專利名稱：N－末端單聚乙二醇化人生長(zhǎng)激素綴合物、用于制備它們的方法及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學(xué)修飾，包括人生長(zhǎng)激素(hGH)及其激動(dòng)劑變體的聚乙二醇化，通過(guò)所述的修飾可以改變hGH的化學(xué)和/或生理學(xué)性質(zhì)。該聚乙二醇化的hGH可能具有增加的血漿存留持續(xù)時(shí)間、降低的清除率、提高的穩(wěn)定性、降低的抗原性、降低的聚乙二醇異質(zhì)性或其組合。本發(fā)明也涉及用于hGH修飾的方法。而且，本發(fā)明涉及包含經(jīng)修飾的hGH的藥物組合物。進(jìn)一步的實(shí)施方案是經(jīng)修飾的hGH用于治療生長(zhǎng)和發(fā)育病癥的用途。
背景技術(shù)：
人生長(zhǎng)激素(hGH)是一種包含一條由兩個(gè)二硫橋交聯(lián)的191個(gè)氨基酸的單鏈的蛋白質(zhì)，并且單體形式具有22kDa的分子量。人GH由垂體腺分泌并且也可通過(guò)重組基因工程產(chǎn)生。hGH將在所有能生長(zhǎng)的身體組織中引起生長(zhǎng)。hGH不僅在人的生長(zhǎng)階段中在促進(jìn)生長(zhǎng)上起著重要的作用并且在維持正常身體組成、合成代謝和脂類代謝中也起重要作用(K.Barneis.和U.Keller，Baillieres Clin.Endocrinlo.Metab.10337(1996))。重組hGH已經(jīng)可商業(yè)獲得許多年。市場(chǎng)上有兩類在治療上有用的重組hGH制劑真正的重組hGH如GenotropinTM或NutropinTM和在N-末端有一額外甲硫氨酸殘基的類似物如SomatonormTM。hGH可用于在患有也稱為生長(zhǎng)激素缺乏癥(GHD)的垂體功能減退性侏儒癥或患有特納氏綜合征的患者中刺激線性生長(zhǎng)，但也提出將其用于其它適應(yīng)癥，包括在小于胎齡(SGA)出生的兒童中長(zhǎng)期治療生長(zhǎng)不足、用于治療患有帕-魏二氏綜合征(PWS)、慢性腎功能不全(CRI)、艾滋消瘦和衰老的患者。成人生長(zhǎng)激素缺陷(aGHD)患者具有多種問(wèn)題，例如身體組成的特征性改變包括脂肪量增加、去脂體重和胞外液下降，以及骨礦物質(zhì)密度的減少、脂質(zhì)代謝異常和心血管機(jī)能障礙。許多這種問(wèn)題可通過(guò)hGH補(bǔ)充療法而得以改善(J.Verhelst J和R.Abs.Drugs.；622399(2002))。生長(zhǎng)激素(GH)的一個(gè)主要生物效應(yīng)是在幼小的哺乳動(dòng)物中促進(jìn)生長(zhǎng)和在年長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物中維持組織。受影響的器官系統(tǒng)包括骨骼、結(jié)締組織、肌肉以及內(nèi)臟如肝、腸和腎。生長(zhǎng)激素通過(guò)與靶標(biāo)細(xì)胞的膜上特異性受體相互作用而發(fā)揮它們的作用。hGH是一個(gè)同源激素家族的成員，所述的該同源激素包括胎盤催乳素、催乳激素以及其它基因和種變體或生長(zhǎng)激素(Nicoll，C.S.等。(1986)EndocrineReviews 7169)。在這些激素中，hGH不同之處在于它表現(xiàn)出廣的種屬特異性并結(jié)合至克隆的軀體原的(Leung，D.W.等，Nature330；537)或催乳激素的受體(Boutin，J.M.等，Cell；5369)。hGH的克隆化基因已經(jīng)在大腸桿菌(Escherichia coli)中以分泌形式表達(dá)(Chang，C.N.等，Gene 55189)，并且已經(jīng)報(bào)道了其DNA和氨基酸序列(Goeddel，等，[1979)Nature 281544；Gray等Gene 39247)。人生長(zhǎng)激素(hGH)參與大量正常的人生長(zhǎng)和發(fā)育調(diào)節(jié)。這種垂體激素顯示出許多生物效應(yīng)，包括線性生長(zhǎng)(體質(zhì)形成)、泌乳、巨噬細(xì)胞的活化、還有胰島素樣和致糖尿病效果(Chawla，R，K.(1983)Ann.Rev.Med.34，519；Edwards，C.K.等，(1988)Science239，769；Thomer，M.O.，等，(1988)J.Clin.Invest.81745)。兒童中的生長(zhǎng)激素缺陷導(dǎo)致侏儒癥，該疾病已經(jīng)成功地通過(guò)外源施用hGH治療了二十多年。在成年人以及兒童中，hGH通過(guò)增加氮蓄積量和刺激骨骼肌生長(zhǎng)并通過(guò)體脂肪的動(dòng)員維持正常身體組成。內(nèi)臟脂肪組織對(duì)hGH特別敏感。除了增強(qiáng)脂解作用，hGH降低攝取甘油三酯轉(zhuǎn)化為體脂肪儲(chǔ)存。IGF-I(胰島素樣生長(zhǎng)激素-I)和IGFBP3(胰島素樣生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白3)的血清濃度通過(guò)hGH增加。人生長(zhǎng)激素(hGH)是由191個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽(分子量為21,500)。二硫鍵連接位于53和165以及位于182和189。Niall，Nature，New Biology，23090(1971)。hGH是有效的合成代謝劑，特別是因?yàn)閷?duì)氮、磷、鉀和鈣的蓄積。用GH治療垂體切除了的大鼠可以恢復(fù)至少部分該大鼠的生長(zhǎng)率。Moore等，Endocrinology1222920-2926(1988)。其中，其在垂體功能減退(GH-缺陷)受試者中的最顯著效果是加速了骨-生長(zhǎng)板-軟骨的線性生長(zhǎng)，導(dǎo)致身高增加。Kaplan，Growth Disorders in Children and Adolescents(Springfield，ILCharles C.Thomas，1964)。hGH在多種動(dòng)物模型中引起多種生理和代謝效應(yīng)，包括線性骨生長(zhǎng)、泌乳、巨噬細(xì)胞的激活、胰島素樣和致糖尿病效果等(R.K.Chawla等，Annu.Rev.Med.34519(1983)；O.G.P.Isaksson等，Annu.Rev.Physiol.47，483(1985)；C.K.Edwards等，Science239，769(1988)；M.O.Thomer和M.L.Vance，J.Clin.Invest.82745(1988)；J.P.Hughes和H.G.Friesen，Ann.Rev.Physiol.47469(1985))。據(jù)報(bào)道，特別是在絕經(jīng)期后的婦女中GH分泌隨年齡下降。Millard等，Neurobiol.Aging，11229-235(1990)；Takahashi等，Neuroendocrinology M，L6-137-142(1987)。也參見(jiàn)Rudman等，J.Clin.Invest.，671361-1369(1981)和Blackman，Endocrinologyand Aging，16981(1987)。而且，有報(bào)道，一些衰老的表現(xiàn)，包括下降的去脂肪體重、脂肪組織塊的擴(kuò)增以及皮膚變薄，可以通過(guò)每周用GH治療三次而得以減少。見(jiàn)例如，Rudman等，N.Eng.J.Med.，3231-6(1990)和一起的Vance博士在相同雜志期(52-54頁(yè))的文章。這些生物效應(yīng)源于hGH和特異性細(xì)胞受體的相互作用。兩種不同的人受體即hGH肝受體(D.W.Leung等，Natuire 330537(1987))和人催乳激素受體(J.M.Boutin等，Mol.Endocrinology.31455(1989))已經(jīng)得以克隆。然而，有可能是其它受體，包括人胎盤催乳激素受體(M.Freemark，M.Comer，G.Komer和S.Handwerger，Endocrinol.1201865(1987))。這些同源受體含有糖基化胞外激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域、單個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域在序列和大小上有相當(dāng)?shù)牟煌?。認(rèn)為一種或多種受體在對(duì)hGH的生理反應(yīng)中起決定性作用。通常據(jù)觀察，施用至身體內(nèi)的生理活性蛋白由于它們?cè)隗w內(nèi)高的清除率，僅可以短時(shí)期顯示它們的藥理學(xué)活性。而且，這些蛋白的相對(duì)疏水性可能限制它們的穩(wěn)定性和/或溶解性。為了降低治療性蛋白的清除率，提高其穩(wěn)定性或消除其抗原性，已經(jīng)提出了一些方法，其中將蛋白用水溶性聚合物進(jìn)行化學(xué)修飾。這種類型的化學(xué)修飾可以有效地阻礙蛋白水解酶與蛋白主鏈本身的物理接觸，因而防止降解。某些水溶性聚合物的化學(xué)連接由于增加了分子的流體力學(xué)體積可以有效地減少腎清除率。另外的優(yōu)勢(shì)包括，在某些情況下，增加治療蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和循環(huán)時(shí)間，增加溶解性和降低免疫原性。聚(烯基氧化物)，特別是聚(乙二醇)(PEG)是已經(jīng)用于制備治療性蛋白質(zhì)產(chǎn)品的這樣一種化學(xué)部分(動(dòng)詞“聚乙二醇化(pegylate)”意思是連接至少一個(gè)PEG分子)。聚(乙二醇)的連接已經(jīng)顯示能防止蛋白質(zhì)水解，Sada，等，J.FermentationBioengineering 71137-139(1991)，并且可提供用于連接某些聚(乙二醇)部分的方法。見(jiàn)1979年12月18日出版的美國(guó)專利No.4,179,337，Davis等，“Non-Immunogenic Polypeptides”；和1977年1月11日出版的美國(guó)專利No.4,002,531，Royer，“ModifyingEnzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby”。對(duì)于綜述，參見(jiàn)Abuchowski等，Enzymes as Drugs(J.S.Holcerberg和J.Roberts編輯，367-383頁(yè)(1981))。也使用其它水溶性聚合物如乙二醇/丙二醇、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(-1，3-二氧雜環(huán)戊烷)、聚(-1，3，6-三噁烷)的共聚物、乙烯/馬來(lái)酸酐共聚物、聚-氨基酸(均聚物或無(wú)規(guī)共聚物)。許多聚乙二醇化的治療性蛋白質(zhì)的實(shí)例已經(jīng)得以描述。ADAGEN，即一種腺苷脫氨酶的聚乙二醇化制劑，已經(jīng)核準(zhǔn)用于治療嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷病。ONCASPAR，即一種聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶，已經(jīng)核準(zhǔn)用于治療過(guò)敏性變態(tài)反應(yīng)患者。聚乙二醇化超氧化物歧化酶已經(jīng)處于用于治療顱腦損傷的臨床試驗(yàn)。聚乙二醇化α-干擾素(U.S.5,738,846、5,382,657)已經(jīng)核準(zhǔn)用于治療肝炎；聚乙二醇化葡糖腦苷脂酶和聚乙二醇化血紅蛋白據(jù)報(bào)道已經(jīng)處于臨床前試驗(yàn)。另外的實(shí)例是聚乙二醇化IL-6，EF 0 442 724，題為″Modified hIL-6″，其公開了加至IL-6上的聚(乙二醇)。已經(jīng)經(jīng)化學(xué)修飾的另一特定治療性蛋白質(zhì)是粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)。G-CSF誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞快速的增殖并釋放至血流中，并因而提供抗感染療效。于1990年12月12日出版的題為“Chemically Modified Granulocyte Colony Stimulating Factor”的歐洲專利出版物EP 0 401 384描述了用于制備聚(乙二醇)連接其上的G-CSF的材料和方法。經(jīng)修飾的G-CSF及其類似物也報(bào)告于發(fā)表于1992年3月4日，題為″Continuous Release PharmaceuticalCompositions Comprising a Polypeptide Covalently Conjugated ToA Water Soluble Polymer″的EP 0 473 268中，所述的專利敘述了多種共價(jià)地連接至水溶性粒子聚合物如聚(乙二醇)上的G-CSF和衍生物的用途。在1989年10月4日發(fā)表的EP 0 335 423中報(bào)道了具有人粒細(xì)胞集落刺激因子活性的經(jīng)修飾的多肽。美國(guó)專利5,824,784提供了用于N-末端修飾蛋白質(zhì)或其類似物的方法以及該方法得到的組合物，包括新的N-末端化學(xué)修飾的G-CSF組合物。美國(guó)專利5,824,778公開了經(jīng)化學(xué)修飾的G-CSF。對(duì)于聚(乙二醇)，許多方法已經(jīng)用于將聚(乙二醇)分子連接至蛋白質(zhì)上。通常，將聚(乙二醇)分子通過(guò)蛋白質(zhì)上的活性基團(tuán)連接至蛋白質(zhì)上。例如在賴氨酸殘基或在N-末端上的那些氨基適宜用于這種連接。例如，Royer(美國(guó)專利號(hào)4,002,531，如上)聲稱將還原性烷基化反應(yīng)用于將聚(乙二醇)連接至酶上。Chamow等，Biocon jugateChem.5133-140(1994)報(bào)道通過(guò)還原性烷基化反應(yīng)用單甲氧基聚(乙二醇)乙醛修飾CD4免疫粘合素。該作者報(bào)道在允許控制聚乙二醇化程度的條件下50％的CD4-Ig得以MePEG修飾。同上，于137頁(yè)。該作者也報(bào)道經(jīng)修飾的CD4-Ig體外結(jié)合能力(結(jié)合至蛋白gp120上)以與同上的聚乙二醇化(MePEGylation)程度相關(guān)的比率而下降。1990年2月27日出版的美國(guó)專利No.4,904,584，Shaw，涉及用于通過(guò)反應(yīng)性氨基連接聚(乙二醇)分子的蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基數(shù)目的修飾。WO 93/00109涉及用于刺激哺乳動(dòng)物或鳥類的GH敏感組織的方法，包括保持連續(xù)的、有效的血漿GH濃度3天或更多天。據(jù)稱一種獲得這種血漿濃度的方法是通過(guò)使用結(jié)合至大分子物質(zhì)如PEG(聚乙二醇)上的GH。據(jù)稱結(jié)合至大分子物質(zhì)上導(dǎo)致半衰期提高。WO 93/00109已經(jīng)報(bào)道了使用mPEG乙醛-5000和mPEG N-羥基琥珀酰亞胺酯(mPEG-NHS-5000)的聚乙二醇化的人生長(zhǎng)激素。使用mPEG-NHS得到多種hGH的聚乙二醇化形式的異質(zhì)性混合物。WO 93/00109也公開了使用mPEG-馬來(lái)酰亞胺來(lái)聚乙二醇化半胱氨酸hGH變體。WO 99/03887公開了聚乙二醇化的半胱氨酸變體人生長(zhǎng)激素。這種稱為BT-005的綴合物據(jù)稱比hGH能更有效地在生長(zhǎng)激素缺陷大鼠中刺激體重增加并具有更長(zhǎng)的半衰期。Clark等(Journal of Biological Chemistry27121969-21977，1996)也報(bào)道了使用羧甲基化PEG的琥珀酰亞胺酯的聚乙二醇化人生長(zhǎng)激素。Clark等描述了增加大小的hGH衍生物，所述衍生物使用選擇性結(jié)合至伯胺的mPEG-NHS-5000。增加水平的PEG修飾降低了對(duì)其受體的親和性并增加基于細(xì)胞測(cè)定法中的EC50達(dá)1500倍。Olson等，Polymer Preprints 38568-569，1997公開了使用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)PEG和琥珀酰亞胺丙酸酯(SPA)PEG來(lái)獲得多種PEG化的hGH。WO 94/20069預(yù)先公開了PEG化的hGH作為用于肺遞送的制劑的部分。US 4,179,337公開了將酶和激素PEG化來(lái)獲得生理活性的非免疫原性、水溶性多肽綴合物的方法。作為進(jìn)行PEG化激素的實(shí)例提及了GH。EP 458064 A2公開了生長(zhǎng)激素中引入的或天然存在的半胱氨酸殘基的PEG化。EP 458064 A2進(jìn)一步提到將兩個(gè)半胱氨酸整合進(jìn)位于野生型牛生長(zhǎng)激素殘基102-112的稱為Ω環(huán)的環(huán)中，更特定地，EP458064 A2公開了將牛生長(zhǎng)激素的102和112號(hào)殘基分別由Ser置換為Cys和將Tyr置換為Cys。WO 95/11987提出將PEG連接至半胱氨酸的硫基上，所述的半胱氨酸存在于母體分子中或通過(guò)定向突變引入。WO 95/11987涉及蛋白酶連接素-1的PEG化，然而也同樣提出了一般hGH和其它蛋白的PEG化。WO 99/03887公開了例如，通過(guò)插入額外的cys 25絲氨酸殘基修飾生長(zhǎng)激素并將PEG連接至引入的殘基上。WO 00/42175涉及產(chǎn)生含有用于PEG連接的游離半胱氨酸殘基的蛋白的方法。WO 00/42175公開了hGH的下列突變型蛋白T3C、S144C和T148C以及其半胱氨酸PEG化。WO 97/11178(還有US 5849535、US 6004931和US 6022711)涉及將GH變體用作hGH的激動(dòng)劑或拮抗劑。WO 97/11178也公開了hGH的PEG化，包括賴氨酸PEG化和賴氨酸的引入或置換(例如K168A和K172R)。WO 9711178也公開了G120K置換。WO 03/044056公開了多種PEG化的hGH，包括分支40K PEG乙醛hGH綴合物。先前PEG化的hGH的報(bào)道需要多個(gè)PEG的連接以獲得大于如描述過(guò)的(Knauf，M.J.等，J.Biol.Chem.26315064-15070，1988)腎過(guò)濾的70K分子量分離點(diǎn)的流體力學(xué)體積，但多個(gè)PEG連接導(dǎo)致不期望的產(chǎn)品異質(zhì)性。目前rhGH的施用是長(zhǎng)周期每日進(jìn)行，并因而較少頻率施用將是非常期望的。具有更長(zhǎng)循環(huán)半衰期的hGH分子將降低所需使用的次數(shù)并潛在地提供更優(yōu)的治療性hGH水平，同時(shí)增強(qiáng)療效。盡管進(jìn)行了許多嘗試去將hGH聚乙二醇化，但仍需要具有合適性質(zhì)的PEG化的hGH分子成為有前途的商品。本發(fā)明提供具有單個(gè)優(yōu)先在hGH的N-末端苯丙氨酸連接的PEG的PEG-hGH綴合物，所述的綴合物具有優(yōu)于其它PEG-hGH綴合物的優(yōu)勢(shì)。在WO 93/00109，Clark等(Journal of Biological Chemistry 27121969-21977，1996，以及Olson等，(Polymer Preprints 38568-569，1997))，已經(jīng)描述了使用mPEG乙醛-5000或mPEG N-羥基琥珀酰亞胺酯(mPEG-NHS-5000)在α-或ε-氨基位點(diǎn)(N-末端和在hGH中的9個(gè)賴氨酸)連接多種低分子量(5kd)PEG。這導(dǎo)致異質(zhì)性群體。舉例說(shuō)明，具有9個(gè)賴氨酸的hGH可能有些分子有10個(gè)PEG連接、有些有9個(gè)連接、有些有8個(gè)連接、有些有7個(gè)連接、有些有6個(gè)連接、有些有5個(gè)連接、有些有4個(gè)連接、有些有3個(gè)連接、有些有2個(gè)連接、有些有1個(gè)連接以及有些沒(méi)有PEG連接。并且，在具有數(shù)個(gè)PEG的分子中，不同分子上，PEG可能不在相同的位置連接。當(dāng)開發(fā)治療性產(chǎn)品時(shí)，這種產(chǎn)生的異質(zhì)性在制造綴合物、純化時(shí)是不利的，并且鑒定困難、成本高以及高度不可重復(fù)性。另一方法(WO 00/42175)采用含有用于PEG連接的游離半胱氨酸殘基的hGH變體。然而，這種方法可以導(dǎo)致具有不正確配對(duì)的二硫鍵的不正確折疊蛋白質(zhì)并導(dǎo)致PEG在一些或全部半胱甘酸上連接的異質(zhì)性PEG化產(chǎn)物。多個(gè)PEG連接至多個(gè)位點(diǎn)可以導(dǎo)致在PEG和不同位點(diǎn)之間具有不太穩(wěn)定的結(jié)合，所述的這種不太穩(wěn)定的結(jié)合可以以不同的速度解離。這使得很難精確預(yù)測(cè)產(chǎn)物的藥物動(dòng)力學(xué)，導(dǎo)致不精確的劑量。異質(zhì)性產(chǎn)品在獲得治療性產(chǎn)品的注冊(cè)審批(regulatoryapproval)中也會(huì)遇到不利的問(wèn)題。因此，期望獲得在單個(gè)位點(diǎn)上連接有單個(gè)PEG的PEG化的hGH分子。本發(fā)明以多種方式解決這種需要。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及經(jīng)化學(xué)修飾的hGH及其激動(dòng)劑變體，所述的hGH及其變體具有至少一種提高的化學(xué)或生理學(xué)性質(zhì)，所述的化學(xué)或性質(zhì)選自但不限于降低的清除率、提高的血漿存留持續(xù)時(shí)間、提高的穩(wěn)定性、提高的溶解性和降低的抗原性。因而，如下面更詳細(xì)描述的，本發(fā)明具有許多方面，所述的多個(gè)方面涉及將多肽包括但不限于hGH及其激動(dòng)劑變體進(jìn)行化學(xué)修飾，也涉及使用聚(乙二醇)丁醛部分的特異性修飾。本發(fā)明也涉及產(chǎn)生經(jīng)化學(xué)修飾的hGH及其激動(dòng)劑變體的方法。特別地，本發(fā)明涉及使用丁醛產(chǎn)生經(jīng)化學(xué)修飾的hGH的方法，所述的方法導(dǎo)致更大的N-末端連接選擇性。本發(fā)明也涉及組合物，所述的組合物包含單獨(dú)的經(jīng)化學(xué)修飾的hGH及其激動(dòng)劑變體或與其它治療劑結(jié)合組合。本發(fā)明也涉及單獨(dú)使用本發(fā)明的經(jīng)化學(xué)修飾的hGH及其激動(dòng)劑變體或與其它治療劑聯(lián)合使用，用于預(yù)防和/或治療其中GH治療是有用的病癥和/或疾病。
附圖的簡(jiǎn)單描述

圖1是hGH與40K分支丁醛hGH或與40K分支乙醛hGH反應(yīng)的胰蛋白酶圖譜分析的HPLC描圖。頂部圖是40K分支丁醛hGH的胰蛋白酶圖譜。中間圖是40K分支乙醛hGH的胰蛋白酶圖譜。底部的圖是未經(jīng)PEG化的hGH的胰蛋白酶圖譜。T1是N-末端胰蛋白酶解片段。圖2顯示人生長(zhǎng)激素的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。圖3顯示了40K分支丁醛hGH在大鼠體重增加測(cè)定中的效力。從Harlan Labs購(gòu)買4-5周大(100-125g)的垂體切除的雌性斯普拉-道來(lái)氏大鼠。當(dāng)大鼠進(jìn)入動(dòng)物裝置時(shí)，將動(dòng)物保持在80的恒定室溫下并每天稱重進(jìn)行4-10天以便估計(jì)基本的生長(zhǎng)率。從0天開始，然后將對(duì)照組中的大鼠(～100g)每天接受皮下注射～0.3mg/kg hGH(實(shí)心圓)或PBS(空心圓)，連續(xù)進(jìn)行11天。40K分支丁醛hGH測(cè)試組(實(shí)心正方形)在第0天和第6天接受1.8mg/kg PHA-794428的單劑量。每組8-10只動(dòng)物。畫出平均生長(zhǎng)+/-SEM。圖4顯示了40K分支丁醛hGH在大鼠中的劑量響應(yīng)的生長(zhǎng)促進(jìn)效果。這種效力研究是以與圖3中描述的相似的方式進(jìn)行，除了施用(僅第0天)多種單劑量40K分支丁醛hGH外，并將研究進(jìn)行6天。對(duì)照組每天一次接受0.3mg/kg hGH(實(shí)心圓)或PBS載體(空心圓)注射，連續(xù)進(jìn)行6天。40K分支丁醛hGH是以1.8mg/kg(實(shí)心正方形)、0.6mg/kg(空心正方形)、0.2mg/kg(實(shí)心三角形)或0.067mg/kg(空心三角形)的劑量施用。每組8只大鼠。圖5顯示了響應(yīng)40K分支丁醛hGH的脛骨生長(zhǎng)。將垂體切除的大鼠如圖3中描述的處理。在第11天處死動(dòng)物，取出左脛骨并用X射線檢測(cè)，并且用測(cè)徑器測(cè)量骨頭長(zhǎng)度。畫出平均長(zhǎng)度+/-SEM。星號(hào)表示與對(duì)照組明顯不同(p＜0.05)。圖6顯示了六天效力研究的血漿IGF-1水平。將動(dòng)物如圖4中描述的處理。在不同時(shí)間取出血液樣品并通過(guò)ELISA測(cè)定血清IGF-1的水平。畫出平均值+/-SEM。
發(fā)明詳述hGH及其激動(dòng)劑變體是重組蛋白家族的成員，所述的hGH及其激動(dòng)劑變體描述于US 4,658,021(甲硫氨?；松L(zhǎng)激素-Met-1-191hGH)和US 5,633,352。它們的重組產(chǎn)生和使用方法詳細(xì)描述于US 4,342,832、4,601,980；US 4,898,830；US 5,424,199和US 5,795,745中。任何純化的和分離的由通過(guò)使用重組基因技術(shù)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞如大腸桿菌和動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的hGH及其激動(dòng)劑變體可以用于本發(fā)明。另外的hGH變體描述于US 6,143,523和1992年6月11日發(fā)表的WO 92/09690中。其中，由轉(zhuǎn)化的大腸桿菌產(chǎn)生的hGH或其激動(dòng)劑變體是特別優(yōu)選的。這種hGH或其激動(dòng)劑變體可以大量的以高純度和同質(zhì)性獲得。例如，上面的hGH或其激動(dòng)劑變體可以根據(jù)US 4,342,832、4,601,980；US 4,898,830；US 5,424,199和US 5,795,745中公開的方法制備。術(shù)語(yǔ)“基本具有以下氨基酸序列”指上面的氨基酸序列可以包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變(缺失、加入、插入或置換)，只要這種改變不會(huì)引起任何不利的與hGH或其激動(dòng)劑變體不相似的功能。更優(yōu)選使用基本具有其中包括至少一個(gè)賴氨酸、天冬膽酸、谷氨酸、未配對(duì)半胱氨酸殘基、游離N-末端α-氨基或游離C-末端羧基的氨基酸序列的hGH或其激動(dòng)劑變體。術(shù)語(yǔ)“hGH多肽或hGH蛋白質(zhì)”當(dāng)在此使用時(shí)，包括特征為在生長(zhǎng)階段促進(jìn)生長(zhǎng)并維持正常身體組成、合成代謝和脂類代謝的所有hGH多肽，優(yōu)選來(lái)自哺乳類的多肽，更優(yōu)選來(lái)自來(lái)自人和鼠類的多肽，以及它們的變體、類似物、直系同源物(ortholog)、同系物和衍生物及其片段。優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)“hGH多肽或蛋白質(zhì)”指SEQ ID NO1的hGH多肽及其表現(xiàn)基本一樣的生物學(xué)活性(在生長(zhǎng)階段促進(jìn)生長(zhǎng)并維持正常身體組成、合成代謝和脂類代謝)的變體、同系物和衍生物。更優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)“hGH多肽或蛋白質(zhì)”指SEQ ID NO 1的多肽。如此處使用的術(shù)語(yǔ)“hGH多肽變體”指來(lái)自相同種但不同于參照hGH多肽的多肽。通常，不同之處是有限的，這樣參照多肽和變體的氨基酸序列整體上是近似的，并在許多區(qū)域是相同的。優(yōu)選地，hGH多肽至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％與參照hGH多肽一致，優(yōu)選SEQ ID NO1的hGH多肽。對(duì)于具有至少例如95％與查詢氨基酸“一致”的氨基酸序列的多肽，其指除了每100個(gè)查詢氨基酸序列的氨基酸目標(biāo)多肽序列可以包含多達(dá)5個(gè)氨基酸改變外，目標(biāo)多肽的氨基酸序列與查詢序列一致。參照序列的這些改變可以在參照氨基酸序列的氨基端或羧基端或那些末端位置之間的任何位置出現(xiàn)，其獨(dú)立地散布于參照序列中的殘基之間或散布于參照序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)的組中。查詢序列可以是參照序列的全部氨基酸序列或是如此處描述確定的任何片段。這種hGH多肽變體可以是天然出現(xiàn)的變體，例如天然出現(xiàn)的等位基因變種，所述的等位基因變種由占據(jù)生物體染色體上給定基因座的多個(gè)備選形式的hGH之一編碼，或由天然出現(xiàn)的源于單個(gè)原始轉(zhuǎn)錄本的剪接變體編碼的同工型。備選地，hGH多肽變體可以是未知會(huì)天然出現(xiàn)的變體和可以用本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)產(chǎn)生的變體。本領(lǐng)域已知可將一個(gè)或多個(gè)氨基酸從生物活性肽或蛋白質(zhì)的N-末端或C-末端刪除而基本不喪失生物學(xué)功能(見(jiàn)例如，Ron等，(1993)，Biol Chem.，268 2984-2988；在這里將其全文引用作為參考)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也將知道可以改變hGH多肽的一些氨基酸序列而對(duì)該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能無(wú)明顯的影響。這種突變體包括缺失、插入、倒位、重復(fù)和置換，所述的突變體是根據(jù)本領(lǐng)域已知的一般規(guī)則而選擇以對(duì)活性具有很小的影響。例如，關(guān)于如何產(chǎn)生表型沉默氨基酸置換的指導(dǎo)由Bowie等，(1990)，Science 2471306-1310提供，將其通過(guò)全文引用作為參考，其中該作者指出有兩種主要的方法用于研究氨基酸序列對(duì)改變的耐受性。第一種方法依賴進(jìn)化過(guò)程，其中突變通過(guò)自然選擇或得以接受或排除。第二種方法使用基因工程在克隆的hGH的特定位點(diǎn)引入氨基酸改變并選擇或篩選以確定保持功能性的序列。這些研究已經(jīng)揭示蛋白質(zhì)出乎意料地對(duì)氨基酸置換耐受。作者進(jìn)一步指出了在蛋白質(zhì)的某些位置哪些氨基酸改變可能是允許的。例如，多數(shù)埋藏的氨基酸殘基需要非極性的側(cè)鏈，而表面?zhèn)孺湹臉O少特征是一般保守的。其它這種表型沉默置換在同上的Bowie等，(1990)中以及其中列出的參考文獻(xiàn)中描述。通常視為保守性置換的是在脂族氨基酸Ala、Val、Leu和Phe之間的相互交換；羥基殘基Ser和Thr的相互交換、酸性殘基Asp和Glu的相互交換、酰胺殘基Asn和Gln之間的置換、堿性殘基Lys和Arg的相互交換以及芳香殘基Phe、Tyr中的交換。而且，下面的氨基酸組一般代表等價(jià)的改變(1)Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr；(2)Cys、Ser、Tyr、Thr；(3)Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；(4)Lys、Arg、His；(5)Phe、Tyr、Trp、His。術(shù)語(yǔ)hGH多肽也包含由hGH類似物、直系同源物和/或種同系物編碼的全部hGH多肽。如此處使用，術(shù)語(yǔ)“hGH類似物”指不同和不相關(guān)生物體的hGH，所述的hGH在每種生物體中行使相同功能但所述hGH不是源于生物體祖先共同具有的祖先結(jié)構(gòu)。相反，類似的hGH獨(dú)立地產(chǎn)生并隨后進(jìn)化為行使相同功能(或相似功能)。換而言之，類似的hGH多肽是具有相當(dāng)不同的氨基酸序列但行使相同生物活性，即在生長(zhǎng)階段促進(jìn)生長(zhǎng)并維持正常的身體成分、合成代謝和脂類代謝的多肽。如此處使用的，術(shù)語(yǔ)“hGH直系同源物”指在兩個(gè)不同種內(nèi)的hGH，所述的hGH的序列通過(guò)祖先種中共同同源的hGH相互關(guān)聯(lián)，但所述的hGH已經(jīng)通過(guò)進(jìn)化而變得相互不同。如此處使用，術(shù)語(yǔ)“hGH同系物”指不同生物體的hGH，所述的hGH在每種生物體中行使相同功能并且所述hGH源于生物體祖先共同具有的祖先結(jié)構(gòu)。換而言之，同系hGH多肽是具有相當(dāng)相似的氨基酸序列行使相同生物活性，即在生長(zhǎng)階段促進(jìn)生長(zhǎng)并維持正常的身體成分、合成代謝和脂類代謝的多肽。優(yōu)選地，hGH多肽同系物可以定義為表現(xiàn)至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％與參照hGH多肽一致的多肽，優(yōu)選SEQ ID NO1的hGH多肽。因而，根據(jù)本發(fā)明的hGH多肽可以是，例如(i)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基受保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)置換并且這種置換的氨基酸殘基可以是或不是由遺傳密碼編碼的hGH多肽；或(ii)其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基包括取代基團(tuán)的hGH多肽；或(iii)其中hGH多肽與另一種化合物如用以增加多肽的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)融合的hGH；或(iv)其中額外的氨基酸融合至上面形式的多肽的hGH多肽，所述的額外的氨基酸為例如IgG Fc融合區(qū)多肽或前導(dǎo)序列或分泌序列或用于上面形式的多肽的純化的序列或前蛋白序列；hGH多肽可以是單體或多體。多體可以是二聚體、三聚體、四聚體或包含至少5個(gè)單體多肽單位的多體。多體也可以是同型二聚體或異質(zhì)二聚體。本發(fā)明的多體可以是疏水、親水、離子和/或共價(jià)結(jié)合的結(jié)果和/或可以通過(guò)例如脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)間接連接。在一個(gè)實(shí)例中，共價(jià)結(jié)合是在包含于含有hGH多肽或其片段的融合蛋白(見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)5,478,925，將其公開內(nèi)容在這里通過(guò)全文引用作為參考)的異源序列之間的。在另外的實(shí)例中，將hGH多肽或其片段通過(guò)肽連接物如在美國(guó)專利No.5,073,627中描述的那些肽連接物(在此通過(guò)引用作為參考)連接至一個(gè)或多個(gè)可以是hGH多肽或異源多肽的多肽上。用于制備多體hGH多肽的另一方法涉及使用融合至亮氨酸拉鏈或異亮氨酸拉鏈多肽序列的hGH多肽，所述的亮氨酸拉鏈或異亮氨酸拉鏈多肽序列已知能促進(jìn)其中含有它們的蛋白的多聚化，其中所述的融合是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，包括WO 94/10308的技術(shù)。在另一實(shí)例中，hGH多肽可以通過(guò)包含于含有Flag多肽序列的融合hGH多肽的Flag多肽序列之間的相互作用連接。hGH多體也可以使用本領(lǐng)域已知的化學(xué)技術(shù)如使用連接分子的交聯(lián)產(chǎn)生，其中所述的連接分子長(zhǎng)度優(yōu)化技術(shù)為本領(lǐng)域已知(見(jiàn)例如US 5,478,925)，或使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來(lái)在期望包含于多體中的多肽序列內(nèi)的半胱氨酸殘基之間形成一個(gè)或多個(gè)分子間交聯(lián)(見(jiàn)例如US 5,478,925)，加入半胱氨酸或生物素至hGH的C-末端或N-末端以及產(chǎn)生含有一個(gè)或多個(gè)這種經(jīng)修飾的多肽的多體的技術(shù)(見(jiàn)，例如US 5,478,925)或用于產(chǎn)生含有hGH多體的脂質(zhì)體的30種技術(shù)(見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)5,478,925)的任意技術(shù)，將其公開內(nèi)容通過(guò)全文引用作為參考。如此處使用的，術(shù)語(yǔ)“hGH多肽片段”指包含hGH多肽，優(yōu)選SEQ ID NO1的多肽的一部分氨基酸序列的連續(xù)一段序列的任何肽或多肽。更特定地，hGH多肽片段包含至少6個(gè)、優(yōu)選至少8-10個(gè)、更優(yōu)選12、15、20、25、30、35、40、50、60、75、100、125、150、175、191個(gè)根據(jù)本發(fā)明的hGH多肽的連續(xù)氨基酸。hGH多肽片段可另外地描述為包含至少6個(gè)氨基酸的hGH多肽的亞類，其中“至少6個(gè)”定義為在6和代表hGH多肽包括SEQ ID NO1的多肽的C-末端氨基酸的整數(shù)之間的任意整數(shù)。進(jìn)一步包括的是進(jìn)一步確定了它們N-末端和C-末端位置的，如上面描述長(zhǎng)為至少6個(gè)氨基酸的hGH多肽片段的類。也包含于術(shù)語(yǔ)“hGH多肽片段”作為單獨(dú)類的是可能由N-末端和C-末端位置特別確定了的如上描述長(zhǎng)約至少6個(gè)氨基酸的全部多肽片段。即，在序列表或本發(fā)明任何給定氨基酸序列上的至少6個(gè)連續(xù)氨基酸殘基長(zhǎng)的片段可以占據(jù)的N-末端和C-末端位置的任意組合包含于本發(fā)明中。明顯，上面的本發(fā)明多肽片段類可以備選地通過(guò)式“a至b”描述；其中“a”等于多核苷酸的N-最末端氨基酸位置而“b”等于多核苷酸的C-最末端氨基酸位置；并且進(jìn)一步來(lái)說(shuō)，其中“a”等于1和hGH多肽序列的氨基酸數(shù)目減去6之間的數(shù)，而其中“b”等于7和hGH多肽序列的氨基酸數(shù)目之間的整數(shù)；并且其中“a”是比“b”至少小6的整數(shù)。使用上面的描述可以立即想象得到上面的hGH多肽片段，并因而為了避免不必要地延長(zhǎng)本說(shuō)明書而不將其單獨(dú)列出。而且，上面的片段不一定需要具有hGH生物活性，盡管具有這種活性的多肽是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，因?yàn)樗鼈兛赡芸捎糜诶缑庖邷y(cè)定法、表位定位、表位附加、用作疫苗以及用作分子量標(biāo)記。上面的片段也可能用于產(chǎn)生針對(duì)多肽特定部分的抗體。也包含于術(shù)語(yǔ)“hGH多肽片段”的是hGH多肽的結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)構(gòu)域最終包括線性的或結(jié)構(gòu)基序和信號(hào)，包括但不限于，亮氨酸拉鏈、螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序、翻譯后修飾位點(diǎn)如糖基化位點(diǎn)、泛素化作用位點(diǎn)、α螺旋和β片層、編碼引導(dǎo)編碼的蛋白質(zhì)分泌的信號(hào)肽的信號(hào)序列、涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的序列如同源框、酸性序列(acidicstretch)、酶活性位點(diǎn)、底物結(jié)合位點(diǎn)和酶切位點(diǎn)。這種結(jié)構(gòu)域可以表現(xiàn)特殊的生物學(xué)活性如DNA或RNA-結(jié)合活性、蛋白質(zhì)分泌、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、酶促活性、底物結(jié)合活性等...。結(jié)構(gòu)域具有一般包含3到191個(gè)之間的氨基酸的大小。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)域包含6到191之間的整數(shù)個(gè)氨基酸。結(jié)構(gòu)域可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法合成，包括在此公開用于制備hGH多肽來(lái)產(chǎn)生抗-hGH抗體的那些方法。用于測(cè)定組成具有特定生物活性的結(jié)構(gòu)域的氨基酸的方法包括誘變研究和確定接受測(cè)試的生物學(xué)活性的測(cè)定法。本發(fā)明內(nèi)容中特別優(yōu)選的片段是保持基本生物活性即在生長(zhǎng)階段促進(jìn)生長(zhǎng)并維持正常的身體組成、合成代謝和脂類代謝的hGH多肽。備選地，本發(fā)明的多肽可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的計(jì)算機(jī)方法在數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索基序、結(jié)構(gòu)域和/或信號(hào)。可搜索的數(shù)據(jù)庫(kù)包括Prosite(Hofmann等，(1999)Nucl.Acids Res.27215-219；Bucher和Bairoch(1994)Proceedings 2nd International Conference onIntelligent Systems for Molecular Biology。Altman等編輯，pp53-61，AAAIPress，Menlo Park)、Pfam(Sonnhammer等，(1997)Proteins 28(3)405-20；Henikoff等，(2000)Nucleic Acids Res.28(1)228-30；Bateman等，(2000)Nucleic Acids Res.28(1)263-6)、Blocks(Henikoff等，(2000)Electrophoresis 21(9)1700-6)、Print(Attwood等，(1996)Nucleic Acids Res.24(1)182-8)、Prodom(Sonnhammer和Kahn(1994)Protein Sci.3(3)482-92；Corpet等，(2000)Nucleic Acids Res.28(1)267-9)、Sbase(Pongor等(1993)Protein Eng.6(4)391-5；Murvai等，(2000)NucleicAcids Res.28(1)260-2)、Smart(Schultz等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 95，5857-5864)、Dali/FSSP(Holm和Sander(1996)Nucleic Acids Res.24(1)206-9；Holm和Sander(1997)NucleicAcids Res.25(1)231-4；Holm和Sander(1999)Nucleic Acids Res.27(1)244-7)、HSSP(Sander和Schneider(1991)Proteins9(1)56-68)、CATH(Orengo等，(1997)Structure 5(8)1093-108；Pearl等，(2000)Biochem.Soc.Trans.28(2)269-75)、SCOP(Murzin等，(1995)J.Mol.Biol.247(4)536-40；Lo Conte等，(2000)Nucleic Acids Res.28(1)257-9)、COG(Tatusov等，(1997)Science278，631637；Tatusov等，(2000)Nucleic Acids Res.28(1)33-6)、特定的家族數(shù)據(jù)庫(kù)及其衍生庫(kù)(Nevill-Manning等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.95,5865-5871；Yona等，(1999)Proteins37(3)360-78；Attwood等，(2000)Nucleic Acids Res.28(1)225-7)，將以上每個(gè)的公開內(nèi)容通過(guò)全文引用作為參考。對(duì)于可利用的數(shù)據(jù)庫(kù)的綜述，參見(jiàn)Nucleic Acid Research(2000)的第28卷第1期，將其公開內(nèi)容在此通過(guò)全文引用作為參考。術(shù)語(yǔ)“hGH多肽片段”也包含帶有表位的片段。這些表位可以是抗原表位或既是抗原表位和免疫原表位。免疫原表位定義為當(dāng)多肽是免疫原時(shí)在體內(nèi)引起抗體反應(yīng)的一部分蛋白質(zhì)。另一方面，抗體結(jié)合至其上的多肽的區(qū)域定義為抗原表位?？乖梢栽诳臻g構(gòu)象中包含最少3個(gè)氨基酸，所述的氨基酸對(duì)該表位是獨(dú)特的。通常表位包括至少6個(gè)這種氨基酸，并更通常包含至少8-10個(gè)這種氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的帶有hGH表位的片段可以是長(zhǎng)度在6個(gè)氨基酸和hGH多肽全長(zhǎng)序列之間的任何片段，優(yōu)選在6-50個(gè)氨基酸的片段。帶有表位的片段可由如上面描述的連續(xù)的氨基酸殘基(作為亞類)的數(shù)目或由特定的N-末端和C-末端位置(作為類)確定。用作表位的片段可以通過(guò)任何常規(guī)的方法產(chǎn)生(見(jiàn)例如，Houghten(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825131-5135和U.S.4,631,21，在此將其公開內(nèi)容通過(guò)全文引用作為參考)。用于確定組成表位的氨基酸的方法包括X-射線晶體衍射、2-維核磁共振和表位定位，例如由Geysen等，(1984)、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.813998-4002；PCT出版物WO 84/03564和WO 84/03506描述的Pepscan方法，在此將其公開內(nèi)容通過(guò)全文引用作為參考。另一實(shí)例是Jameson和Wolf，(1988)，Comp.Appl.Biosci.4181-186的算法(所述的參考通過(guò)將其全文引用作為參考)。Jameson-Wolf抗原分析，例如，可以用計(jì)算機(jī)程序PROTEAN，使用默認(rèn)參數(shù)(Windows 4.0版，DNASTAR公司)進(jìn)行。本發(fā)明也提供了對(duì)如上描述的由N-末端和C-末端位置確定的任何hGH片段類或由氨基酸殘基的大小確定的任何片段亞類的排除。如上描述的由N-末端和C-末端位置或由氨基酸大小確定的任何數(shù)量的片段可能作為單獨(dú)的類而得以排除。本發(fā)明也以相同的方式提供對(duì)任何hGH結(jié)構(gòu)域或帶有表位的片段的排除。本發(fā)明的hGH多肽可以以合適的方式制備。這種hGH多肽及其片段可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)(見(jiàn)例如，“Methods inEnzymology，Academic Press，1993”，參見(jiàn)其中多種用于純化蛋白的方法；Creighton，(1983)ProteinsStructures and MolecularPrinciples，W.H.Freeman & Co.2nd Ed.，T.E.，New York；和Hunkapiller等，(1984)Nature.310(5973)105-11，參見(jiàn)蛋白質(zhì)的化學(xué)合成，以及Davis等，(1986)Basic Methods in MolecularBiology，ed.，Elsevier Press，NY，用于重組技術(shù)，其公開內(nèi)容在此通過(guò)全文引用作為參考)從天然來(lái)源純化、經(jīng)化學(xué)合成、通過(guò)重組技術(shù)包括體外翻譯技術(shù)或在能表達(dá)hGH cDNA的重組細(xì)胞中表達(dá)，或這些方法的組合而產(chǎn)生。本發(fā)明的多肽優(yōu)選以分離的形式提供，并且可以是部分純化或優(yōu)選基本純化的。術(shù)語(yǔ)“具有與參照多核苷酸至少x％一致的多核苷酸”和“具有與參照多肽至少x％一致的多肽”包含其殘基(分別為核苷酸或氨基酸)序列分別較于所述的參照多核苷酸或多肽序列，顯示的一致性百分?jǐn)?shù)，如下定義的，等于或高于x的多核苷酸或多肽。在兩個(gè)多核苷酸或多肽序列在比較窗口上最佳比對(duì)后確定一致性百分?jǐn)?shù)，其中在比較窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可能包含一個(gè)或多個(gè)殘基的添加或缺失以便使序列比對(duì)最優(yōu)。比較窗口包含某一數(shù)目的位置(對(duì)應(yīng)于殘基插入/缺失的殘基或缺口)，該位置數(shù)目對(duì)應(yīng)于窗口大小。每個(gè)窗口位置可以表示一種下列情況1°/有一個(gè)殘基(核苷酸或氨基酸)在第一個(gè)比對(duì)序列的該位置上并且一不同的殘基在第二個(gè)比對(duì)序列的相同位置上，換而言之，第二個(gè)序列較于第一個(gè)序列在該位置上具有一置換的殘基。
2°/有一個(gè)殘基(核苷酸或氨基酸)在第一個(gè)比對(duì)序列的該位置上并且相同的殘基在第二個(gè)比對(duì)序列的相同位置上。
3°/有一個(gè)殘基(核苷酸或氨基酸)在第一個(gè)比對(duì)序列的該位置上并且沒(méi)有氨基酸在第二個(gè)比對(duì)序列的相同位置上，換而言之，第二個(gè)序列較于第一個(gè)序列在該位置上顯示缺失。
在屬于第一個(gè)上面定義的類的比較窗口內(nèi)的位置的數(shù)目稱為R1。
在屬于第二個(gè)上面定義的類的比較窗口內(nèi)的位置的數(shù)目稱為R2。
在屬于第三個(gè)上面定義的類的比較窗口內(nèi)的位置的數(shù)目稱為R3。一致性百分?jǐn)?shù)(％id)可以通過(guò)任何以下的式子計(jì)算
％id＝R2/(R1+R2+R3)×100，或％id＝(R2+R3)/(R1+R2+R3)×100用于比較的序列的比對(duì)可以用本領(lǐng)域已知的多種序列比較算法和程序的任意一種進(jìn)行。這種算法和程序包括，但不限于，TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA、FASTDB、WU-BLAST、Gapped-BLAST、PSI-BLAST(Pearson和Lipman，(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444-2448；Altschul等，(1990)，J.Mol.Biol.215403-410；Altschul等，(1993)，Nature hGHtics 3266-272；Altschul等(1997)，Nuc.Acids Res.253389-3402；Thompson等，(1994)，Nuc.Acids Res..224673-4680；Higgins等，(1996)，Meth.Enzymol.266383-402；Brutlag等，(1990)Comp.App.Biosci.6237-245；Jones和Swindells，(2002)Trends Biochem Sci27161-4；Olsen等，(1999)Pac Symp Biocomput；302-13)，將其公開內(nèi)容通過(guò)全文引用作為參考。在一特別的實(shí)施方案中，將Smith-Waterman方法與打分矩陣如PAM、PAM 250，優(yōu)選與BLOSUM矩陣如BLOSUM60或BLOSUM62并用默認(rèn)參數(shù)(空位開放罰分＝10和空位拓展罰分＝1)或優(yōu)選用優(yōu)于默認(rèn)參數(shù)的用戶確定的參數(shù)使用。在另一特別的實(shí)施方案中，將蛋白質(zhì)和核酸序列用BasicLocal Alignment Search Tool(“BLAST”)程序采用默認(rèn)參數(shù)或采用用戶提供的修改的參數(shù)進(jìn)行比對(duì)。優(yōu)選地，使用的打分矩陣是BLOSUM62矩陣(Gonnet等，(1992)，Science 2561443-1445；Henikoff和Henikoff，(1993)，Proteins 1749-61，將其公開內(nèi)容在此通過(guò)全文引用作為參考)。較少優(yōu)選地，也可使用PAM或PAM250矩陣(見(jiàn)，例如，Schwartz和Dayhoff，(1978)，編輯，Matrices for DetectingDistance RelationshipsAtlas of Protein Sequence andStructure，WashingtonNational Biomedical ResearchFoundation，將其公開內(nèi)容在此通過(guò)全文引用作為參考)。在另一特別的實(shí)施方案中，多核苷酸或多肽序列用基于Brutlag等，(1990)，同上，的FASTDB計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行比對(duì)。用于DNA序列的FASTDB比對(duì)的優(yōu)選參數(shù)是Matrix＝Unitary，k-tuple＝4，Mismatch Penalty＝1，Joining Penalty＝30，Randomization GroupLength＝0，Cutoff Score＝1，Gap Penalty＝5，Gap Size Penalty＝0.05，Window Size＝500或目標(biāo)核苷酸序列的長(zhǎng)度，選較短的。用于FASTDB氨基酸序列比對(duì)的優(yōu)選參數(shù)是Matrix＝PAM 0，k-tuple＝2，MismatchPenalty＝1，Joining Penalty＝20，Randomization Group25Length＝0，Cutoff Score＝1，Window Size＝序列長(zhǎng)度，Gap Penalty＝5，Gap SizePenalty＝0.05，Window Size＝500或目標(biāo)氨基酸序列的長(zhǎng)度，選較短的。根據(jù)本發(fā)明，聚(乙二醇)通過(guò)hGH或其激動(dòng)劑變體的氨基酸殘基共價(jià)地結(jié)合。多種具有許多不同官能團(tuán)、連接物、構(gòu)型和分子量的活化的聚(乙二醇)為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，所述的活化聚(乙二醇)可以用于產(chǎn)生PEG-hGH綴合物或PEG-hGH激動(dòng)劑變體綴合物(有關(guān)綜述參見(jiàn)，Roberts M.J.等，Adv.Drug Del.Rev.54459-476，2002；Harris J.M.等，Drug Delivery Sytems 40538-551，2001)。本發(fā)明涉及使用丁醛連接部分用醛化學(xué)來(lái)引導(dǎo)PEG部分選擇性結(jié)合至N-末端的方法。丁醛連接物較于乙醛連接物導(dǎo)致增加的N-末端特異性(表1和圖1)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是具有式I或式II的結(jié)構(gòu)的人生長(zhǎng)激素-PEG綴合物
或mPEG-O(CH2CH2O)n(CH2)mCH2-NH-R式II其中n是在1和10之間的整數(shù)；m是在1和10之間的整數(shù)；R是人生長(zhǎng)激素，甲硫氨酰生長(zhǎng)激素或人生長(zhǎng)激素變體。在一特別的實(shí)施方案中，n是在1和5之間以及m是在1和5之間。在一特別的式I的實(shí)施方案中n是1以及m是1；n是1以及m是2；n是1以及m是3；n是1以及m是4；n是1以及m是5；n是1以及m是6；n是1以及m是7；n是1以及m是8；n是1以及m是9；n是1以及m是10；n是2以及m是1；n是2以及m是2；n是2以及m是3；n是2以及m是4；n是2以及m是5；n是2以及m是6；n是2以及m是7；n是2以及m是8；n是2以及m是9；n是2以及m是10；n是3以及m是1；n是3以及m是2；n是3以及m是3；n是3以及m是4；n是3以及m是5；n是3以及m是6；n是3以及m是7；n是3以及m是8；n是3以及m是9；n是3以及m是10；n是4以及m是1；n是4以及m是2；n是4以及m是3；n是4以及m是4；n是4以及m是5；n是4以及m是6；n是4以及m是7；n是4以及m是8；n是4以及m是9；n是4以及m是10；n是5以及m是1；n是5以及m是2；n是5以及m是3；n是5以及m是4；n是5以及m是5；n是5以及m是6；n是5以及m是7；n是5以及m是8；n是5以及m是9；n是5以及m是10；n是6以及m是1；n是6以及m是2；n是6以及m是3；n是6以及m是4；n是6以及m是5；n是6以及m是6；n是6以及m是7；n是6以及m是8；n是6以及m是9；n是7以及m是10；n是7以及m是1；n是7以及m是2；n是7以及m是3；n是7以及m是4；n是7以及m是5；n是7以及m是6；n是7以及m是7；n是7以及m是8；n是7以及m是9；n是7以及m是10；n是8以及m是1；n是8以及m是2；n是8以及m是3；n是8以及m是4；n是8以及m是5；n是8以及m是6；n是8以及m是7；n是8以及m是8；n是8以及m是9；n是8以及m是10；n是9以及m是1；n是9以及m是2；n是9以及m是3；n是9以及m是4；n是9以及m是5；n是9以及m是6；n是9以及m是7；n是9以及m是8；n是9以及m是9；n是9以及m是10；n是10以及m是1；n是10以及m是2；n是10以及m是3；n是10以及m是4；n是10以及m是5；n是10以及m是6；n是10以及m是7；n是10以及m是8；n是10以及m是9；n是10以及m是10。一特定的實(shí)施方案是具有以下結(jié)構(gòu)的人生長(zhǎng)激素-PEG綴合物 或mPEG-O(CH2CH2O)4CH2CH2CH2CH2-NH-R其中，R是人生長(zhǎng)激素、甲硫氨酰基人生長(zhǎng)激素或人生長(zhǎng)激素變體。本發(fā)明本發(fā)明另一特定的實(shí)施方案是人生長(zhǎng)激素-PEG綴合物，其中人生長(zhǎng)激素包含或由SEQ ID NO1的氨基酸序列組成。本發(fā)明的一特定實(shí)施方案是人生長(zhǎng)激素-PEG綴合物，其中大于80％、更優(yōu)選81％、更優(yōu)選82％、更優(yōu)選83％、更優(yōu)選84％、更優(yōu)選85％、更優(yōu)選86％、更優(yōu)選87％、更優(yōu)選88％、更優(yōu)選89％、更優(yōu)選90％、更優(yōu)選91％、更優(yōu)選92％、更優(yōu)選93％、更優(yōu)選94％、更優(yōu)選95％、更優(yōu)選96％、更優(yōu)選97％、更優(yōu)選98％的聚乙二醇結(jié)合至SEQ ID NO1的氨基酸序列的氨基-末端的苯丙氨酸上。本發(fā)明的另一特定實(shí)施方案是其中大于90％的聚乙二醇結(jié)合至SEQ ID NO1的氨基酸序列氨基-末端的苯丙氨酸上的人生長(zhǎng)激素-PEG綴合物上。本發(fā)明的另一特定實(shí)施方案是其中大于95％的聚乙二醇結(jié)合至SEQ ID NO1的氨基酸序列氨基-末端的苯丙氨酸上的人生長(zhǎng)激素-PEG綴合物上。本發(fā)明的另一特定實(shí)施方案是其中大于98％的聚乙二醇結(jié)合至SEQ ID NO1的氨基酸序列氨基-末端的苯丙氨酸上的人生長(zhǎng)激素-PEG綴合物上。用于本發(fā)明的聚(乙二醇)不限于任何特殊形式或分子量范圍。聚(乙二醇)分子量可以在約500和約100,000道爾頓之間。術(shù)語(yǔ)“大約”表示在聚乙二醇制備中，一些分子將比規(guī)定的分子量重一點(diǎn)，一些輕一點(diǎn)，所述的規(guī)定的分子量指平均分子量?？梢岳斫?，有一些程度的與聚合物如聚(乙二醇)相關(guān)的多分散性。優(yōu)選使用具有低分散性的PEG。通常，使用具有約500-約60,000的分子量的PEG。本發(fā)明的特定PEG分子量范圍是約1,000-約40,000。在另一特定實(shí)施方案中，PEG分子量大于約5,000-約40,000。在另一特定實(shí)施方案中，PEG分子量約20,000-約40,000。取決于期望的治療性質(zhì)(例如，期望的持續(xù)釋放的持續(xù)時(shí)間，如果有的話，對(duì)生物活性的影響，抗原性的程度或抗原性的缺少以及其它已知的聚乙烯對(duì)治療蛋白的影響)，可以使用其它大小的PEG。例如，聚乙二醇可以具有的平均分子量為約200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000或100,000道爾頓。在另一實(shí)施方案中，聚(乙二醇)是具有多于一個(gè)PEG部分連接的分支PEG(U.S.5,932,462；U.S.5,342,940；U.S.5,643,575；U.S.5,919,455；U.S.6,113,906；U.S.5,183,660；Kodera Y.，Bioconjugate Chemistry 5283-288(1994)；和WO 02/09766)。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，分支PEG的每個(gè)聚(乙二醇)的分子量約為5,000-20,000。在一特定的實(shí)施方案中，分支PEG的每個(gè)聚(乙二醇)的分子量約為20,000。聚(烯基氧化物)，特別是聚(乙二醇)通過(guò)末端活性基團(tuán)結(jié)合至hGH或其激動(dòng)劑變體上，所述的結(jié)合在PEG和蛋白質(zhì)之間可能留下或不留下連接部分(間隔臂)。為了形成本發(fā)明的hGH綴合物或其激動(dòng)劑變體，將聚合物如聚(乙二醇)轉(zhuǎn)化為活化形式，這方面是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。反應(yīng)性基團(tuán)例如是末端反應(yīng)性基團(tuán)，所述的該基團(tuán)介導(dǎo)蛋白質(zhì)上的化學(xué)部分和聚(乙二醇)之間的鍵。通常，將一個(gè)或兩個(gè)末端的聚合物羥基末端基團(tuán)(即α和ω末端羥基基團(tuán))轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性官能團(tuán)，所述的官能團(tuán)使得能共價(jià)結(jié)合。該過(guò)程常常稱為“活化”并且具有反應(yīng)性基團(tuán)的聚(乙二醇)產(chǎn)物此后稱為“活化的聚(乙二醇)”。在一特定的實(shí)施方案中，將一個(gè)末端的聚合物羥基末端基團(tuán)轉(zhuǎn)化為或用非反應(yīng)性基團(tuán)保護(hù)。在一特定的實(shí)施方案中，將一個(gè)末端的聚合物羥基末端基團(tuán)轉(zhuǎn)化為或用甲基保護(hù)。如此處使用的，術(shù)語(yǔ)“mPEG”指一端用甲基保護(hù)的PEG。mPEG在結(jié)構(gòu)上可以表示為CH3O-(CH2CH2O)n-H含有α和ε連接基團(tuán)的聚合物稱為“雙活化聚(乙烯基氧化物)”并稱為“雙官能團(tuán)的”。在α和ε末端羥基含有相同反應(yīng)性基團(tuán)的聚合物有時(shí)稱為“同雙官能”或“同雙-活化”。在α和ε末端羥基上含有不同反應(yīng)性基團(tuán)的聚合物有時(shí)稱為“異雙官能”(見(jiàn)例如WO01/26692)或“異雙-活化”。含有單個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)的聚合物稱為“單活化”聚烯基氧化物或“單-官能”。其它基本非抗原聚合物也類似地經(jīng)“活化”或“官能化”。活化的聚合物因而適于介導(dǎo)蛋白質(zhì)上的化學(xué)部分如α-或ε-氨基、羧基或巰基與聚(乙二醇)之間的鍵。雙活化的聚合物可以以這種方式與兩個(gè)蛋白質(zhì)分子或在另一實(shí)施方案中與一個(gè)蛋白質(zhì)分子和一個(gè)反應(yīng)性小分子反應(yīng)以通過(guò)交聯(lián)有效地形成蛋白聚合物或蛋白-小分子綴合物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用hGH或其激動(dòng)劑變體的N-末端賴氨酸的α-氨基或ε-氨基與活化的PEG形成仲胺或酰胺鍵。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面，如Chamow等，Bioconjugate Chem.5133-140(1994)，美國(guó)專利號(hào)4,002,531，WO 90/05534以及美國(guó)專利號(hào)5,824,784中描述的，通過(guò)使用合適的還原劑如NaCNBH3、NaBH3、吡啶甲硼烷等的還原性烷基化，在hGH或其激動(dòng)劑變體的N-末端賴氨酸的α-氨基或ε-氨基與單鏈或支鏈PEG乙醛之間形成仲胺鍵。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少70％、優(yōu)選至少80％、優(yōu)選至少81％、優(yōu)選至少82％、優(yōu)選至少83％、優(yōu)選至少84％、優(yōu)選至少85％、優(yōu)選至少86％、優(yōu)選至少87％、優(yōu)選至少88％、優(yōu)選至少89％、優(yōu)選至少90％、優(yōu)選至少91％、優(yōu)選至少92％、優(yōu)選至少93％、優(yōu)選至少94％、優(yōu)選至少95％、優(yōu)選至少96％、優(yōu)選至少97％，以及最優(yōu)選至少98％的聚(乙二醇)是在氨基末端的α-氨基上。稱為聚乙二醇化反應(yīng)的結(jié)合反應(yīng)過(guò)去在具有摩爾過(guò)量的聚合物的溶液中進(jìn)行并不考慮聚合物將結(jié)合至蛋白質(zhì)的何處。然而，這種普通的技術(shù)通常已經(jīng)證明結(jié)合生物活性蛋白質(zhì)至非抗原聚合物同時(shí)保持足夠生物活性是不充分的。一種保持hGH或其激動(dòng)劑變體生物活性的方法是在聚合物結(jié)合過(guò)程中基本避免那些hGH或其激動(dòng)劑變體的與受體結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的反應(yīng)性基團(tuán)的結(jié)合。本發(fā)明的另一方面是提供將聚(乙二醇)結(jié)合至hGH或其激動(dòng)劑變體上而保持高水平的存留活性的方法。通過(guò)共價(jià)鍵的化學(xué)修飾可以在通常在生物活性物質(zhì)與活化的聚(乙二醇)的反應(yīng)中采用的任何合適的條件下進(jìn)行。結(jié)合反應(yīng)在相對(duì)溫和的條件下進(jìn)行以避免失活hGH或其激動(dòng)劑變體。溫和的條件包括保持反應(yīng)溶液的pH為3-10并且反應(yīng)溫度約在0℃-37℃內(nèi)。在hGH或其激動(dòng)劑變體的活性氨基酸殘基具有游離的氨基的情況下，上述修飾優(yōu)選地在一系列合適的緩沖液(pH 3-10)中在4℃-37℃下進(jìn)行1-48小時(shí)，所述的緩沖液包括磷酸鹽緩沖液、MES、檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液、琥珀酸緩沖液或HEPES，但不限于此。在用試劑如PEG乙醛攻擊N-末端氨基時(shí)，優(yōu)選保持pH 4-7?；罨木?乙二醇)可以以約0.01-100倍，優(yōu)選約0.01-2.5倍于hGH或其變體游離氨基數(shù)目的摩爾量使用。在另一方面，如果hGH或其激動(dòng)劑變體的反應(yīng)性氨基酸殘基具有游離羧基，上述修飾優(yōu)選在4℃-37℃下約3.5-約5.5的pH中進(jìn)行1-24小時(shí)，例如，用聚(氧乙基二胺)修飾是在存在碳二亞胺(pH 4-5)時(shí)進(jìn)行?；罨木?乙二醇)可以以0.01-300倍于hGH或其激動(dòng)劑變體游離羧基數(shù)目的摩爾量使用。在單獨(dú)的實(shí)施方案中，結(jié)合反應(yīng)中包括的聚合物的量的上限超過(guò)約1∶1的量，所述量為有可能使活化的聚合物和hGH或其激動(dòng)劑變體反應(yīng)而不形成相當(dāng)量的高分子量種類的量，所述的相當(dāng)量的高分子種類即為多于約20％的綴合物每分子hGH或其激動(dòng)劑變體含有多于約-條鏈的聚合物。例如，在本發(fā)明的這方面，考慮可將多達(dá)約6∶1的比率用于形成顯著量的期望綴合物，所述期望的綴合物隨后可以從任何高分子量種類分離。在本發(fā)明的另一方面，雙官能活化的PEG衍生物可以用于產(chǎn)生聚合的hGH或其激動(dòng)劑變體-PEG分子，其中多個(gè)hGH或其激動(dòng)劑變體分子通過(guò)PEG交聯(lián)。雖然這里描述的反應(yīng)條件可以得到顯著量的未經(jīng)修飾的hGH或其激動(dòng)劑變體，但這些未經(jīng)修飾的hGH或其激動(dòng)劑變體可以方便地再循環(huán)進(jìn)將來(lái)的反應(yīng)中進(jìn)行另外的結(jié)合反應(yīng)。本發(fā)明的方法令人驚奇地產(chǎn)生十分少的，即少于約30％并更優(yōu)選地，少于約10％的高分子量種類和每個(gè)hGH或其激動(dòng)劑變體含有多于一個(gè)聚合物鏈的種類。這些反應(yīng)條件將與通常用于其中的活化聚合物對(duì)靶標(biāo)數(shù)倍摩爾過(guò)量的聚合物結(jié)合反應(yīng)的那些反應(yīng)條件相比較。在本發(fā)明的另外方面，聚合物以每當(dāng)量hGH或其激動(dòng)劑變體約0.1-50當(dāng)量的量存在。在本發(fā)明的另外方面，聚合物以每當(dāng)量hGH或其激動(dòng)劑變體約1-10當(dāng)量的量存在。本發(fā)明的結(jié)合反應(yīng)最初提供含有單-和二-PEG-hGH綴合物、未反應(yīng)的hGH、未反應(yīng)的聚合物以及通常少于約20％高分子量種類的反應(yīng)混合物或合并的庫(kù)。高分子量種類包括含有多于一條聚合物鏈和/或聚合化的PEG-hGH或其激動(dòng)劑變體種類的綴合物。在已經(jīng)移除未反應(yīng)的種類和高分子量種類后，回收主要含有單-和二-聚合物-hGH或其激動(dòng)劑變體綴合物的組合物。假定綴合物大部分包括單條聚合物鏈，則該綴合物基本是均質(zhì)的。當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)的FDC-P1細(xì)胞增殖測(cè)定法(Clark等，Journal of Biological Chemistry 27121969-21977，1996)、受體結(jié)合測(cè)定法(US 5,057,417)或垂體切除的大鼠的生長(zhǎng)(Clark等，Journal of Biological Chemistry 27121969-21977，1996)測(cè)量時(shí)，這些經(jīng)修飾的hGH或其激動(dòng)劑變體具有至少約0.1％的與天然或未經(jīng)修飾的hGH或其激動(dòng)劑變體相關(guān)的體外生物活性。然而在本發(fā)明優(yōu)選的方面，經(jīng)修飾的hGH或其激動(dòng)劑變體具有約25％的體外生物活性，更優(yōu)選地，經(jīng)修飾的hGH或其激動(dòng)劑變體具有約50％的體外生物活性，更優(yōu)選地，經(jīng)修飾的hGH或其激動(dòng)劑變體具有約75％的體外生物活性，并且最優(yōu)選地經(jīng)修飾的hGH或其激動(dòng)劑變體具有相等的活提高的體外生物活性。本發(fā)明的方法優(yōu)選包括相當(dāng)有限的聚合物與hGH或其激動(dòng)劑變體的比率。因而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)hGH或其激動(dòng)劑變體綴合物主要限于含有僅一條聚合物鏈的種類。而且，聚合物與hGH或其激動(dòng)劑變體活性基團(tuán)的連接比使用更高摩爾過(guò)量的聚合物連接物時(shí)具有相當(dāng)少的隨機(jī)性。在已經(jīng)將結(jié)合反應(yīng)淬滅后，使用離子交換或分子排阻色譜或類似分離技術(shù)可將存在于反應(yīng)混合物中的未經(jīng)修飾的hGH或其激動(dòng)劑變體再循環(huán)進(jìn)將來(lái)的反應(yīng)中。聚(乙二醇)-修飾的hGH或其激動(dòng)劑變體，即根據(jù)本發(fā)明的化學(xué)修飾蛋白可以通過(guò)用于純化蛋白的常規(guī)方法如透析、鹽析、超濾、離子交換色譜、疏水作用色譜(HIC)、凝膠色譜和電泳從反應(yīng)混合物中分離。離子交換色譜在除去未反應(yīng)的聚(乙二醇)和hGH或其激動(dòng)劑變體中是特別有效的。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，將單-和二-聚合物-hGH或其激動(dòng)劑變體種類從反應(yīng)混合物中分離以除去高分子量種類和未修飾的hGH或其激動(dòng)劑變體。通過(guò)將混合的種類置于含有約0.5-10mg/mL hGH或其激動(dòng)劑變體-聚合物綴合物的緩沖溶液中分離是有效的。合適的溶液具有約4-約10的pH。溶液優(yōu)選含有一種或多種選自KCl、NaCl、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、NaHCO3、NaBO4、CH3CO2H和NaOH的緩沖鹽。取決于反應(yīng)緩沖液，hGH或其激動(dòng)劑變體聚合物綴合物溶液可能首先必須進(jìn)行緩沖液交換/超濾以除去任何未反應(yīng)的聚合物。例如PEG-hGH或其激動(dòng)劑變體綴合物溶液可以穿過(guò)低分子量篩截(10,000-30,000道爾頓)膜進(jìn)行超濾以除去大部分不需要的物質(zhì)例如未反應(yīng)的聚合物，如果有表面活性劑，除去表面活性劑等。優(yōu)選用離子交換色譜介質(zhì)將綴合物分級(jí)分離進(jìn)含有期望的種類的庫(kù)中。這種介質(zhì)能通過(guò)以某種程度上可預(yù)測(cè)的方式變化的電荷的差異選擇性結(jié)合PEG-hHG或其激動(dòng)劑變體綴合物。例如，hGH或其激動(dòng)劑變體的表面電荷通過(guò)蛋白表面上的可提供的帶電基團(tuán)的數(shù)目而測(cè)定。這些帶電基團(tuán)通常作為聚(烯基氧化物)聚合物潛在的連接點(diǎn)。因此，hGH或其激動(dòng)劑變體綴合物將具有與其它種類不同的電荷而使得能選擇性分離。將強(qiáng)極性陰離子或陽(yáng)離子交換樹脂如分別是季銨或磺丙基樹脂用于本發(fā)明方法。特別優(yōu)選離子交換樹脂。一系列包括的適用于本發(fā)明的商業(yè)化陽(yáng)離子交換樹脂是SP-hitrap、SP Sepharose HP和SP Sepharosefast flow，但不限于此。也可以使用其它合適的陽(yáng)離子交換樹脂例如S和CM樹脂。一系列適用于本發(fā)明的陰離子交換樹脂，包括可商業(yè)提供的陰離子交換樹脂，是Q-hitrap、Q Sepharose HP和Q sepharosefast flow，但不限于此。也可以使用其它合適的陽(yáng)離子交換樹脂例如DEAE樹脂。例如，通過(guò)常規(guī)方法優(yōu)選地將陰離子或陽(yáng)離子交換樹脂填充至柱中并平衡。使用具有與綴合聚合物的hGH或其激動(dòng)劑變體溶液相同pH和重量摩爾滲透壓濃度的緩沖液。洗脫緩沖液優(yōu)選含有一種或多種選自KCl、NaCl、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、NaHCO3、NaBO4和(NH4)2CO3的鹽的緩沖液。然后將含有綴合物的溶液吸附于柱上而其中沒(méi)有保留未反應(yīng)的聚合物和一些高分子種類。上樣完成后，將具有漸增鹽濃度的梯度洗脫緩沖液施加至柱上以洗脫期望的聚烯基氧化物-綴合的hGH或其激動(dòng)劑變體級(jí)分。在陽(yáng)離子或陰離子交換分離步驟后，洗脫的合并的級(jí)分優(yōu)選限于相同的聚合物綴合物。然后通過(guò)常規(guī)技術(shù)從柱上洗脫，可將任何未綴合的hGH或其激動(dòng)劑變體種類回收。如果需要，可進(jìn)一步通過(guò)另外的離子交換色譜或分子排阻色譜將單和多聚乙二醇化hGH或其激動(dòng)劑變體種類相互分離。也可以使用利用多個(gè)漸增濃度的鹽或pH的恒溶劑洗脫步驟的技術(shù)。多個(gè)漸增濃度的恒溶劑洗脫步驟將導(dǎo)致相繼洗脫二-和單-聚合物綴合物-hGH或其激動(dòng)劑變體。洗脫的溫度范圍是約4℃和約25℃之間。優(yōu)選地，洗脫在約4℃至約22℃下進(jìn)行。例如，PEG-hGH或其激動(dòng)劑變體級(jí)分的洗脫通過(guò)在280nm下的UV吸收度檢測(cè)。通過(guò)簡(jiǎn)單的時(shí)間洗脫曲線完成級(jí)分收集。表面活性劑可用于聚(乙二醇)聚合物與hGH或其激動(dòng)劑變體部分綴合的過(guò)程中。合適的表面活性劑包括離子型劑如十二烷基磺酸鈉(SDS)。也可使用其它離子型表面活性劑如十二烷基磺酸鋰、季銨化合物、牛磺膽酸、辛酸、癸烷磺酸等。也可以使用非離子表面活性劑。例如，可以使用材料如聚(氧乙烯)山梨聚糖類(吐溫類)、聚(氧乙烯)酯類(Triton類)。也見(jiàn)Neugebauer，A Guide to theProperties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry(1992)Calbiochem公司。用于本發(fā)明方法中的表面活性劑的唯一限制是它們?cè)诓粫?huì)引起hGH或其激動(dòng)劑變體基本不可逆地變性和不會(huì)完全抑制聚合物綴合的條件和濃度下使用。表面活性劑以約0.01-0.5％，優(yōu)選以約0.05-0.5％，最優(yōu)選以約0.075-0.25％的量存在于反應(yīng)混合物中。也考慮表面活性劑的混合物。據(jù)認(rèn)為，表面活性劑在聚合物綴合過(guò)程中提供暫時(shí)的、可逆保護(hù)體系。表面活性劑已經(jīng)顯示能有效地選擇性阻礙聚合物綴合而允許基于賴氨酸的或基于氨基末端的綴合進(jìn)行。本發(fā)明的聚(乙二醇)修飾的hGH或其激動(dòng)劑變體具有更持久的藥理學(xué)效果，這可能歸結(jié)于其延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及用于預(yù)防和/或治療其中使用GH，優(yōu)選hGH是有利的疾病或病癥的方法，所述的方法包括將治療有效量的本發(fā)明的聚(乙二醇)修飾的hGH或其激動(dòng)劑變體單獨(dú)地或與其它治療劑聯(lián)合施用至需要它們的患者上。本發(fā)明也涉及本發(fā)明的聚(乙二醇)修飾的hGH或其激動(dòng)劑變體在生產(chǎn)用于預(yù)防和/或治療其中使用GH，優(yōu)選hGH是有利的疾病或病癥的藥物中的用途。而且，本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的聚(乙二醇)修飾的hGH或其激動(dòng)劑變體的藥物組合物，所述的藥物組合物用于預(yù)防和/或治療其中使用GH，優(yōu)選hGH是有利的疾病或病癥。其中使用GH是有利的疾病或病癥包括，但不限于生長(zhǎng)激素缺乏(GHD)、成人生長(zhǎng)激素缺陷(aGHD)、特納氏綜合征、短于胎齡出生(SGA)的兒童的生長(zhǎng)不足、帕-魏二氏綜合征(PWS)、慢性腎功能不全(CRI)、艾滋消瘦和衰老、晚期腎功衰竭、囊性纖維化、勃起功能障礙、HIV脂肪營(yíng)養(yǎng)障礙、纖維肌痛、骨質(zhì)疏松癥、記憶障礙、抑郁癥、克隆氏癥、骨骼發(fā)育不良、外傷性腦損傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血、努南綜合征、唐氏綜合征、先天性身材矮小癥(ISS)、晚期腎臟疾病(ESRD)、極低出生體重(VLBW)、骨髓干細(xì)胞救援、代謝綜合征、糖皮質(zhì)激素肌病、兒童中由于糖皮質(zhì)激素治療引起的身材矮小癥以及矮小早熟兒童伴隨的生長(zhǎng)不足。在本發(fā)明一更特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的聚(乙二醇)修飾的hGH及其激動(dòng)劑變體用于預(yù)防和/或治療選自GHD、aGHD、SGA、PWS、特納氏綜合征和CRI的疾病。在本發(fā)明的另一更特定的實(shí)施方案，本發(fā)明的聚(乙二醇)修飾的hGH或其激動(dòng)劑變體用于預(yù)防和/或治療選自先天性身材矮小癥、極低出生體重、外傷性腦損傷、代謝綜合征和努南綜合征的病癥或疾病。本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及包含單獨(dú)的本發(fā)明的聚(乙二醇)修飾的hGH或其激動(dòng)劑變體或與其它治療劑的組合，以及至少一種可藥用賦形劑或載體的藥物組合物。然后可將本發(fā)明的聚(乙二醇)修飾的hGH或其激動(dòng)劑變體配制成也含有可藥用稀釋劑、用于制備等滲溶液的試劑、pH調(diào)節(jié)劑等的藥物制劑以便將它們施用至患者。取決于治療目的，可將上面的藥物制劑經(jīng)皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、肺、皮內(nèi)或經(jīng)口施用。劑量也可以基于接受治療患者的疾病的種類和狀況，通常對(duì)成人通過(guò)注射的劑量是0.1mg-5mg，經(jīng)口服施用的劑量為0.1mg-50mg。如此處使用，本發(fā)明的聚(乙二醇)修飾的hGH或其激動(dòng)劑變體可以與另外的治療劑聯(lián)合使用。如此處使用的，提到化合物A和一種或多種其它治療劑時(shí)，術(shù)語(yǔ)“共施用”、“共施用的”和“與...聯(lián)合”意在表示如下，以及劑量如下并包括以下-當(dāng)將這些組分一起配制成單劑型時(shí)，同時(shí)施用A和治療劑的這種組合至需要治療的患者，所述的劑型基本以相同的時(shí)間釋放所述的組分至所述的患者。
-當(dāng)這些組分相互分開配制成單獨(dú)的劑型時(shí)，基本同時(shí)施用A和治療劑的這種組合至需要治療的患者，所述的單獨(dú)劑型基本同時(shí)由患者攝取，因此所述的組分基本同時(shí)釋放至所述的患者。
-當(dāng)這些組分相互分開配制成單獨(dú)的劑型時(shí)，相繼施用A和治療劑的這種組合至需要治療的患者，在每次施用之間有明顯的時(shí)間間隔，其中所述的單獨(dú)劑型以連續(xù)的次數(shù)由患者攝取，因此所述的組分以基本不同的次數(shù)釋放至所述的患者；以及-當(dāng)將這些組分一起配制成以可控制的方式釋放所述組分的單劑型時(shí)，相繼施用A和治療劑的這種組合至需要治療的患者，因此所述的組分由患者以相同和/或不同次數(shù)同時(shí)、連續(xù)和/或重疊施用?？梢耘cA聯(lián)合使用的其它治療劑、它們的可藥用鹽和/或它們的衍生形式的合適實(shí)例包括但不限于芳香酶抑制劑如依西美坦、福美坦、阿他美坦、法倔唑、來(lái)曲唑、伏氯唑和阿納托唑；游離脂肪酸調(diào)節(jié)劑，包括fibric酸衍生物(例如非諾貝特、氯貝特、吉非貝齊、苯扎貝特和環(huán)丙貝特)和煙酸衍生物如阿西莫司；胰島素致敏劑，包括但不限于，雙胍類如二甲雙胍、PPARγ胰島素致敏劑和thiazolodenione類如曲格列酮和羅格列酮，曲格列酮為5-[[4-[3，4-二氫-6-羥基-2，5，7，8-四甲基-2H-]-苯并吡喃-2-基)甲氧基]苯基]甲基3-2，4-噻唑烷二酮V411(DIABII，Glaucanin)，匹格列酮(ACTOS，AD 4833，U 72107，U 72107A，U 72107E，ZACTOS)，其化學(xué)名為2，4-噻唑烷二酮、5-[[4-[2-(5-乙基-2-吡啶基)乙氧基]苯基]甲基]-，一氫氯化物，(a/-)；羅格列酮(Avandia，BRL 49653，BRL 49653C)化學(xué)名為2，4-噻唑烷二酮、5-[[4-[2-(甲基-2-吡啶基arnino)乙氧基]苯基]甲基]；口服25貝沙羅汀(口服LGD 1069、口服Targretin、Targretin、口服Targretyn、口服Targrexin)，其化學(xué)名為4-[1-(3，5，5，8，8-五甲基-5，6，7，8-四氫-2-萘基)乙烯基]苯甲酸；ZD 2079、(ICI D 2079)(化學(xué)名R)-N-[2-4-(羧甲基)30苯氧基]乙基)-N-(2-羥基-2-苯乙基)氯化銨Netoglitazone，(Isaglitazone、MCC 555、RWJ 241947)(化學(xué)名5-[6(2-氟芐氧基)萘-2-基甲基]噻唑烷-2，4-二酮)；INS(D-手性-肌醇)(化學(xué)名D-1，2，3，4，5，6-六羥基環(huán)己烷)，ON 2344(DRF 2593)；Dexlipotam，化學(xué)名5(R)-(1，2-二硫雜環(huán)戊烷-3-基)pentaloic 35酸；HQL 975，化學(xué)名3-[4-[2-(5-甲基-2-苯基唑-4-基)乙氧基]苯基]-2(S)-(丙氨基)丙酸；YM 268，化學(xué)名5，5′-亞甲基-雙(1，4-亞苯基)雙亞甲基雙(噻唑烷-2，4-二酮)。處于開發(fā)的I PPAR激動(dòng)劑，包括Reglitazar(JTT 501，PNU 182716，PNU 716)(化學(xué)名異噁唑烷-3，5-二酮，i 4-[[4-(2-苯基-5-甲基)-1，3-噁唑基]乙氧基苯基-4]甲基-，(4RS))；I(RP 297，化學(xué)名105-(2，4-二氧代噻唑烷-5-基甲基)-2-甲氧基-N-[4-(三氟甲基)芐基苯酰胺；R 119702(CI 1037，CS 011)，化學(xué)名(/-)-5-[4-(5-甲氧基-1H苯并咪唑-2-基甲氧基)苯甲基]噻唑啉-2，4-二酮；鹽酸鹽；15 DRF 2189，化學(xué)名稱5-[[4-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯基]甲基]噻唑烷-2，4-二酮；皮質(zhì)醇合成抑制劑如酮康唑、益康唑或咪康唑；生長(zhǎng)激素如生長(zhǎng)激素(somatropin)或基因重組生長(zhǎng)激素(somatonorm)及其衍生物例如人生長(zhǎng)激素融合蛋白如ALBUTROPIN；聚乙二醇生長(zhǎng)激素例如半胱氨酸-乙二醇化生長(zhǎng)激素、BT005(Bolder BioTechnology公司)；生長(zhǎng)激素促分泌素例如SM 130686(Sumitomo)卡普瑞林(Pfizer)、美卡舍明(Fujisawa)、舍莫瑞林(Salk研究所，Bio-Technology General)、基因重組生長(zhǎng)激素(somatrem)、促生長(zhǎng)激素(C Llorente；Pharmacia公司)艾沙瑞林、他莫瑞林；CP 464709(Pfizer)、LY 426410和LY 444711(Lilly)；如WO2002057241公開的8-(氨基烷氧基亞氨基)-8H-二苯并[a，e]三唑[4，5-c]環(huán)庚烯類、如WO2002056873描述的2-取代的二苯并[a，e]1，2，3-三唑[4，5-c][7]輪烯-8-酮、如美國(guó)專利No.4,411,890和出版物WO 89/07110、WO 89/07111描述的生長(zhǎng)激素釋放肽GHRP-6和GHRP-1、如WO 93/04081中描述的B-HT920、hexarelin和GHRP-2或生長(zhǎng)激素釋放激素(GHRH，也命名為GRF)及其類似物、促生長(zhǎng)激素包括IGF-1和IGF-2及其衍生物如SomatoKine-胰島素樣生長(zhǎng)激素-1及其結(jié)合蛋白的一種重組融合蛋白、BP-3、α-2-腎上腺能激動(dòng)劑如可樂(lè)定、甲苯噻嗪、地托咪定和美托咪定或5-羥色胺5HTID激動(dòng)劑如surnitriptan或抑制促生長(zhǎng)素抑制素或其釋放的藥劑如毒扁豆堿和吡斯的明、ThGRF 1-44(Theratechnologies)；L 165166(Merck& Company)；如WO9858947描述的二肽衍生物、如US6521644、WO95/15309和WO98/19998描述的二肽基肽酶IV抑制劑如氨基-酰吡咯烷腈；β-氨基雜環(huán)二肽基肽酶抑制劑如在US20030100563和WO2003082817中描述的那些；如US20030055261、US20030040483、EP 18 072、EP 83 864、WO 89/07110、WO 89/01711、WO 89/10933、WO 88/9780、WO 83/02272、WO 91/18016、WO 92/01711、WO 93/04081、WO 9514666、EP0923539、美國(guó)專利號(hào)5,206,235、5,283,241、5,284,841、5,310,737、5,317,017、5,374,721、5,430,144、5,434,261、5,438,136、5,494,919、5,494,920、5,492,916、5,536,716和5,578,593、WO 94/13696、WO 94/19367、WO 95/03289、WO 95/03290、WO 95/09633、WO 95/11029、WO 95/12598、WO 95/13069、WO 95/14666、WO 95/16675、WO 95/16692、WO 95/17422、WO 95/17423、WO 95/34311和WO 96/02530描述的生長(zhǎng)激素釋放化合物、如US5804578、US5783582、WO2004007468描述的哌啶類、吡咯烷類和六氫-1H-氮雜類、AMIDOSPIROPIPERIDINES，例如在WO0104119中描述的那些、2-氨基-5-嘧啶乙酸化合物，包括如US6329383描述的2-[(5，6-二甲基-2-苯并咪唑基)氨基]-4-羥基-6-甲基-5-嘧啶乙酸鹽(2)和2-[(5，6-二甲基-2-苯并咪唑基)氨基]-4-羥基-6-甲基-5-嘧啶乙酸乙酯、如EP1155014描述的苯并咪唑類、涉及GRF的類似肽基化合物和美國(guó)專利4,411,890的肽、促性腺激素釋放激素的拮抗劑如在WO0170228、WO0170227、WO0170228、WO0069433、WO0004013、W0995156、WO9951595、WO9951231-4、WO9941251-2、WO9921557、WO9921553中描述的那些以及如WO0053602、WO0053185、WO0053181、WO0053180、WO0053179、WO0053178、US6288078中描述的6-氮雜吲哚化合物；IGF-1促分泌素；胰島素樣生長(zhǎng)激素-2(IGF-2或促生長(zhǎng)激素A)和IGF-2促分泌素；myostatin拮抗劑和抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)激素受體-3(FGFR-3)酪氨酸激酶的化合物。包括的聚合物也優(yōu)選在室溫下是水溶性的。一系列這種聚合物包括聚(烯基氧化物)均聚物如聚(乙二醇)或聚(丙二醇)、聚(氧乙烯化的多元醇)、其共聚物及其嵌段共聚物，但不限于此，只要嵌段共聚物的水溶性得以保持。作為基于PEG的聚合物的備選，也可使用有效地非抗原材料如葡聚糖、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(聚丙烯酰胺)、聚(乙烯醇)、基于碳水化合物的聚合物等。實(shí)際上，這些聚合物的α-和ε-末端基團(tuán)的活化可以以類似于用來(lái)轉(zhuǎn)化聚(烯基氧化物)的方式有效地進(jìn)行，并因而對(duì)一般技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，前面的名單僅是說(shuō)明性的并且所有具有這里描述的性質(zhì)的聚合物得以考慮。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，“有效地非抗原的”指本領(lǐng)域已知無(wú)毒的并不會(huì)在哺乳動(dòng)物中引起明顯的免疫源應(yīng)答的所有材料。
定義
以下是在此可以互換使用的縮寫和相應(yīng)含義的列表g 克mg 毫克ml或mL 毫升RT 室溫PEG 聚(乙二醇)正如特定地和獨(dú)立地指出通過(guò)引用作為參考的每個(gè)獨(dú)立的出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)，在該公開內(nèi)容中引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容在此通過(guò)引用作為參考。雖然為了清楚理解的目的已經(jīng)通過(guò)說(shuō)明和實(shí)例的方式相當(dāng)詳細(xì)地描述了前述的發(fā)明，但按照本發(fā)明的技術(shù)本領(lǐng)域技術(shù)人員將很容易明白可以做出改變和修飾而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。僅為了例證目的提供下面的實(shí)施例并且不意于限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍已經(jīng)在上面以廣泛的條款得以描述。在下面的實(shí)施例中，hGH是SEQ ID NO1的hGH?？梢岳斫猓琱GH或其激動(dòng)劑變體家族多肽的其它成員也可以類似于后面實(shí)施例中示范的方式進(jìn)行聚乙二醇化。
實(shí)施例實(shí)施例1分支的40,000MW PEG-丁醛hGH
本實(shí)施例說(shuō)明通過(guò)還原性烷基化產(chǎn)生基本均一的在N-末端單聚乙烯化的hGH制劑的方法。利用N-末端伯胺相對(duì)pKa值對(duì)賴氨酸殘基ε-氨基位點(diǎn)伯胺的pKa值的不同，通過(guò)還原性氨基化將約40,000MW(Shearwater Corp.)的甲氧基-分支PEG丁醛試劑選擇性地結(jié)合至hGH的N-末端。通過(guò)加入M-PEG-ALD以產(chǎn)生2∶1的相對(duì)PEG∶hGH摩爾比，使以10mg/mL溶解于25mM Hepes(Sigma Chemical圣路易斯，密蘇里州)pH 7.0(任選25mM MES(Sigma Chemical，圣路易斯，密蘇里州)pH 6.0、10mM乙酸鈉(Sigma Chemical，圣路易斯，密蘇里州)pH 4.5)中的hGH蛋白質(zhì)與甲氧基-PEG-丁醛、M-PEG-ALD(Shearwater公司，Huntsville，AL)反應(yīng)。通過(guò)加入溶解于水中的1M NaCNBH4儲(chǔ)液(Sigma Chemical，圣路易斯，密蘇里州)至10-50mM終濃度而催化反應(yīng)。反應(yīng)于RT下在黑暗中進(jìn)行18-24小時(shí)。通過(guò)加入1M Tris(Sigma Chemical，圣路易斯，密蘇里州)～pH 7.6達(dá)到50mM的Tris終濃度停止反應(yīng)或?qū)⒎磻?yīng)物稀釋進(jìn)合適的緩沖劑來(lái)立即純化。表1顯示通過(guò)分子排阻色譜測(cè)定的多-聚乙二醇化種類、單-聚乙二醇化綴合物、未反應(yīng)的PEG的百分比，以及40K分支PEG-乙醛和40K分支PEG-丁醛的最終純化產(chǎn)量。與PEG-乙醛相比PEG-丁醛導(dǎo)致增加的單聚乙二醇化綴合物、降低的未反應(yīng)PEG水平和增加的終產(chǎn)量。
表1
實(shí)施例2直鏈30,000MW PEG-丁醛hGH
使用實(shí)施例1描述的方法將甲氧基-直鏈30,000MWPEG-丁醛試劑結(jié)合至hGH的N-末端。
實(shí)施例3直鏈20,000MW PEG-丁醛hGH
使用實(shí)施例1描述的方法將甲氧基-直鏈20,000MWPEG-丁醛試劑結(jié)合至hGH的N-末端。
實(shí)施例4
聚乙二醇化hGH的純化
使用單個(gè)離子交換色譜步驟將聚乙二醇化hGH種類從反應(yīng)混合物中純化至＞95％(SEC分析)。
陰離子交換色譜
用單個(gè)陰離子交換色譜步驟將PEG hGH種類從反應(yīng)混合物中純化至＞95％(SEC分析)。使用陰離子交換色譜將單-聚乙二醇化hGH從未經(jīng)修飾的hGH和多-聚乙二醇化hGH中純化。如上所述，將典型的20K丁醛hGH反應(yīng)混合物(5-100mg蛋白質(zhì))于在25mM HEPES，pH 7.3(緩沖液A)中平衡的Q-Sepharose Hitrap柱(1或5mL)(Amersham Pharmacia Biotech，皮斯卡塔韋，新澤西)或Q-Sepharosefast flow柱(26/20，70mL柱床體積)上純化。用緩沖液A將反應(yīng)混合物稀釋5-10倍并以2.5mL/分鐘的流速上樣至柱中。用8柱體積緩沖液A洗滌該柱。隨后，用80-100柱體積緩沖液A和0-100mM的線性NaCl梯度將多種hGH種類從柱中洗脫。在280nm(A280)的吸光度監(jiān)控洗脫液，5mL的級(jí)份得以收集。根據(jù)聚乙二醇化程度如單、二、三聚乙二醇化等(如實(shí)施例15中評(píng)估的)合并級(jí)分。隨后將合并的級(jí)分在Centriprep YM10濃縮器(Amicon，Technology公司，Northborough，MA)中濃縮至0.5-5mg/mL。使用0.78的消光系數(shù)，通過(guò)A280測(cè)定合并的級(jí)分的蛋白濃度。
陽(yáng)離子交換色譜
陽(yáng)離子交換色譜在平衡于10mM乙酸鈉pH 4.0(緩沖液B)中的SP Sepharose高效柱(Pharmacia XK 26/20，70ml柱床體積)上進(jìn)行。用緩沖液B將反應(yīng)混合物稀釋10倍并以5mL/分鐘的流速上樣至柱中。接著用5柱體積的緩沖液B洗滌該柱，隨后用5柱體積12％的緩沖液C(10mM醋酸鹽pH 4.5，1M NaCl)洗滌。然后，用20柱體積12-27％緩沖液C的線性梯度將PEG-hGH種類從柱中洗脫。在280nm下監(jiān)控洗脫液，10mL的級(jí)分得以收集。根據(jù)聚乙二醇化程度(單、雙、三等)合并級(jí)分，將其交換進(jìn)10mM醋酸鹽pH 4.5緩沖液中并在具有Amicon YM10膜的stirred cell中濃縮至1-5mg/mL。使用0.78的消光系數(shù)，通過(guò)A280nm測(cè)定合并的級(jí)分的蛋白濃度。
實(shí)施例5生化鑒定
經(jīng)純化的聚乙二醇化hGH合并的級(jí)分通過(guò)非還原性SDS-PAGE、未變性分子排阻色譜和肽譜法鑒定。
分子排阻高效液相色譜法(SEC-HPLC)未變性SEC-HPLC
連接化學(xué)、大小、連接物和幾何多樣的甲氧基-PEG與hGH的反應(yīng)、陰離子交換純化合并的級(jí)分和最終純化產(chǎn)物使用未變性SEC-HPLC評(píng)估。分析非變性SEC-HPLC以0.5mL/分鐘流速，在20mM磷酸鹽pH 7.2、150mM NaCl中，使用柱Superdex 200 7.8mm×30cm(Amersham Bioscience，皮斯卡塔韋，新澤西)(任選TosohaasG4000PWXL Amersham Bioscience，皮斯卡塔韋，新澤西)進(jìn)行。聚乙二醇化極大地增加了蛋白的流體力學(xué)體積，導(dǎo)致轉(zhuǎn)變?yōu)檩^早的保留時(shí)間。新種類及未經(jīng)修飾的hGH可在PEG乙醛hGH反應(yīng)混合物中觀察到。將這些聚乙二醇化的和非聚乙二醇化的種類在Q-Sepharose色譜上分離，并且得到的純化的單PEG-乙醛hGH種類隨后顯示為在未變性SEC上作為單峰洗脫(＞95％純度)。Q-Sepharose色譜步驟有效地將游離PEG、hGH和多聚乙二醇化hGH種類從單-聚乙二醇化hGH除去。
變性SEC-HPLC
使用變性的SEC-HPLC評(píng)估丁醛聚乙二醇與hGH的反應(yīng)、陰離子交換純化和最終純化產(chǎn)物。以0.8mL/分鐘流速，在100mM磷酸鹽pH 6.8，0.1％SDS中使用Tosohaas 3000SWXL柱7.8mm×30cm(Tosohaas Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)進(jìn)行分析變性SEC-HPLC。聚乙二醇化極大地增加了蛋白質(zhì)的流體力學(xué)體積，導(dǎo)致轉(zhuǎn)變?yōu)檩^早的保留時(shí)間。將聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的種類在Q-Sepharose色譜上分離。
SDS PAGE/PVDF轉(zhuǎn)換
將SDS-PAGE用于評(píng)估PEG丁醛與hGH的反應(yīng)和純化的終產(chǎn)物。將SDS-PAGE于還原和未還原條件下在1mm厚的10-20％Tristricine凝膠(Invitrogen，卡爾斯巴德，加利福尼亞州)上進(jìn)行并用Novex Colloidal CoomassieTMG-250染色試劑盒(Invitrogen，卡爾斯巴德，加利福尼亞州)染色。將帶印記至PVDF膜上用于隨后的N-末端序列鑒定。
分析陰離子交換HPLC
使用分析陰離子交換HPLC評(píng)估PEG丁醛/hGH反應(yīng)混合物、陰離子交換純化級(jí)分和最終純化產(chǎn)物。以1mL/分鐘的流速，在50mMTris ph 8.6中使用Tosohaas Q5PW或DEAE-PW陰離子交換柱，7.5mm×75mm(Tosohaas Pharmacia Biotech，皮斯卡塔韋，新澤西)進(jìn)行分析陰離子交換HPLC。用5-200mM NaCl的線性梯度洗脫樣品。
N-末端序列和肽譜法
將自動(dòng)化埃德曼降解化學(xué)用于測(cè)定NH2-末端蛋白質(zhì)序列。將Applied Biosystems Model 494 Procise測(cè)序儀(Perkin Elmer，韋爾斯利，麻省)用于降解。各個(gè)PTH-AA衍生物采用裝配有PerkinElmer/Brownlee 2.1mm i.d.PTH-C18柱的Applied Biosystems Model140C PTH分析儀以在線的方式通過(guò)RP-HPLC分析而鑒定。以1mg/mL的濃度進(jìn)行胰蛋白酶消化，并且通常每次消化使用50μg材料。加入胰蛋白酶使得胰蛋白酶與PEG-hGH的比率為1∶30(w/w)。Tris緩沖液為30mM，pH 7.5。將樣品在室溫下孵育16±0.5小時(shí)。每mL消化溶液加入50μL 1N的HCl淬滅反應(yīng)。在將樣品置于自動(dòng)采樣器中前，將樣品在6.25％的乙腈中稀釋至0.25mg/ml的終濃度。首先加入乙腈(19.8％的乙腈)，輕微攪拌，并隨后加入水至終體積(初始體積的4倍)?？蓪㈩~外的消化溶液移出并于-20℃存儲(chǔ)一周。將Waters Alliance 2695HPLC系統(tǒng)用于分析，但其它的方法應(yīng)該產(chǎn)生類似的結(jié)果。使用的柱是具有5μm粒子的基于AstecC-4聚合物的25cm×4.6mm柱。通常以每樣品50μg蛋白質(zhì)上樣，在周圍溫度下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。緩沖液A是水中的0.1％的三氟乙酸；緩沖液B是乙腈中的0.085％的三氟乙酸。梯度如下時(shí)間 A％B％C％D％流量曲線0.00 0.00.0100.0 0.01.000 190.000.00.055.0 45.0 1.000 690.100.00.00.0100.0 1.000 691.000.00.00.0100.0 1.000 691.100.00.0100.0 0.01.000 695.000.00.0100.0 0.01.000 6
使用加熱外套將柱加熱至40℃。用Waters 996 PDA檢測(cè)器收集210和300nm之間的數(shù)據(jù)來(lái)檢測(cè)峰。將在214nm提取的色譜用于樣品分析。對(duì)hGH、40K分支PEG-醛和40K分支丁醛進(jìn)行胰蛋白酶圖譜分析(圖1)。N-末端胰蛋白酶片段稱為T-1。與未聚乙二醇化的hGH比較的百分比存在的T-1在表2中顯示。該數(shù)據(jù)顯示，使用PEG-醛90％的PEG修飾是在N-末端，而其它明顯地連接至數(shù)個(gè)可能的賴氨酸殘基之一上，而使用PEG-丁醛，多于98％的修飾是在N-末端。
表2
實(shí)施例6藥效研究大鼠體重增加
對(duì)在Taconic Lab經(jīng)垂體切除的雌性Sprague Dawley大鼠根據(jù)生長(zhǎng)率進(jìn)行為期7-11天的預(yù)篩選。將大鼠分為8組。組1的大鼠每日或第0天和第6天皮下劑量施用載體。組2的大鼠每日皮下劑量施用GH(30μg/大鼠/劑量)。組3大鼠第0天和第六天皮下劑量施用GH(180μg/大鼠/量)。組4大鼠第0天、第六天皮下劑量施用40k分支PEG-丁醛-hGH(180μg/大鼠/量)。通過(guò)在研究過(guò)程中至少每隔一日稱重來(lái)監(jiān)控垂體切除大鼠的體重增加。圖3&4。
大鼠脛骨長(zhǎng)度
在第11日處死在11日體重增加研究中的動(dòng)物，取出左側(cè)脛骨用X-射線檢測(cè)并且使用測(cè)徑器測(cè)量骨的長(zhǎng)度。圖5IGF-1研究
使用來(lái)自六-天體重增加研究的動(dòng)物。在研究過(guò)程中于不同時(shí)間取出血液樣品并通過(guò)ELISA測(cè)定血清IGF-1的水平。圖6血清生化研究
如表3所示，將在11日體重增加研究中的動(dòng)物在第0天和第六天累積施用1.8mg/kg后在第7天用于評(píng)估血清的生化值。
表3
*p＜0.10比載體，p＜0.05比hGHALB，白蛋白；ALP，堿性磷酸酯酶；ALT，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶；AST，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶；BUN，血尿素氮；Ca2+，鈣；Chol，膽固醇；CRE，肌酐；Phos，磷酸鹽；TP，蛋白總量；TBA，總膽汁酸；SDH，山梨醇脫氫酶；LDH，乳酸脫氫酶；Na+，鈉；K+，鉀；Cl-，氯。在11日，相對(duì)于用載體處理的組，用hGH和PHA-794428處理的動(dòng)物中血尿素氮濃度以相同程度明顯減少(p＜0.10)。這表明由于增強(qiáng)的生長(zhǎng)過(guò)程中新蛋白質(zhì)的合成使氮的利用增強(qiáng)。
藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究
藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究在正常的、有插管的Sprague-Dawley雄性大鼠中進(jìn)行。每組使用6只大鼠，以單次皮下推注的形式注射100μg/kg/大鼠的GH或PEG-GH。適當(dāng)?shù)卦?-5日提取血樣用于檢測(cè)相應(yīng)的PK參數(shù)。使用免疫測(cè)定法監(jiān)控每一樣品的GH和PEG-GH的血中濃度。
hGH免疫測(cè)定
使用hGH AutoDELFIA試劑盒熒光免疫測(cè)定法(PerkinElmer)測(cè)定小鼠和短尾猴血漿中的hGH和聚乙二醇化的hGH的蛋白濃度水平。大鼠和人IGF-1水平通過(guò)免疫測(cè)定試劑盒(Diagnostic System Laboratories)監(jiān)控。
非人靈長(zhǎng)類中實(shí)施例1的hGH-PEG綴合物的無(wú)房室藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。將實(shí)施例1的hGH-PEG綴合物以0.18mg/kg靜脈內(nèi)(iv)或皮下(sc)推注注射施用給短尾猴(表4)。用n＝3只動(dòng)物的平均數(shù)據(jù)測(cè)定PK參數(shù)。使用AutoDELFIA試劑盒熒光免疫測(cè)定法(PerkinElmer)和預(yù)先測(cè)定的PEG-GH綴合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)量血漿濃度。
表4
序列表序列表<110>Pharmacia CorporationFinn，Rory<120>N-末端單聚乙二醇化人生長(zhǎng)激素綴合物、用于制備它們的方法及其使用方法<130>32152A<150>10/771,895<151>2004-02-04<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>191<212>PRT<213>智人<400>1Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg1 5 10 15Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu20 25 30Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro35 40 45Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg50 55 60Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu65 70 75 80Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Ser Leu Arg Ser Val
85 90 95Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp100 105 110Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu115 120 125Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser130 135 140Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr145 150 155 160Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe165 170 175Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe180 185 190
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防和/或治療其中使用生長(zhǎng)激素是有利的疾病或病癥的方法，所述的方法包括給需要它的患者單獨(dú)施用治療有效量的具有式I或II結(jié)構(gòu)的聚(乙二醇)-修飾的hGH， 式I或mPEG-O(CH2CH2O)n(CH2)mCH2-NH-R式II其中n是1-10之間的整數(shù)；m是1-10之間的整數(shù)；R是人生長(zhǎng)激素或甲硫氨酰生長(zhǎng)激素，或與另外的治療劑聯(lián)合施用，其中，所述的使用生長(zhǎng)激素是有利的疾病或病癥選自勃起機(jī)能障礙、HIV脂肪營(yíng)養(yǎng)障礙、纖維肌痛、骨質(zhì)疏松癥、記憶障礙、抑郁癥、克隆氏癥、骨骼發(fā)育不良、外傷性腦損傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血、努南氏綜合征、唐氏綜合征、先天性身材矮小癥(ISS)、晚期腎臟疾病(ESRD)、極低出生體重(VLBW)、骨髓干細(xì)胞救援、代謝綜合征、糖皮質(zhì)激素肌病、兒童中由于糖皮質(zhì)激素治療引起的身材矮小癥以及矮的早熟兒童伴隨的生長(zhǎng)不足。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的其中使用GH是有利的疾病或病癥選自先天性身材矮小癥、極低出生體重、外傷性腦損傷、代謝綜合征和努南綜合征。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中n等于4并且m等于3。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的聚(乙二醇)修飾的hGH具有n等于4并且m等于3的式I結(jié)構(gòu)。
5如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的人生長(zhǎng)激素含有SEQID NO1的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中大于90％的所述的聚乙二醇結(jié)合至SEQ ID NO1的氨基酸序列的氨基末端苯丙氨酸上。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中大于95％的所述的聚乙二醇結(jié)合至SEQ ID NO1的氨基酸序列的氨基末端苯丙氨酸上。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中每個(gè)mPEG具有約20kDa的分子量。
9.一種組合物，其包含式I或II的人生長(zhǎng)激素-PEG的綴合物與另一種治療劑以及至少一種可藥用載體的組合， 式I或mPEG-O(CH2CH2O)n(CH2)mCH2-NH-R式II其中n是1-10之間的整數(shù)；m是1-10之間的整數(shù)；R是人生長(zhǎng)激素或甲硫氨酰生長(zhǎng)激素。
10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述的聚(乙二醇)修飾的hGH具有n等于4并且m等于3的式I結(jié)構(gòu)。
全文摘要
本發(fā)明提供通過(guò)將聚乙二醇丁醛部分連接到該蛋白的N－末端的苯丙氨酸上的經(jīng)化學(xué)修飾的人生長(zhǎng)激素(hGH)。根據(jù)本發(fā)明所述經(jīng)化學(xué)修飾的蛋白比未經(jīng)修飾的hGH可以具有長(zhǎng)得多的持續(xù)hGH活性，能降低劑量和安排時(shí)序。本發(fā)明還包括用于治療和/或預(yù)防其中使用生長(zhǎng)激素是有利的疾病或病癥的方法。
文檔編號(hào)A61K38/27GK1929857SQ200580007393
公開日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2005年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月4日
發(fā)明者R·F·芬恩 申請(qǐng)人:法瑪西雅公司