專利名稱：一種蛋白質(zhì)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防和治療膿毒癥的蛋白質(zhì)，具體地說(shuō)是一種同活化C蛋白功能相似的用于預(yù)防和治療膿毒癥的蛋白。
背景技術(shù)：
膿毒癥是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、休克、大手術(shù)后常見(jiàn)的并發(fā)癥，是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的一常見(jiàn)病種，它有極高的發(fā)病率和死亡率。(Alerti C，Brun-Buission C，Burchardi H，etal.Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentercohort study[J].Intensive Care Med，2002，28(2)108-121.)膿毒癥是指由感染或者有高度可疑感染灶引起的全身炎癥反應(yīng)綜合癥，其病原菌包括細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)及病毒等，臨床癥狀包括但不限于(1)體溫＞38℃或＜36℃；(2)心率＞90次/分鐘；呼吸＞20次/分鐘或PaCO2＜32mm Hg；(4)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)＞12×109/L，＜4×109/L或成熟粒細(xì)胞＞10％；(5)器官功能障礙，高灌注或高血壓。(王正國(guó).膿毒癥研究概況[J].中華創(chuàng)傷雜志，2003，19(1)5-7.)自20世紀(jì)80年代以來(lái)，隨著對(duì)膿毒癥發(fā)病機(jī)制研究的深入，開(kāi)發(fā)各種旨在抑制膿毒癥形成的藥物也隨即興起，并進(jìn)行了80多項(xiàng)臨床試驗(yàn)，其中幾個(gè)有希望的藥物進(jìn)行了III期臨床試驗(yàn)，但是遺憾的是僅有一個(gè)藥物(活化C蛋白)被開(kāi)發(fā)成功。(PoldermanKH and Girbes ARJ.Drug intervention trials in sepsisdivergent results[J].Lancet，2004，3631721-1723.)。活化C蛋白(商品名為Xigris)的開(kāi)發(fā)成功為新的治療嚴(yán)重膿毒癥藥物的開(kāi)發(fā)提供了借鑒，特別是在天然產(chǎn)物中尋找同其功能相似的物質(zhì)，在此稱為活化C蛋白樣酶(activated protein C like enzyme)。由于在靜脈血栓病人中約有64％的患者對(duì)活化C蛋白是抗性的，所以這部分病人患膿毒癥后再用Xigris治療肯定是無(wú)效的，而活化C蛋白樣物質(zhì)就可以彌補(bǔ)Xigris的不足。另外，Xigris的生產(chǎn)過(guò)程復(fù)雜，生產(chǎn)成本較高，每個(gè)病人一個(gè)療程的費(fèi)用約為6800美元，如此高的價(jià)格限制了它在臨床上的廣泛應(yīng)用。以上這些原因使得活化C蛋白樣酶的尋找和開(kāi)發(fā)有著非常重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。(，馮軍，趙文杰.活化C蛋白[J].國(guó)外醫(yī)藥——合成藥、生化藥、制劑藥分冊(cè)，2002，23(6)348～351.)我國(guó)有著豐富的蛇毒資源，在世界各地分布的500多種毒蛇，在我國(guó)就有150多種。蛇毒是一種混合物，它含有許多種類(lèi)具有不同生物活性的蛋白質(zhì)，其中很多蛋白質(zhì)作用于人血液系統(tǒng)的成分。(Markland FS.Snake venoms and the hemostatic system[J]Toxicon，1998，36(12)1749～1800.)但是，至今沒(méi)有發(fā)現(xiàn)利用蛇毒單一組分進(jìn)行預(yù)防和治療膿毒癥的報(bào)道。
基于活化C蛋白被成功開(kāi)發(fā)為治療嚴(yán)重膿毒癥藥物和蛇毒中存在多種作用于血液系統(tǒng)的組分，有必要提出從蛇毒中尋找活化C蛋白樣酶，進(jìn)行治療膿毒癥創(chuàng)新藥物的開(kāi)發(fā)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于預(yù)防和治療膿毒癥的蛋白質(zhì)，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
本發(fā)明需要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供這種蛋白在制備治療膿毒癥的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明公開(kāi)了一種蛋白質(zhì)，是由124個(gè)氨基酸殘基組成的活化C蛋白樣酶，在體外它既能顯著延長(zhǎng)人血漿活化部分凝血活酶時(shí)間又能水解活化C蛋白特異顯色肽底物，在體內(nèi)它能顯著降低膿毒癥試驗(yàn)動(dòng)物的死亡率。上述活化C蛋白樣酶可以是從天然產(chǎn)物提取的也可以是用基因工程手段制備的重組活化C蛋白樣酶。上述活化C蛋白樣酶的分子量在15.3kD(±5000kD)。上述活化C蛋白樣酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)如附圖4所示的氨基酸序列組成。其氨基酸序列如SEQ ID NO1Ser Leu Ile Gln Phe Glu Thr Leu Ile Met Lys Val Ala Lys Lys5 10 15Ser Gly Ile Phe Trp Tyr Ser Asn Tyr Gly Cys Tyr Cys Gly Trp20 25 30Gly Gly Gln Gly Arg Pro Gln Asp Ala Thr Asp Arg Cys Cys Phe35 40 45Val His Asp Cys Cys Tyr Gly Lys Val Thr Gly Cys Asp Pro Lys50 55 60Met Asp Val Tyr Ser Phe Ser Glu Glu Asn Gly Asp Ile Val Cys65 70 75Gly Gly Asp Asp Pro Cys Lys Lys Glu Ile Cys Glu Cys Asp Arg80 85 90Ala Ala Ala Ile Cys Phe Arg Asp Gln Leu Thr Asp Tyr Asn Asp95 100 105
Lys Lys Tyr Trp Ala Phe Gly Ala Lys Asn Cys Pro Gln Glu Glu110 115 120Ser Glu Pro Cys這種預(yù)防和治療膿毒癥的蛋白質(zhì)來(lái)源于蝮蛇毒(Agkistrodon halys venom)，但不限于蛇毒。
本發(fā)明還公開(kāi)了該蛋白的制備方法，該方法包括如下步驟(1)蛇毒溶于起始緩沖液即Tris-HCl緩沖液中，4℃透析過(guò)夜，然后取出，離心，離心條件為4℃，10000g，30min，取上清；(2)用SOURCE 30Q作為層析介質(zhì)進(jìn)行陰離子交換層析分離蛇毒，陰離子層析的柱體積為30ml，流速為5ml/min；用起始緩沖液平衡5倍柱體積；上樣量為10ml；先用3倍柱體積的起始緩沖液洗脫未吸附部分，再使用梯度洗脫，梯度液組成為起始緩沖液(A)，起始緩沖液+0.2mol/L NaCl緩沖液(B)，B從0～100％，洗脫20倍CV；取峰5中的收集液；(3)用截留分子量為3000的醋酸纖維素膜超濾濃縮，取濃縮液做凝膠過(guò)濾層析，層析介質(zhì)為Superdex 75pre grade，凝膠過(guò)濾層析柱體積為150ml；流速為0.5ml/min；PBS緩沖液平衡1倍柱體積；上樣量為2ml；PBS緩沖液洗脫1.5倍柱體積；取峰2中的收集液。
本發(fā)明活化C蛋白樣酶的制備方法中最優(yōu)選地原料使用蝮蛇毒(Agkistrodonhalys)，陰離子交換層析填料使用瑞典Amersham Biosciences公司生產(chǎn)的SOURCE30Q，凝膠過(guò)濾層析填料使用瑞典Amersham Biosciences公司生產(chǎn)的Superdex 75pregrade。
陰離子交換層析得到的6個(gè)蝮蛇毒組分峰進(jìn)行水解活化C蛋白特異顯色肽能力的測(cè)定，結(jié)果表明僅有峰5組分具有明顯的水解L PefachromePCa3297的能力。
分別對(duì)陰離子交換層析得到的6個(gè)蝮蛇毒組分峰進(jìn)行水解活化C蛋白特異顯色肽能力的測(cè)定，結(jié)果表明僅有峰5組分具有明顯的水解L PefachromePCa3297的能力陰離子交換分離層析分離到的峰5經(jīng)凝膠過(guò)濾層析后，結(jié)果得到2個(gè)組分峰，分別對(duì)這2個(gè)組分峰進(jìn)行延長(zhǎng)人血漿活化部分凝血活酶時(shí)間和水解顯色肽試驗(yàn)測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明峰2中的各管收集液既能顯著延長(zhǎng)人血漿活化部分凝血活酶時(shí)間又具有較強(qiáng)的水解顯色肽的能力，這表明峰2中的組分是活化C蛋白樣酶。
進(jìn)行SDS-PAGE，其中分離膠的濃度為12.5％，濃縮膠的濃度為4％，對(duì)得到的活化C蛋白樣酶進(jìn)行純度檢測(cè)和分子量測(cè)定。SDS-PAGE結(jié)果為單一條帶，見(jiàn)附圖3。以低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率(Rf)為橫坐標(biāo)，低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算，得出APCL的分子量為15.3kD。
序列測(cè)定表明活化C蛋白樣酶是由124個(gè)氨基酸組成，序列組成見(jiàn)序列表。
活化C蛋白樣酶對(duì)正常小鼠的毒性測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明在72h內(nèi)，在任何一個(gè)劑量組均沒(méi)有觀察到小鼠的死亡，同時(shí)也沒(méi)有觀察到小鼠的外觀體征和行為活動(dòng)發(fā)生異常的變化，因此可以確定APCL對(duì)小鼠的LD50低于400mg/kg bwt。
活化C蛋白樣酶對(duì)膿毒癥實(shí)驗(yàn)小鼠的作用，小鼠注射脂多糖24h后，開(kāi)始觀察到有小鼠的死亡，繼續(xù)觀察至72h。活化C蛋白樣酶能顯著降低膿毒癥小鼠的死亡率，低劑量組降低20％，中劑量組降低65％，高劑量組降低70％。
本發(fā)明中蛇毒來(lái)源的蛋白質(zhì)，即活化C蛋白樣酶的用途是用于制備預(yù)防和治療膿毒癥的藥物。
本發(fā)明中蛇毒來(lái)源的蛋白質(zhì)的制備方法同活化C蛋白相比，具有來(lái)源方便，生產(chǎn)簡(jiǎn)單易行，成本低等優(yōu)點(diǎn)。
圖1為陰離子交換層析圖譜。
圖2為凝膠過(guò)濾層析圖譜。
圖3為活化C蛋白樣酶的SDS-PAGE檢測(cè)圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 陰離子交換層析分離蝮蛇毒稱取0.5g蝮蛇毒，溶于10ml 0.05mol/L，pH7.6的Tris-HCl緩沖液(起始緩沖液)中，對(duì)該緩沖液透析過(guò)夜(4℃)，然后取出，離心(4℃，10000g，30min)，棄沉淀，收集上清，進(jìn)行陰離子交換層析，層析條件如下層析介質(zhì)SOURCE 30Q；柱體積30ml；流速5ml/min；柱平衡用起始緩沖液平衡5倍柱體積；上樣量10ml；洗脫先用3倍柱體積的起始緩沖液洗脫未吸附部分，再使用梯度洗脫，梯度液組成為起始緩沖液(A)，起始緩沖液+0.2mol/L NaCl緩沖液(B)，B從0～100％，洗脫20倍CV；收集8.0ml/管。
采用SOURCE 30Q陰離子交換層析介質(zhì)對(duì)蝮蛇毒進(jìn)行分離，得到了6個(gè)組分，具體結(jié)果見(jiàn)附圖1和表1。
表1 陰離子交換層析各組分峰的積分結(jié)果
實(shí)施例2 延長(zhǎng)人血漿活化部分凝血活酶時(shí)間的測(cè)定取凝血活酶(白陶土-腦磷脂)混懸液0.1ml，加正常人混合新鮮血漿0.1ml，對(duì)照組加生理鹽水0.1ml，混勻，37℃水浴孵育5min，加入0.025mol/L氯化鈣溶液0.1ml，立即開(kāi)動(dòng)秒表，記錄凝血時(shí)間，試驗(yàn)組除用蝮蛇毒分離液代替生理鹽水外，其它與對(duì)照組相同。[參見(jiàn)，王鴻利.血栓與止血檢驗(yàn)技術(shù)，第一版[M]，上海上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1992，66-67.]分別對(duì)陰離子交換層析得到的6個(gè)蝮蛇毒組分峰進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明峰5組分具有明顯的延長(zhǎng)活化部分凝血活酶時(shí)間，其中一管收集液可比對(duì)照的時(shí)間延長(zhǎng)10倍，而其它5個(gè)組分峰僅有較弱的延長(zhǎng)活化部分凝血活酶時(shí)間的能力。
實(shí)施例3 水解活化C蛋白特異顯色肽能力的測(cè)定取4μmol/L PefachromePCa3297(活化C蛋白特異顯色肽，購(gòu)自瑞典Pentapharm公司)0.2ml，加pH8.4的0.05mol/L Tris-咪唑緩沖液1.65ml，再加入不同的蝮蛇毒分離液0.2ml，混勻，在405nm測(cè)吸收值的變化(測(cè)定3min)。參比溶液為用0.2ml水溶液替換蛇毒溶液的上述溶液組成。[參見(jiàn)，Martinoli JL，Stocker K.Fast functionalprotein C assay using Protac，a novel protein C activator[J].Thromb Res，1986，43(3)253～264.]分別對(duì)陰離子交換層析得到的6個(gè)蝮蛇毒組分峰進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明僅有峰5組分具有明顯的水解L PefachromePCa3297的能力。
實(shí)施例4 凝膠過(guò)濾層析純化活化C蛋白樣酶合并經(jīng)陰離子交換分離層析分離到的峰5中的各管收集液，用截留分子量為3000的醋酸纖維素膜超濾濃縮，取濃縮液做凝膠過(guò)濾層析。層析條件如下層析介質(zhì)Superdex 75pre grade；柱體積150ml；流速0.5ml/min；柱平衡PBS緩沖液(0.15mol/L NaCl，0.2mol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH 7.0)平衡1倍柱體積；上樣量2ml；洗脫P(yáng)BS緩沖液洗脫1.5倍柱體積；收集3ml/管。
層析結(jié)果陰離子交換分離層析分離到的峰5經(jīng)凝膠過(guò)濾層析后，結(jié)果得到2個(gè)組分峰，具體結(jié)果見(jiàn)附圖2和表2。
表2 凝膠過(guò)濾層析各組分峰的積分結(jié)果
分別對(duì)這2個(gè)組分峰進(jìn)行延長(zhǎng)人血漿活化部分凝血活酶時(shí)間和水解顯色肽試驗(yàn)測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明峰2中的各管收集液既能顯著延長(zhǎng)人血漿活化部分凝血活酶時(shí)間又具有較強(qiáng)的水解顯色肽的能力，這表明峰2中的組分是活化C蛋白樣酶。
實(shí)施例5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析活化C蛋白樣酶按照文獻(xiàn)[參見(jiàn)，李建武，余瑞元，袁明秀等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法[M].北京北京大學(xué)出版社，1997，174～176.]進(jìn)行SDS-PAGE，其中分離膠的濃度為12.5％，濃縮膠的濃度為4％，對(duì)得到的活化C蛋白樣酶進(jìn)行純度檢測(cè)和分子量測(cè)定。
SDS-PAGE結(jié)果為單一條帶，見(jiàn)附圖3。以低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率(Rf)為橫坐標(biāo)，低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算，得出APCL的分子量為15.3kD。圖中，M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子；1號(hào)為活化C蛋白樣酶。
實(shí)施例6 活化C蛋白樣酶的氨基酸組成序列測(cè)定序列測(cè)定表明活化C蛋白樣酶是由124個(gè)氨基酸組成，序列組成見(jiàn)序列表。
實(shí)施例7 活化C蛋白樣酶對(duì)膿毒癥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的作用(1)脂多糖對(duì)小鼠LD100的測(cè)定取18～22g小鼠30只，每10只分為一組，雌雄各半，分別以2mg/kg bwt(體重)、10mg/kg bwt和50mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射脂多糖(E.coli 055B5，購(gòu)自Sigma公司)溶液，注射速度為0.5ml/min，在72h內(nèi)觀察各組小鼠的死亡情況。
小鼠被注射脂多糖24h后，開(kāi)始觀察到有小鼠的死亡，繼續(xù)觀察至72h。具體各組小鼠的死亡情況見(jiàn)表3。從表中可看出小鼠對(duì)脂多糖的敏感性較低，只有當(dāng)脂多糖的劑量達(dá)到50mg/kg bwt時(shí)，其致死率才達(dá)到100％，因此確定本試驗(yàn)所測(cè)定的脂多糖對(duì)小鼠LD100為50mg/kg bwt，該劑量約相當(dāng)于每只小鼠注射1.0mg的脂多糖。
表3 LPS對(duì)小鼠LD100的測(cè)定結(jié)果
(2)活化C蛋白樣酶對(duì)正常小鼠的毒性測(cè)定取18～22g小鼠24只，每6只分為一組，雌雄各半，分別以4mg/kg bwt、40mg/kgbwt、100mg/kg bwt和400mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射APCL溶液，注射速度為0.5ml/min，在72h內(nèi)觀察各組小鼠的死亡情況。
試驗(yàn)結(jié)果表明在72h內(nèi)，在任何一個(gè)劑量組均沒(méi)有觀察到小鼠的死亡，同時(shí)也沒(méi)有觀察到小鼠的外觀體征和行為活動(dòng)發(fā)生異常的變化，因此可以確定APCL對(duì)小鼠的LD50低于400mg/kg bwt。
(3)活化C蛋白樣酶對(duì)膿毒癥實(shí)驗(yàn)小鼠的作用取18～22g小鼠80只，每20只分為一組，雌雄各半，分成四組。第一組以50mg/kgbwt的劑量尾靜脈注射脂多糖溶液；第二組先以2mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射0.4mg/ml的活化C蛋白樣酶溶液，30min后再以50mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射2mg/ml的脂多糖溶液；第三組先以4mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射0.4mg/ml的活化C蛋白樣酶溶液，30min后再以50mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射2mg/ml的脂多糖溶液；第四組先以8mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射0.4mg/ml的活化C蛋白樣酶溶液，30min后再以50mg/kg bwt的劑量尾靜脈注射2mg/ml的脂多糖溶液注射速度均為0.5ml/min，在72h內(nèi)觀察各組小鼠的死亡情況，計(jì)算死亡率。
小鼠注射脂多糖24h后，開(kāi)始觀察到有小鼠的死亡，繼續(xù)觀察至72h。各組小鼠的死亡情況見(jiàn)表4。從表中可看出活化C蛋白樣酶能顯著降低膿毒癥小鼠的死亡率，低劑量組降低20％，中劑量組降低65％，高劑量組降低70％。
表4 活化蛋白C樣酶降低膿毒癥小鼠死亡率的試驗(yàn)結(jié)果
實(shí)施例8在實(shí)施例7下“用活化C蛋白樣酶對(duì)膿毒癥實(shí)驗(yàn)小鼠的作用”中以先注射脂多糖，再注射活化C蛋白樣酶做替換，也得到了相類(lèi)似的試驗(yàn)結(jié)果。
序列表<110>上海醫(yī)藥工業(yè)研究院<120>一種蛋白質(zhì)及其用途<130>SPI058153<160>1<170>Patent In Version2.1<210>1<211>124<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>CHAIN<400>1Ser Leu Ile Gln Phe Glu Thr Leu Ile Met Lys Val Ala Lys Lys5 10 15Ser Gly Ile Phe Trp Tyr Ser Asn Tyr Gly Cys Tyr Cys Gly Trp20 25 30Gly Gly Gln Gly Arg Pro Gln Asp Ala Thr Asp Arg Cys Cys Phe35 40 45Val His Asp Cys Cys Tyr Gly Lys Val Thr Gly Cys Asp Pro Lys50 55 60Met Asp Val Tyr Ser Phe Ser Glu Glu Asn Gly Asp Ile Val Cys65 70 75Gly Gly Asp Asp Pro Cys Lys Lys Glu Ile Cys Glu Cys Asp Arg80 85 90Ala Ala Ala Ile Cys Phe Arg Asp Gln Leu Thr Asp Tyr Asn Asp95 100 105Lys Lys Tyr Trp Ala Phe Gly Ala Lys Asn Cys Pro Gln Glu Glu110 115 120Ser Glu Pro Cys
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白在制備預(yù)防和治療膿毒癥的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種來(lái)源于蛇毒的同活化C蛋白功能相似的蛋白質(zhì)，用于膿毒癥的預(yù)防和治療。本發(fā)明還公開(kāi)了該蛋白的制備方法，可采用陰離子交換和凝膠過(guò)濾相結(jié)合的層析技術(shù)從蛇毒中分離純化。本發(fā)明公開(kāi)的蛋白可應(yīng)用于制備預(yù)防和治療膿毒癥的藥物，同活化C蛋白相比，具有來(lái)源方便，生產(chǎn)簡(jiǎn)單易行，成本低等優(yōu)點(diǎn)，有著非常重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。
文檔編號(hào)A61P17/02GK1847262SQ20051002505
公開(kāi)日2006年10月18日 申請(qǐng)日期2005年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月13日
發(fā)明者馮軍, 趙文杰, 朱寶泉 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院