專利名稱：一種e1a蛋白及其制備方法，以及含該蛋白的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種E1A蛋白及其制備方法，以及抗腫瘤的含該E1A蛋白的組合物及其在制備治療腫瘤疾病藥物方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人類腺病毒5型E1A基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個抑癌基因(Oncogene，1992，71255~1258)。它編碼兩個主要蛋白，一個含243個氨基酸(12S)，另一個含289個氨基酸(13S)，這是由于兩個外顯子被選擇性剪切而形成的。研究表明E1A能調(diào)控多種基因的表達，調(diào)控細胞周期(Oncogene，1995，11467～474)。體外及體內(nèi)的實驗證明它能誘導(dǎo)腫瘤細胞分化，表型向正常細胞轉(zhuǎn)變，抑制腫瘤細胞生長及轉(zhuǎn)移，且與p53基因的狀態(tài)無關(guān)，也不論其他癌基因如Ras是否突變被激活，E1A都能在較大程度上提高腫瘤細胞對化療藥物及射線的敏感性(Oncogene，1996，131083～1092；Oncogene，1998，172167~2175)。
大量臨床及基礎(chǔ)研究已經(jīng)證明腫瘤的耐藥性是嚴(yán)重影響患者療效的關(guān)鍵問題。在死亡的癌癥患者中，約有61％為內(nèi)在性耐藥，約有33％為獲得性耐藥，二者合計約有90％以上的患者因耐藥使化療失敗而死[中華醫(yī)學(xué)雜志，2001，Vol 81(24)，P1481]。因此，克服耐藥性是提高療效的關(guān)鍵問題之一。雖然手術(shù)和放療在腫瘤的治療中發(fā)揮著重要的作用。但這些局部治療的措施對于未形成腫瘤結(jié)節(jié)的亞臨床病灶即散在的癌細胞效果都不理想。而這些散在的癌細胞往往造成復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。另一方面，由于一些腫瘤部位重要器官密集如頭頸腫瘤，可切除范圍有限，手術(shù)時為了保存器官的功能而往往會殘存一些癌細胞在患者體內(nèi)。這些都是造成復(fù)發(fā)的重要原因。
化療作為全身治療本來是殺傷這些殘存癌細胞的有效措施，但由于部分腫瘤固有的耐藥性致使效果一直較差。國外Wolf博士領(lǐng)導(dǎo)的研究組對10年來多個腫瘤中心的頭頸腫瘤化療的結(jié)果進行了總結(jié)，結(jié)果表明化療雖對部分病人癥狀的緩解有一定效果，但對五年生存率無明顯影響(Head and Neck，1999，21；689-693)。針對目前的現(xiàn)狀，研發(fā)新的抗腫瘤藥物是非常必要的。
目前，在國外E1A多采用基因治療的方式。然而，與其它一些基因一樣，E1A的基因治療也存在亟待解決的問題，如腺病毒載體的免疫原性；非病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低；載體缺乏靶向性及特異性；基因表達的不可調(diào)控性；特別是他能隨機整合到細胞基因組DNA中引起染色體移位及由于DNA片段插入而引起新的基因失活或激活等諸多因素，又可能導(dǎo)致基因組出現(xiàn)新的異常變化。這些都制約了E1A基因治療的實際應(yīng)用(J.Natl.Cancer Inst，1997，8921～39)。大量研究已經(jīng)證明酵母表達系統(tǒng)發(fā)酵適合于大規(guī)模生產(chǎn)，特別是在翻譯后水平加工如糖基化等修飾接近于哺乳動物，適合于要求維持高級結(jié)構(gòu)才能保持生物活性的蛋白表達等而倍受人們關(guān)注(Biochem.Biophys.Res.Commun，2000，267169～173)。我們采用了脂質(zhì)體作為E1A蛋白的轉(zhuǎn)運載體，對耐藥的腫瘤細胞S-180肉瘤在昆明小鼠和人頭頸腫瘤細胞LN686在裸鼠體內(nèi)生長的影響進行了觀察，為E1A蛋白代替其基因治療提供了依據(jù)。經(jīng)檢索，尚未見國內(nèi)外有類似的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對目前腫瘤治療所面臨的世界性難題，尋找常規(guī)手術(shù)、化療和放射治療之外新的有效方法，以期提高腫瘤的治療效果。
本發(fā)明的目的是提供一種E1A蛋白，編碼E1A蛋白的E1A基因的表達載體、其制備方法，本發(fā)明的另一目的是提供一種抗腫瘤的E1A蛋白組合物及其在制備治療腫瘤藥物方面的應(yīng)用，本發(fā)明克服了E1A基因治療導(dǎo)致基因組出現(xiàn)異常變化而療效不確切的缺點，且無明顯毒副作用。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種抗腫瘤的E1A蛋白，所述E1A蛋白具有SEQ ID No.2的氨基酸序列；所述的E1A蛋白是由具有SEQ ID No.1核苷酸序列的E1A(12S)基因所編碼，所述E1A(12S)基因的表達載體，包括質(zhì)粒和所述的E1A(12S)基因。
所述質(zhì)?？梢杂烧婧吮磉_系統(tǒng)如酵母表達系統(tǒng)，或真核表達系統(tǒng)如大腸桿菌表達系統(tǒng)代替。
所述腫瘤為實體瘤，尤其是頭頸腫瘤。
一種抗腫瘤藥物，包括介導(dǎo)物質(zhì)和前述的E1A蛋白。
一種抗腫瘤藥物，包括介導(dǎo)物質(zhì)、博萊霉素和前述的E1A蛋白。所述介導(dǎo)物質(zhì)為脂質(zhì)體，或其它介導(dǎo)物質(zhì)。
所述抗腫瘤藥物還可以進一步包括其它藥物或射線。
一種E1A蛋白的制備方法，包括以下步驟E1A(12S)基因表達載體的構(gòu)建取質(zhì)粒DNA(PUC-E1A)、上游引物、下游引物，用于PCR，上游引物為5′CGACTCGAGATGAGACATATTATCTGCCAC3′，上游引物5′含有Xho I酶切位點；下游引物為5′ATAGCGGCCGCTTATGGCCTGGGGCGTTTACA3′，下游引物5′含有Not位點；PCR反應(yīng)條件下得到PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物純化后，用Xho I，Not I酶切，再克隆到pPIC9載體的Xho I，Not I位點，篩選獲得重組質(zhì)粒pPIC9/E1A；酵母細胞的轉(zhuǎn)化及篩選重組質(zhì)粒pPIC9/E1A經(jīng)Bgl II線性化，電穿孔法轉(zhuǎn)導(dǎo)酵母細胞，將轉(zhuǎn)化子均勻鋪在置于MD平板上的硝酸纖維素膜上，30℃培養(yǎng)3天；待克隆形成后轉(zhuǎn)至MM平板上，28℃誘導(dǎo)E1A蛋白表達，48h后，將膜取出，用E1A單抗篩選陽性菌株.由于表達產(chǎn)物為分泌型，在菌落周圍形成環(huán)狀，挑選形成顏色深的環(huán)狀菌落，即為表達工程菌株；重組菌株的誘導(dǎo)表達重組菌株接種于BMGY培養(yǎng)液中，30℃搖瓶培養(yǎng)，生長至菌體密度A600＝10-20，離心收取細胞，重懸于BMMY誘導(dǎo)液中，28℃誘導(dǎo)表達，每24h補加甲醇至終濃度1％，誘導(dǎo)72h；E1A蛋白的純化利用Pharmacia AKTA FPLC層析系統(tǒng)，將BMMY誘導(dǎo)液離心、過濾、經(jīng)Tris-HCl緩沖液透析后，上由Tris-HCl緩沖液平衡的HiTrapQ陰離子交換柱，用Tris-HCl緩沖液含0-0.2M NaCL線性梯度洗脫，獲得E1A蛋白的粗分離產(chǎn)物；將其用50mM，PH 4.0醋酸緩沖液透析后，再上由50mM，PH 4.0醋酸緩沖液平衡的HiTrap SP陽離子交換柱，用醋酸緩沖液含0-0.15M NaCL線性梯度洗脫，流速為5ml/min，獲得純化的E1A蛋白。
為得到所述表達載體，所述PCR產(chǎn)物反應(yīng)條件為94℃、30sec，55℃、30sec，72℃、1min，30個循環(huán)后，72℃延伸7min。
所述轉(zhuǎn)導(dǎo)酵母細胞為GS115(Mut+，His-)；所述MD平板為含有34％YNB，4×10-5％生物素，1％葡萄糖，1％瓊脂的平板；所述MM平板為含有1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甲醇，1％瓊脂的平板；所述BMGY培養(yǎng)液為100mmol/LK3PO4，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油培養(yǎng)液；所述BMMY培養(yǎng)液為100mmol/L K3PO4，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甲醇培養(yǎng)液。所述Tris-HCl緩沖液為50mM，PH 7.5，含0.1mM dTT，1mM EDTA，20mM KCl緩沖液。
一種包括介導(dǎo)物質(zhì)和前述的E1A蛋白藥物組合物在制備治療腫瘤疾病藥物方面的應(yīng)用。
一種包括介導(dǎo)物質(zhì)、博萊霉素和前述的E1A蛋白藥物組合物在制備治療腫瘤疾病藥物方面的應(yīng)用，所述藥物組合物還可以進一步包括其它介導(dǎo)物質(zhì)、藥物或射線。
本發(fā)明采用上述方法制備的E1A蛋白，以及以脂質(zhì)體為E1A蛋白轉(zhuǎn)運載體，與博萊霉素聯(lián)合用藥，能顯著抑制腫瘤生長并提高腫瘤對化療藥物博萊霉素的敏感性，為治療腫瘤及克服腫瘤對化療藥物耐藥性的難題提供了新的措施；同時，用E1A蛋白治療腫瘤還克服了E1A基因治療的缺點和不足。因此，E1A蛋白在腫瘤的治療中具有重要的臨床應(yīng)用價值。


圖1為SDS-PAGE分析和Western blot鑒定。
其中(a)為SDS-PAGE分析1表示蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量，2表示純化后的E1A蛋白；(b)為Western blot鑒定純化后的E1A蛋白圖2為E1A蛋白對S-180肉瘤在昆明小鼠體內(nèi)生長的抑制及化療增敏作用。
其中-○-對照組-△-博萊霉素組-●-脂質(zhì)體組-■-E1A蛋白+脂質(zhì)體組-◆-E1A蛋白+脂質(zhì)體+博萊霉素組圖3為E1A蛋白對在裸鼠體內(nèi)生長的頭頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤的抑制及化療藥物增敏作用。
其中-○-對照組-△-博萊霉素組-●-脂質(zhì)體組
-■-E1A蛋白+脂質(zhì)體組-◆-E1A蛋白+脂質(zhì)體+博萊霉素組-▲-環(huán)磷酰胺組具體實施方式
實施例1E1A蛋白的制備制備如圖1所示E1A蛋白的方法，步驟如下1、PCR擴增E1A(12S)基因和載體構(gòu)建。取1μg質(zhì)粒DNA(PUC-E1A)用于PCR，所用上、下游引物分別為5′CGACTCGAGATGAGACATATTATCTGCCAC3′，5′ATAGCGGCCGCTTATGGCCTGGGGCGTTTACA3′。上游引物5′含有Xho I，下游引物5′含有Not I(已在引物中標(biāo)明)位點。反應(yīng)條件為94℃、30sec，55℃、30sec，72℃、1min，30個循環(huán)后，72℃延伸7min.PCR產(chǎn)物純化后，用Xho I，Not I酶切，再克隆到pPIC9載體的Xho I，Not I位點，篩選獲得重組質(zhì)粒pPIC9/E1A，序列分析結(jié)果正確。
2、酵母細胞的轉(zhuǎn)化及篩選。重組質(zhì)粒pPIC9/E1A經(jīng)Bgl II線性化，電穿孔法轉(zhuǎn)導(dǎo)酵母細胞GS115(Mut+，His-)，將轉(zhuǎn)化子均勻鋪在置于MD(1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％葡萄糖，1％瓊脂)平板上的硝酸纖維素膜上，30℃培養(yǎng)3天.待克隆形成后轉(zhuǎn)至MM(1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甲醇，1％瓊脂)平板上，28℃誘導(dǎo)E1A蛋白表達，48h后，將膜取出，用E1A單抗篩選陽性菌株。由于表達產(chǎn)物為分泌型，在菌落周圍形成環(huán)狀，挑選形成顏色深的環(huán)狀菌落，即為高表達工程菌株。
3、重組菌株的誘導(dǎo)表達。重組菌株接種于BMGY(100mmol/L K3PO4，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油)培養(yǎng)液中，30℃搖瓶培養(yǎng)，生長至菌體密度A600＝10-20，離心收取細胞，重懸于BMMY(100mmol/L K3PO4，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甲醇)誘導(dǎo)液中，28℃誘導(dǎo)表達，每24h補加甲醇至終濃度1％，誘導(dǎo)72h，進行SDS-PAGE及Western blot分析。
4、E1A蛋白的純化。利用Pharmacia AKTA FPLC層析系統(tǒng)，將BMMY誘導(dǎo)液離心、過濾、經(jīng)Tris-HCl緩沖液(50mM，PH 7.5，含0.1mM dTT，1mMEDTA，20mM KCl)透析后，上由Tris-HCl緩沖液平衡的陰離子交換柱(HiTrapQ)，用Tris-HCl緩沖液含0-0.2M NaCL線性梯度洗脫，獲得E1A蛋白的粗分離產(chǎn)物。將其用醋酸緩沖液(50mM，PH 4.0)透析后，再上由醋酸緩沖液(50mM，PH 4.0)平衡的陽離子交換柱(HiTrap SP)，用醋酸緩沖液含0-0.15M NaCL線性梯度洗脫，流速為5ml/min，獲得純化的E1A蛋白。進行10％SDS-PAGE及Western blotting分析鑒定。純化的蛋白為單一條帶，經(jīng)Westernblot鑒定正確。
實施例2如圖2所示的E1A蛋白對耐藥的S180肉瘤的抑制及化療增敏曲線。
昆明(KM)小鼠25只，皮下接種S180肉瘤細胞40萬/只，待腫瘤長至約5毫米時，記錄腫瘤體積，開始給藥。對照組(腫瘤局部注射生理鹽水5mL/kg)；博萊霉素組(腹腔注射博萊霉素5mg/kg)；脂質(zhì)體組(腫瘤局部注射脂質(zhì)體2mL/只)；E1A蛋白組(腫瘤局部注射脂質(zhì)體2mL/kg+E1A蛋白2mg/kg)；合并組(腫瘤局部注射脂質(zhì)體2mL/kg+E1A蛋白2mg/kg及腹腔注射博萊霉素5mg/kg)。每兩天給藥一次，共給藥6次，并測量腫瘤的長徑和短徑，腫瘤體積＝長徑×短徑2×0.52。經(jīng)6次給藥后，與對照組相比，博萊霉素的抑瘤率為20％，E1A蛋白抑瘤率為52％，博萊霉素與E1A蛋白聯(lián)合使用時，抑瘤率提高為73％，可見E1A蛋白有明顯的增敏作用。
實施例3如圖3所示的E1A蛋白及環(huán)磷酰胺對LN686人頭頸淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移瘤體內(nèi)生長的抑制及增敏曲線。
裸鼠(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院動物中心)60只，皮下接種LN686腫瘤塊約50mm3/只，接種后5天開始給藥并記錄腫瘤體積，隔天給藥，共給藥8次。對照組(腫瘤局部注射生理鹽水5mL/kg)；博萊霉素組(腹腔注射博萊霉素5mg/kg)；脂質(zhì)體組(腫瘤局部注射脂質(zhì)體1.25mL/kg)；E1A蛋白組(腫瘤局部注射脂質(zhì)體1.25mg/kg+E1A蛋白2.5mg/kg)；合并組(腫瘤局部注射脂質(zhì)體1.25mg/kg+E1A蛋白2.5mg/kg及腹腔注射博萊霉素5mg/kg)。環(huán)磷酰胺組(腹腔注射環(huán)磷酰胺64mg/Kg·BW，(見Cancer Res.1999，59(20)5176-5180)，經(jīng)4次給藥后，由于毒性較大，死亡2只。測量腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤體積＝長徑×短徑2×0.52。實驗進行到第38天時，與對照組相比較，博萊霉素，E1A蛋白，E1A蛋白與博萊霉素聯(lián)合作用，及環(huán)磷酰胺對人LN686腫瘤細胞的抑制率分別為52.8％、90％、95.5％、77.4％。E1A蛋白的抑瘤率(90％)明顯高于環(huán)磷酰胺(77％)，且未發(fā)現(xiàn)明顯的毒副作用。
權(quán)利要求
1.一種E1A蛋白，所述E1A蛋白具有SEQ ID No.2的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的E1A蛋白，所述E1A蛋白是由具有SEQ ID No.1核苷酸序列的E1A(12S)基因所編碼。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的E1A蛋白，所述E1A(12S)基因的表達載體，包括質(zhì)粒和權(quán)利要求2所述的E1A(12S)基因，所述質(zhì)?？梢杂烧婧吮磉_系統(tǒng)如酵母表達系統(tǒng)，或真核表達系統(tǒng)如大腸桿菌表達系統(tǒng)代替。
4.一種抗腫瘤藥物組合物，包括介導(dǎo)物質(zhì)和權(quán)利要求1-3之一所述的E1A蛋白。
5.一種抗腫瘤藥物組合物，包括介導(dǎo)物質(zhì)、博萊霉素或其它藥物或射線和權(quán)利要求1-4之一所述的E1A蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的抗腫瘤藥物組合物，所述介導(dǎo)物質(zhì)可以為脂質(zhì)體或其它介導(dǎo)物質(zhì)。
7.一種E1A蛋白的制備方法，包括以下步驟E1A(12S)基因表達載體的構(gòu)建取質(zhì)粒DNA(PUC-E1A)、上游引物、下游引物，用于PCR，上游引物為5′CGACTCGAGATGAGACATATTATCTGCCAC3′，上游引物5′含有Xho I；下游引物為5′ATAGCGGCCGCTTATGGCCTGGGGCGTTTACA3′，下游引物5′含有Not位點；PCR反應(yīng)條件下得到PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物純化后，用Xho I，Not I酶切，再克隆到pPIC9載體的Xho I，Not I位點，篩選獲得重組質(zhì)粒pPIC9/E1A；酵母細胞的轉(zhuǎn)化及篩選重組質(zhì)粒pPIC9/E1A經(jīng)Bgl II線性化，電穿孔法轉(zhuǎn)導(dǎo)酵母細胞，將轉(zhuǎn)化子均勻鋪在置于MD平板上的硝酸纖維素膜上，30℃培養(yǎng)3天；待克隆形成后轉(zhuǎn)至MM平板上，28℃誘導(dǎo)E1A蛋白表達，48h后，將膜取出，用E1A單抗篩選陽性菌株；由于表達產(chǎn)物為分泌型，在菌落周圍形成環(huán)狀，挑選形成顏色深的環(huán)狀菌落，即為表達工程菌株；重組菌株的誘導(dǎo)表達重組菌株接種于BMGY培養(yǎng)液中，30℃搖瓶培養(yǎng)，生長至菌體密度A600＝10-20，離心收取細胞，重懸于BMMY誘導(dǎo)液中，28℃誘導(dǎo)表達，每24h補加甲醇至終濃度1％，誘導(dǎo)72h；E1A蛋白的純化利用Pharmacia AKTA FPLC層析系統(tǒng)，將BMMY誘導(dǎo)液離心、過濾、經(jīng)Tris-HCl緩沖液透析后，上由Tris-HCl緩沖液平衡的HiTrapQ陰離子交換柱，用Tris-HCl緩沖液含0-0.2M NaCL線性梯度洗脫，獲得E1A蛋白的粗分離產(chǎn)物；將其用50mM，PH4.0醋酸緩沖液透析后，再上由50mM，PH4.0醋酸緩沖液平衡的HiTrap SP陽離子交換柱，用醋酸緩沖液含0-0.15M NaCL線性梯度洗脫，流速為5ml/min，獲得純化的E1A蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的E1A蛋白的制備方法，所述PCR反應(yīng)條件為94℃、30sec，55℃、30sec，72℃、1min，30個循環(huán)后，72℃延伸7min。所述轉(zhuǎn)導(dǎo)酵母細胞為GS115(Mut+，His-)；所述MD平板為含有34％YNB，4×10-5％生物素，1％葡萄糖，1％瓊脂的平板；所述MM平板為含有1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甲醇，1％瓊脂的平板；所述BMGY培養(yǎng)液為100mmol/L K3PO4，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油培養(yǎng)液；所述BMMY培養(yǎng)液為100mmol/LK3PO4，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甲醇培養(yǎng)液。所述Tris-HCl緩沖液為50mM，PH7.5，含0.1mM dTT，1mM EDTA，20mM KCl緩沖液。
9.一種權(quán)利要求4所述的E1A蛋白藥物組合物在制備治療腫瘤疾病藥物方面的應(yīng)用。
10.一種權(quán)利要求5所述的E1A蛋白藥物組合物在制備治療腫瘤疾病藥物方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種E1A蛋白，編碼E1A蛋白的E1A基因的表達載體及其制備方法，以及抗腫瘤的E1A蛋白藥物組合物，其組合物在制備治療腫瘤藥物方面的應(yīng)用。本發(fā)明E1A蛋白能明顯提高腫瘤細胞對化療藥物和射線的敏感性。E1A蛋白制備的藥物對耐藥S180肉瘤的抑瘤率可達73％；對人LN686腫瘤細胞的抑瘤率可達95.5％。本發(fā)明克服了E1A基因治療導(dǎo)致基因組可能出現(xiàn)異常變化影響療效的缺點，且無明顯毒副作用。
文檔編號A61P35/00GK1524874SQ03105240
公開日2004年9月1日 申請日期2003年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月25日
發(fā)明者趙清正 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所