot法對(duì)基因型進(jìn)行分析的測(cè)試試劑盒。對(duì)利用單堿基延伸反應(yīng)來(lái)預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的測(cè)試試劑盒進(jìn)行設(shè)計(jì)，以證實(shí)是否存在如下基因型IGF2基因的-291C/G(rs3213221)[SEQ ID NO. I]中的C等位基因(CC基因型或GC基因型);IGF2基因的-13021C/T(rs3741208)[SEQ ID NO. 2]中的T等位基因(CT基因型或 TT 基因型);IGF2 基因的 6310 (rs2585) [SEQ ID NO. 5]/4702 (rs3802971) [SEQID NO. 6]中的純合GC單倍型；以及 IGF2基因的-11228(rs2239681)[SEQ ID NO. 7]/-13021(rs3741208) [SEQ ID NO. 2]中的 CT 單倍型。本發(fā)明的實(shí)施方式提供了用于對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的測(cè)試試劑盒，所述試劑盒包含如下引物，并利用了單堿基延伸反應(yīng)用于擴(kuò)增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區(qū)的正向引物；用于擴(kuò)增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區(qū)的反向引物；用于對(duì)IGF2基因的-13021 (rs3741208)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物；用于擴(kuò)增IGF2基因的6310 (rs2585)區(qū)的正向引物；用于擴(kuò)增IGF2基因的6310(rs2585)區(qū)的反向引物；用于對(duì)IGF2基因的6310(rs2585)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物；用于擴(kuò)增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區(qū)的正向引物；用于擴(kuò)增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區(qū)的反向引物；用于對(duì)IGF2基因的-11228(rs2239681)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物；用于擴(kuò)增IGF2基因的4702 (rs3802971)區(qū)的正向引物；用于擴(kuò)增IGF2基因的4702 (rs3802971)區(qū)的反向引物；用于對(duì)IGF2基因的4702(rs3802971)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物；用于擴(kuò)增IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區(qū)的正向引物；用于擴(kuò)增IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區(qū)的反向引物；以及用于對(duì)IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物。根據(jù)實(shí)施方式，在用于對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的測(cè)試試劑盒中，用于擴(kuò)增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區(qū)的正向引物可為引物SEQ IDN0. 17 ;用于擴(kuò)增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區(qū)的反向引物可為引物SEQ ID NO. 18 ;用于對(duì)IGF2基因的-13021(rs3741208)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物可為引物SEQ ID NO. 35 ;用于擴(kuò)增IGF2基因的6310(rs2585)區(qū)的正向引物可為引物SEQ ID NO. 20 ;用于擴(kuò)增IGF2基因的6310 (rs2585)區(qū)的反向引物可為引物SEQ ID NO. 21 ;用于對(duì)IGF2基因的6310 (rs2585)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物可為引物SEQ ID NO. 36 ;用于擴(kuò)增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區(qū)的正向引物可為引物SEQ ID NO. 37 ;用于擴(kuò)增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區(qū)的反向引物可為引物SEQ ID NO. 38 ;用于對(duì)IGF2基因的-11228 (rs2239681)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物可為引物SEQ ID NO. 39 ;用于擴(kuò)增IGF2基因的4702 (rs3802971)區(qū)的正向引物可為引物SEQ IDNO. 40 ;用于擴(kuò)增IGF2基因的4702 (rs3802971)區(qū)的反向引物可為引物SEQ ID NO. 41 ;用于對(duì)IGF2基因的4702 (rs3802971)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物可為引物SEQ IDNO. 42;用于擴(kuò)增IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區(qū)的正向引物可為引物SEQ ID NO. 43 ;用于擴(kuò)增IGF2基因的-291C/G(rs3213221)區(qū)的反向引物可為引物SEQ ID NO. 44 ;以及用于對(duì)IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物可為引物SEQ ID NO. 45。另外，本發(fā)明提供了用于對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的方法，所述方法包括從臨床樣本中得到核酸樣品的步驟；以及測(cè)定選自于由下列多核苷酸或者它們的互補(bǔ)核苷酸所組成的組中的至少一種多核苷酸的至少任何一個(gè)多態(tài)性區(qū)的核苷酸序列的步驟IGF2基因的-291C/G (rs3213221)中的C等位基因(CC基因型或GC基因型);IGF2基因的-13021C/T(rs3741208)中的T等位基因(CT基因型或TT基因型);FGF2基因的66378C/T(rsl048201)中的T等位基因(CT基因型或TT基因型);FGF2基因的50012A/G (rs6534367)中的G等位基因(GG基因型或GA基因型)；IGF2基因的6310 (rs2585) /4702 (rs3802971)中的GC單倍型;IGF2 基因的-11228 (rs2239681) /-13021 (rs3741208)中的純合 CC 單倍型；以及IGF2 基因的-11228 (rs2239681) /-13021 (rs3741208)中的 CT 單倍型。 核酸可包括DNA、mRNA、或從mRNA合成的cDNA。測(cè)定多態(tài)性區(qū)的核苷酸序列的步驟可包括如下步驟使核酸樣品與固定有多核苷酸或其互補(bǔ)核苷酸的微陣列雜交的步驟；以及對(duì)由此得到的雜交結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)的步驟。例如，從對(duì)象的組織、體液或者細(xì)胞中分離DNA ;通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增；然后對(duì)SNP進(jìn)行分析。可通過(guò)使用已知的通用方法進(jìn)行SNP分析。例如，可通過(guò)使用實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)或者通過(guò)用雙脫氧法直接測(cè)定核酸的核苷酸序列來(lái)進(jìn)行SNP分析?；蛘撸赏ㄟ^(guò)測(cè)量含SNP區(qū)序列的探針或其互補(bǔ)探針與所述DNA雜交得到的雜交度來(lái)測(cè)定多態(tài)性區(qū)的核苷酸序列，從而進(jìn)行SNP分析；或可通過(guò)使用等位基因特異性探針雜交、等位基因特異性擴(kuò)增、測(cè)序、5’核酸酶消化、分子信標(biāo)檢測(cè)法、寡核苷酸連接檢測(cè)法、大小分析(size analysis)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性等來(lái)進(jìn)行SNP分析。另外，本發(fā)明提供了篩選用于預(yù)防肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的藥物的方法，的藥物的方法，所述方法包括使多肽與候選材料相接觸的步驟，所述多肽由對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行診斷的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的多核苷酸或其互補(bǔ)核苷酸編碼；以及對(duì)所述候選材料是否具有改善或抑制該多肽功能的活性進(jìn)行測(cè)定的步驟。在本發(fā)明的篩選方法中，可通過(guò)使用用于測(cè)定蛋白-蛋白之間的反應(yīng)和蛋白-化合物之間的反應(yīng)是否發(fā)生的通用方法對(duì)多肽與候選材料之間的反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。例如，可以采用測(cè)量蛋白與候選材料反應(yīng)后的活性的方法；酵母雙雜交；結(jié)合至蛋白的噬菌體展示肽克隆的回收；使用天然物質(zhì)、化學(xué)文庫(kù)等的高通量篩選(HTS);藥物命中高通量篩選(drughit HTS);基于細(xì)胞的篩選或使用DNA陣列進(jìn)行篩選的方法等。在本發(fā)明的篩選方法中，所述候選材料可為單獨(dú)的核酸、蛋白質(zhì)、其它提取物、天然物質(zhì)或化合物等，所述候選材料被認(rèn)為具有成為用于肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的診斷試劑的潛力或根據(jù)通用選擇方法被隨機(jī)選擇。實(shí)施例以下，將參考下列實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)的描述。但是，本發(fā)明并不限于下列實(shí)施例。
實(shí)施例ISNP選擇對(duì)包含在血管生成相關(guān)基因(即，VEGF, HIFla, IGF2、FGF2或MTA1) ±2kb中的雙等位SNP進(jìn)行了研究。對(duì)于基因的SNP的位置，參考已知的基因信息(http://www.ncbi.nlm. nih. gov/project/SNP)對(duì)5’ -非翻譯區(qū)、啟動(dòng)子區(qū)、外顯子區(qū)和基因座位區(qū)進(jìn)行選擇。進(jìn)行研究的SNP的ID如下rs699947、rs25648> rs3025000> rs3025010> rs3025035> rs3025040> rsl0434>rs998584、rs45533131/rsl957757、rs2301113、rs2057482/rs2585、rs3802971、rs3213221、rs3741212、rs2239681、rs3741208、rsl004446、rs7924316、rs3842748、rs2070762/rs308395、rs308428、rsll938826、rsl7472986、rs308442、rs308379、rs308381、rs6534367、rsl04820U rs3747676/rs4983413 和 DL1002505。在上述SNP中，選擇單倍型(haplotype)頻率等于或高于5%的SNP,并通過(guò)使·用PHASE軟件ν2· I對(duì)單倍型頻率進(jìn)行分析。此外，通過(guò)使用Haploview program v3. 2(http://www. broad, mit. edu/mpg/haploview/index, php)對(duì)連鎖不平衡進(jìn)行分析。實(shí)施例2SNP基因型分析I. SNP基因型分析通過(guò)使用primer express軟件設(shè)計(jì)出可擴(kuò)增含實(shí)施例I的SNP的區(qū)域的引物組和含SNP區(qū)的TaqMan探針。對(duì)于TaqMan探針,根據(jù)SNP的序列設(shè)計(jì)適用于野生型和突變型等位基因的各探針。通過(guò)在TaqMan探針的一側(cè)加上熒光染料并在另一側(cè)加上能抑制該熒光染料顏色的淬滅劑來(lái)制造探針。在這種情況下，為野生型和突變型等位基因分別加上具有不同顏色的各熒光染料。將在下表I中公開(kāi)的三類引物混合在一起，然后通過(guò)使用經(jīng)混合的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而根據(jù)Taq聚合酶的核酸外切酶活性性質(zhì)區(qū)分出單核苷酸對(duì)的錯(cuò)配。[表 I]
權(quán)利要求
1.一種用于對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，所述SNP包括選自于由下列多核苷酸或者它們的互補(bǔ)核苷酸所組成的組中的至少一種多核苷酸IGF2基因的-291C/G (rs3213221)中的C等位基因(CC基因型或GC基因型);IGF2基因的-13021C/T(rs3741208)中的T等位基因(CT基因型或TT基因型);FGF2基因的66378C/T(rs 1048201)中的T等位基因(CT基因型或TT基因型);FGF2基因的50012A/G (rs6534367)中的G等位基因(GG基因型或GA基因型)；IGF2基因的6310 (rs2585) /4702 (rs3802971)中的GC單倍型;IGF2 基因的-11228 (rs2239681) /-13021 (rs3741208)中的純合 CC 單倍型；以及IGF2 基因的-11228 (rs2239681) /-13021 (rs3741208)中的 CT 單倍型。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中，所述肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)為經(jīng)根治性外科切除術(shù)治療的患者中的肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)。
3.一種用于對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的測(cè)試試劑盒，所述試劑盒利用了單堿基延伸反應(yīng)，并包含以下引物 用于擴(kuò)增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區(qū)的正向引物； 用于擴(kuò)增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區(qū)的反向引物； 用于對(duì)IGF2基因的-13021 (rs3741208)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物； 用于擴(kuò)增IGF2基因的6310 (rs2585)區(qū)的正向引物； 用于擴(kuò)增IGF2基因的6310 (rs2585)區(qū)的反向引物； 用于對(duì)IGF2基因的6310 (rs2585)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物； 用于擴(kuò)增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區(qū)的正向引物； 用于擴(kuò)增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區(qū)的反向引物； 用于對(duì)IGF2基因的-11228 (rs2239681)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物； 用于擴(kuò)增IGF2基因的4702 (rs3802971)區(qū)的正向引物； 用于擴(kuò)增IGF2基因的4702 (rs3802971)區(qū)的反向引物； 用于對(duì)IGF2基因的4702 (rs3802971)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物； 用于擴(kuò)增IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區(qū)的正向引物； 用于擴(kuò)增IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區(qū)的反向引物；以及 用于對(duì)IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的測(cè)試試劑盒，其中， 用于擴(kuò)增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區(qū)的正向引物為引物SEQ ID NO. 17 ； 用于擴(kuò)增IGF2基因的-13021 (rs3741208)區(qū)的反向引物為引物SEQ ID NO. 18 ； 用于對(duì)IGF2基因的-13021(rs3741208)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物為引物SEQ ID NO. 35 ； 用于擴(kuò)增IGF2基因的6310 (rs2585)區(qū)的正向引物為引物SEQ ID NO. 20 ； 用于擴(kuò)增IGF2基因的6310 (rs2585)區(qū)的反向引物為引物SEQ ID NO. 21 ； 用于對(duì)IGF2基因的6310 (rs2585)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物為引物SEQ ID NO. 36 ； 用于擴(kuò)增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區(qū)的正向引物為引物SEQ ID NO. 37 ； 用于擴(kuò)增IGF2基因的-11228 (rs2239681)區(qū)的反向引物為引物SEQ ID NO. 38 ； 用于對(duì)IGF2基因的-11228(rs2239681)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物為引物SEQ ID NO. 39 ； 用于擴(kuò)增IGF2基因的4702 (rs3802971)區(qū)的正向引物為引物SEQ ID NO. 40 ； 用于擴(kuò)增IGF2基因的4702 (rs3802971)區(qū)的反向引物為引物SEQ ID NO. 41 ；用于對(duì)IGF2基因的4702 (rs3802971)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物為引物SEQ ID NO. 42 ； 用于擴(kuò)增IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區(qū)的正向引物為引物SEQ ID NO. 43 ； 用于擴(kuò)增IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區(qū)的反向引物為引物SEQ ID NO. 44 ;和用于對(duì)IGF2基因的-291C/G (rs3213221)區(qū)進(jìn)行基因分型的引物為引物SEQ IDNO. 45。
5.一種用于對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的方法，所述方法包括 從臨床樣本中獲得核酸樣品的步驟；以及 測(cè)定選自于由下列多核苷酸或者它們的互補(bǔ)核苷酸所組成的組中的至少一種多核苷酸的至少任何一個(gè)多態(tài)性區(qū)的核苷酸序列的步驟IGF2基因的-291C/G (rs3213221)中的C等位基因(CC基因型或GC基因型)；IGF2基因的-13021C/T (rs3741208)中的T等位基因(CT基因型或TT基因型)；FGF2基因的66378C/T (rsl048201)中的T等位基因(CT基因型或TT基因型)；FGF2基因的50012A/G (rs6534367)中的G等位基因(GG基因型或GA 基因型)；IGF2 基因的 6310 (rs2585) /4702 (rs3802971)中的 GC 單倍型；IGF2 基因的-11228(rs2239681)/-13021(rs3741208)中的純合 CC 單倍型；以及 IGF2 基因的-11228(rs2239681) /-13021 (rs3741208)中的 CT 單倍型。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的方法，其中，所述測(cè)定多態(tài)性區(qū)的核苷酸序列的步驟包括如下步驟使所述核酸樣品與固定有所述多核苷酸或者它們的互補(bǔ)核苷酸的微陣列進(jìn)行雜交的步驟；以及對(duì)由此得到的雜交結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)的步驟。
7.一種篩選用于預(yù)防肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的藥物的方法，所述方法包括 使多肽與候選材料相接觸的步驟，所述多肽由權(quán)利要求I或2所述的對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的多核苷酸或其互補(bǔ)核苷酸編碼；以及 對(duì)所述候選材料是否具有增強(qiáng)或抑制所述多肽功能的活性進(jìn)行測(cè)定的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行診斷的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中，所述SNP顯示出與肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的顯著相關(guān)性。因此，可將所述SNP用于開(kāi)發(fā)對(duì)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)進(jìn)行診斷的微陣列或診斷試劑盒；以及用于篩選預(yù)防肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的藥物，從而預(yù)防肝細(xì)胞癌的術(shù)后復(fù)發(fā)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102906276SQ201180025453
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月22日
發(fā)明者鄭永化, 維銀實(shí), 李榮柱, 金精我, 李宗殷 申請(qǐng)人:蔚山大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)