專利名稱：聯(lián)合疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及聯(lián)合疫苗的制備方法，所述聯(lián)合疫苗能同時預(yù)防嬰兒的各種疾病，例如，預(yù)防應(yīng)該在嬰兒中預(yù)防的白喉、破傷風(fēng)、百日咳、乙型肝炎和其它疾病。
背景技術(shù)：
聯(lián)合疫苗是指通過聯(lián)合對于其它多種感染性疾病而言的每種疾病的保護(hù)性抗原而制成的疫苗或通過聯(lián)合預(yù)防某種感染性疾病的多種相關(guān)抗原而制成的疫苗。
前者的例子包括能提高對白喉、破傷風(fēng)和百日咳的免疫力的DTP疫苗，能提高對麻疹、流行性腮腺炎和風(fēng)疹的免疫力的MMR疫苗等。上述疫苗已經(jīng)使用了20年。后者的例子包括通過聯(lián)合14或23種肺炎球菌多糖制成的能提高對肺炎的免疫力的肺炎球菌疫苗，和通過聯(lián)合4種腦膜炎球菌多糖制成的能提高預(yù)防腦膜炎的免疫力的腦膜炎球菌疫苗等等。上述疫苗已經(jīng)使用了幾年。
因?yàn)楣J(rèn)上述疫苗對于各種感染性疾病具有高度致免疫能力和較低的副作用，而且對預(yù)防各種疾病具有很好的適應(yīng)性，上述疫苗已經(jīng)使用了許多年。由于上述同樣原因，疫苗開發(fā)者最近正在研制多種聯(lián)合疫苗。作為上述聯(lián)合疫苗，通過聯(lián)合DTP疫苗、細(xì)菌性腦腦膜炎疫苗(Hib疫苗)、滅活的脊髓灰質(zhì)炎疫苗和乙型肝炎疫苗制得了疫苗(國際公布號WO99/13906)。某種聯(lián)合疫苗是通過聯(lián)合與蛋白接合的肺炎球菌和腦膜炎球菌多糖制得的。不久將會研制出能預(yù)防由霍亂、傷寒、痢疾和腹瀉的各種致病細(xì)菌引起的腸道感染的疫苗。
通過聯(lián)合各種抗原制備的用以預(yù)防各種其它感染性疾病的聯(lián)合疫苗有利于減少接種次數(shù)、簡化疫苗供應(yīng)從而降低成本。根據(jù)兒科協(xié)會(Pediatrics Association)推薦的嬰兒疫苗接種程序(1997)，嬰兒在出生后1年內(nèi)要接受多次注射，因?yàn)楸憷蛏〉脑?，疫苗的注射有時與不同的疫苗重疊。因此，以正確的方法為基礎(chǔ)接種嬰兒從而給接種者和被接種者提供某種便利是非常重要的。特別地，作為標(biāo)準(zhǔn)化的疫苗接種程序，接種DTP和乙型肝炎疫苗要在嬰兒第一年中進(jìn)行三次基礎(chǔ)注射并要加強(qiáng)注射。另外，由于推薦的疫苗接種程序相似，所以會發(fā)生重疊注射的問題。
為了給接種者和被接種者的疫苗接種提供某種便利，本發(fā)明的發(fā)明者通過研究開發(fā)了DTP和乙型肝炎疫苗的聯(lián)合疫苗，并穩(wěn)定了該疫苗的供應(yīng)，從而為更多人提供疫苗接種的益處。
由于聯(lián)合疫苗的研究主要是聯(lián)合來自具有免疫性和穩(wěn)定性的疫苗產(chǎn)品的各種組分抗原，因此，上述研究中聯(lián)合方法的研制對于使因各保護(hù)性抗原和吸附劑間相互作用而產(chǎn)生的反應(yīng)和免疫性的變化降至最小是重要的。隨著研制的完成，評估了本發(fā)明的聯(lián)合疫苗制劑的均一性和穩(wěn)定性。在本發(fā)明中，研究是以已被證實(shí)了具有免疫性和穩(wěn)定性的DTP疫苗和乙型肝炎疫苗為基礎(chǔ)進(jìn)行的。
聯(lián)合各種組分疫苗的方法包括將各種組分疫苗簡單聯(lián)合的方法(國際公布號WO 99/13906和WO 00/7623)，在進(jìn)行疫苗接種時用特殊設(shè)計的容器同時施用的方法(國際公布號WO 99/13906)和通過將疫苗的各種組分和配料混合到一個制劑中來聯(lián)合疫苗的制備方法。考慮到疫苗的供應(yīng)，由前兩種方法制備的聯(lián)合疫苗的用法與每種單價疫苗獨(dú)立使用相似，它比每種單價疫苗更需要注意疫苗的操作，因此使用這種形式的聯(lián)合疫苗并沒有什么好處。另外，不可能針對免疫性變化和副作用的產(chǎn)生進(jìn)行研究。因此，在聯(lián)合疫苗的研究中，作為一種產(chǎn)品優(yōu)選將每種疫苗組分混合到一個制劑中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種聯(lián)合疫苗的制備方法，所述聯(lián)合疫苗能預(yù)防嬰兒的各種疾病，例如，預(yù)防應(yīng)該在嬰兒中預(yù)防的白喉、破傷風(fēng)、百日咳和乙型肝炎。
相應(yīng)地，本發(fā)明的一個目的是提供聯(lián)合疫苗的制備方法，所述聯(lián)合疫苗能同時預(yù)防嬰兒的多種疾病，例如，預(yù)防應(yīng)該在嬰兒中預(yù)防的白喉、破傷風(fēng)、百日咳和乙型肝炎。
為達(dá)到上述目的，提供了一種聯(lián)合疫苗的制備方法，該方法包括將針對各種疾病的每種保護(hù)性抗原獨(dú)立地吸附到吸附劑上的吸附步驟；和將上述吸附到吸附劑上的每種保護(hù)性抗原混合的聯(lián)合步驟。
本發(fā)明還提供了下述方法，其中保護(hù)性抗原是從包括白喉抗原、破傷風(fēng)抗原、百日咳抗原、乙型肝炎抗原或其中的兩種或多種組合中選擇出的抗原。
本發(fā)明還提供了其中吸附劑是氫氧化鋁凝膠的方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種根據(jù)上述任一方法生產(chǎn)的聯(lián)合疫苗。
更特別地，本發(fā)明提供一種聯(lián)合疫苗的制備方法，該方法包括針對各種疾病，如應(yīng)在嬰兒中預(yù)防的白喉、破傷風(fēng)、百日咳和乙型肝炎，將每種保護(hù)性抗原獨(dú)立地吸附到氫氧化鋁凝膠吸附劑上的步驟；和吸附后使吸附到吸附劑上的各種保護(hù)性抗原聯(lián)合的步驟。
本發(fā)明的抗原并不局限于提到過的疾病而是適用于各種疾病的各種抗原。


參考附圖將可更好地理解本發(fā)明，附圖只是用來說明本發(fā)明，因此不能限定本發(fā)明，其中圖1顯示以吸附劑濃度為基礎(chǔ)各種組分抗原的吸附比率。白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素和乙型肝炎病毒表面抗原是白喉抗原、破傷風(fēng)抗原和乙型肝炎抗原的組分，百日咳類毒素和百日咳FHA抗原(百日咳絲狀血凝集素微粒)是純化的百日咳抗原的各種組分。
圖2a到2d顯示以吸附方法為基礎(chǔ)的抗原性和免疫性，其中樣品1是在各種組分疫苗的聯(lián)合完成之后加入過量的氫氧化鋁凝膠，樣品2是在聯(lián)合完成之前預(yù)先加入同樣濃度的上述吸附劑；圖2a和2b分別顯示樣品1和2的相對抗原性，圖2c和2d分別顯示與樣品1和2中每種抗原對應(yīng)的抗體形成的相對水平。
圖3顯示以每只猴子收集的血液樣品數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，與猴子來源的血清中每種抗原對應(yīng)的抗體形成的水平，其中這些猴子已被施用了根據(jù)本發(fā)明制備的聯(lián)合疫苗或同時施用了DTP和乙型肝炎的各種疫苗產(chǎn)品。指定組1同時施用DTP和乙型肝炎的各種疫苗，指定組2施用聯(lián)合疫苗。
具體實(shí)施例方式
制備包括各種疫苗組分的聯(lián)合疫苗的方法分為兩步作為一種產(chǎn)品使形成各種組分疫苗的抗原聯(lián)合并用吸附劑進(jìn)行吸附的步驟；和在所述方法中吸附劑作為一種組分的情況下，使預(yù)先被吸附的抗原聯(lián)合的步驟。然而，在預(yù)先混合各種組分抗原的情況下，由于溶液中抗原和配料之間的相互作用，各種抗原吸附劑的吸附能力可能下降。另外，在各個獨(dú)立的條件下優(yōu)化吸附劑和組分抗原間的吸附。如果上述吸附過程同時進(jìn)行，由于各種組分抗原吸附條件的不同，吸附比率可能下降。因?yàn)榻M分抗原的吸附劑的吸附比率和疫苗的免疫性之間的相互關(guān)系成反比，因此，與每種單價疫苗的免疫性相比，通過同時進(jìn)行的過程制備的聯(lián)合疫苗的免疫性可能會下降。
因此，本發(fā)明的發(fā)明者認(rèn)為通過制備每種組分抗原的本體溶液、獨(dú)立地進(jìn)行每種抗原的吸附，再將吸附的抗原聯(lián)合的方法制備的聯(lián)合疫苗是合適的。
另外，在將各組分抗原以各種吸附形式聯(lián)合的情況下，為了比較疫苗產(chǎn)品中疫苗抗原的免疫性和特性，在聯(lián)合疫苗中各組分抗原的終濃度應(yīng)該與各種傳統(tǒng)的單價疫苗中各組分抗原的濃度相同。因此，為制備聯(lián)合疫苗，要吸附并聯(lián)合比單個疫苗濃度更高的組分抗原。DTP疫苗是以用濃縮了1.5～2倍的抗原的吸附為基礎(chǔ)制備的，乙型肝炎疫苗是用濃縮了2～3倍的抗原制備的。根據(jù)本發(fā)明，通過調(diào)節(jié)每種抗原的聯(lián)合比率，聯(lián)合疫苗的各種組分抗原的終濃度與各種單個疫苗的濃度是一致的。
在本發(fā)明中，發(fā)明者為開發(fā)聯(lián)合疫苗進(jìn)行了各種聯(lián)合的研究。在這種情況下，疫苗產(chǎn)品中各種免疫組分的最終含量是和單價疫苗的含量一樣的。另外，每種抗原吸附比率的變化通過控制吸附劑和其它組分的含量來監(jiān)控。給小動物接種免疫吸附比率有很少變化的每種樣品以比較抗體形成的水平。通過評估小動物中抗體形成的結(jié)果選出合適的聯(lián)合方法。
另外，對當(dāng)前商購的DTP疫苗和乙型肝炎疫苗的吸附劑的評估結(jié)果顯示，主要使用氫氧化鋁凝膠和磷酸鋁凝膠。已知蛋白在每種鋁凝膠上的吸附是各蛋白和膠組分的表面電荷造成的。也已知?dú)溲趸X凝膠在生理學(xué)pH范圍具有正表面電荷，而磷酸鋁凝膠具有負(fù)表面電荷(“疫苗設(shè)計一亞基和佐劑的探討”(“Vaccine Design-The subunit andadjuvant approach”M.F.Powell&M.J.Newman編輯，1995，頁229-239)。在同時使用上述兩類鋁凝膠的情況下，產(chǎn)生某種相互作用，所以溶液中顆粒大小可能增加，對蛋白的吸附能力可能下降。另外，乙型肝炎疫苗和聯(lián)合疫苗的各組分抗原的表面電荷在生理學(xué)pH范圍一般具有負(fù)表面電荷。因此，氫氧化鋁凝膠適合作為吸附劑。
在傳統(tǒng)技術(shù)中，吸附劑如氫氧化鋁凝膠和磷酸鋁凝膠的組分是共同使用的(國際公布號WO 93/24148)，但基于上述原因，本發(fā)明的發(fā)明者認(rèn)為聯(lián)合疫苗的吸附劑應(yīng)該有相同的鹽類型，作為吸附劑使用的氫氧化鋁凝膠是獲得各組分抗原某一吸附比率的重要因素。
但是，顯然，在本發(fā)明中吸附劑涵蓋的不僅是氫氧化鋁凝膠還有它的等效物。
另外，由本發(fā)明制備的聯(lián)合疫苗中，作為主要組分，除乙型肝炎抗原外，其它組分抗原包括蛋白，而在乙型肝炎疫苗中，抗原一般以包含磷脂層的粒子形式存在。因此，當(dāng)為本發(fā)明制備的聯(lián)合疫苗制備乙型肝炎疫苗時，為減少其它抗原對包含磷脂層的乙型肝炎疫苗抗原的磷脂組分的某種干擾，優(yōu)選加入一種中性表面活性劑如聚山梨醇酯20(吐溫20)、聚山梨醇酯80(吐溫80)和粹通(Triton)X-100。
因?yàn)樵谥行员砻婊钚詣┖扛叩那闆r下，乙型肝炎疫苗的效價有下降的趨勢，因此優(yōu)選加入低于乙型肝炎表面抗原蛋白量的50％質(zhì)量比的中性表面活性劑，但上述量并不限定于此。
在本發(fā)明中，制備白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheria)PWNo.8作為白喉的抗原并培養(yǎng)于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中。優(yōu)選白喉類毒素，其通過使利用傳統(tǒng)方法純化的白喉毒素脫毒而獲得?？乖炕趦和瘎┝績?yōu)選為10～25Lf。對于破傷風(fēng)抗原，破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetanii)，Harvard，在厭氧條件下培養(yǎng)于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中。通過使利用傳統(tǒng)方法純化的破傷風(fēng)毒素脫毒而獲得破傷風(fēng)類毒素是適用的?？乖炕趦和瘎┝績?yōu)選為1～5Lf。另外，百日咳抗原用百日咳博德特氏菌(BordetellaPertussis)Tohama phase 1培養(yǎng)于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，在培養(yǎng)物上清中多種抗原蛋白包括百日咳類毒素用傳統(tǒng)方法提純并脫毒。純化的百日咳抗原或全細(xì)胞百日咳抗原是適用的。這里，提供聯(lián)合疫苗的制備方法，其中在多種抗原的情況下，基于兒童劑量，抗原總量低于20μgPN，在全細(xì)胞百日咳抗原的情況下，基于兒童劑量，抗原含量優(yōu)選低于20 OE。本發(fā)明還涉及一種聯(lián)合疫苗的制備方法，其中純化的多種抗原蛋白包含脫毒的百日咳類毒素和絲狀血細(xì)胞凝集素(FHA)抗原。
優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種聯(lián)合疫苗的制備方法，其中重組乙型肝炎表面抗原基于兒童劑量為5～10μg，重組乙型肝炎表面抗原作為乙型肝炎抗原是用遺傳工程方法制成的。更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種制備方法，其中以2～8℃攪拌3～20小時使乙型肝炎表面抗原吸附到吸附劑上。為了找到用以制備聯(lián)合疫苗的最佳的吸附劑含量，在吸附劑的每個濃度，分析每種抗原組分的吸附比率。結(jié)果，在最終聯(lián)合完成的時候，鋁離子的最終濃度低于0.5mg/ml時，每種抗原的吸附比率相對下降(如圖1所示)。另外，規(guī)章規(guī)定用于疫苗的鋁凝膠中鋁離子濃度在1.25mg/ml以下(WHO，在技術(shù)報告系列號800(Technical Report Series No.800)1990，頁87～179中“對白喉、破傷風(fēng)、百日咳和聯(lián)合疫苗的要求(Requirementsfor diphtheria，tetanus，pertussis，and combined vaccine)”)。因此，對于氫氧化鋁凝膠，鋁離子的終濃度優(yōu)選在0.5～1.25mg/ml的范圍內(nèi)，更優(yōu)選為0.7mg/ml。
另外，甚至是在各組分聯(lián)合完成之后，為了避免由于各組分抗原間產(chǎn)生的斥力而使得各組分抗原吸附比率下降的可能性，各組分抗原的抗原性和抗體形成水平被轉(zhuǎn)化為相對百分比，以比較以下兩種樣品中的那些數(shù)值一種樣品，除氫氧化鋁凝膠外的其它組分被預(yù)先聯(lián)合，然后另外加入過量的氫氧化鋁凝膠；和一種樣品，在聯(lián)合完成前預(yù)先加入相同濃度的吸附劑。甚至是在各組分的聯(lián)合完成之后加入過量的吸附劑，抗原性和抗體形成水平的變化也下降(如圖2所示)。
另外，在樣品中加入聚山梨醇酯80(吐溫80)時，仍保持對乙型肝炎的抗原性和效價(如圖2所示)。預(yù)計甚至當(dāng)中性表面活性劑如吐溫20和粹通X-100以適當(dāng)?shù)臐舛仁褂脮r也可獲得相似的結(jié)果。如圖2所示，樣品1和2分別是通過在各組分聯(lián)合完成之后另外加入過量氫氧化鋁凝膠的方法和在聯(lián)合完成之前預(yù)先加入相同濃度的吸附劑的方法制備的。
優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種聯(lián)合疫苗的制備方法，其中氫氧化鋁凝膠中鋁離子的濃度在0.5～1.25mg/ml的范圍內(nèi)。更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種聯(lián)合疫苗的制備方法，其中包括在吸附到吸附劑上的保護(hù)性抗原聯(lián)合后，在鋁離子的濃度不超過0.5～1.25mg/ml的范圍內(nèi)加入過量吸附劑的步驟。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，可以保持聯(lián)合疫苗中每種組分抗原固有的吸附并提高免疫性。
對于百日咳抗原，韓國和幾個其它國家一般使用純化的百日咳抗原。而一些美洲國家和第三世界國家使用脫毒的全細(xì)胞百日咳抗原。因此，在本發(fā)明中，聯(lián)合疫苗的適用范圍通過對使用全細(xì)胞百日咳抗原的聯(lián)合方法的研究而擴(kuò)展。在這種情況下，使用與提及的純化的百日咳抗原的方法一樣的方法進(jìn)行聯(lián)合，以獲得能保持各組分免疫性的樣品(如表1所示)。
在包括全細(xì)胞百日咳抗原的DTP疫苗的情況中，一般使用磷酸鋁凝膠作為吸附劑。然而，為制備關(guān)于乙型肝炎抗原的聯(lián)合疫苗，DTP疫苗使用氫氧化鋁凝膠制備。在這種情況下，對于百日咳的免疫性下降，但是當(dāng)在各組分聯(lián)合完成之后另外加入過量的氫氧化鋁凝膠時(樣品A)，可以保持理想的免疫性。作為參考，樣品B通過在聯(lián)合完成之前預(yù)先加入相同濃度的吸附劑的方法制備的。
根據(jù)本發(fā)明制備的聯(lián)合疫苗的安全性和效力根據(jù)以下方法驗(yàn)證。首先，在嚙齒動物身上施用過量的聯(lián)合疫苗，作為活組織檢查的結(jié)果沒有觀察到損害(沒有提供該結(jié)果)。另外，在對猴子施用聯(lián)合疫苗的小組(組2)和同時施用DTP和乙型肝炎的每種疫苗的小組(組1)中測量對應(yīng)于抗原的抗體水平。作為兩組間對于抗體數(shù)量的t-試驗(yàn)的結(jié)果，當(dāng)將組2的結(jié)果與組1的結(jié)果比較時，聯(lián)合疫苗比每種疫苗同時注射的試驗(yàn)組顯示出相等或更好的對應(yīng)于抗原的免疫原性(如圖3所示，沒有提供統(tǒng)計學(xué)結(jié)果)。
總之，本發(fā)明中發(fā)展了聯(lián)合方法，該方法將不同免疫組分間的相互作用減至最小，而沒有減少各種致免疫的效果。當(dāng)基于物理和化學(xué)特性對用于聯(lián)合疫苗的各種免疫組分分類時，致免疫組分可分為蛋白抗原(白喉抗原、破傷風(fēng)抗原、純化的百日咳抗原)，由蛋白和磷脂層組成的抗原(乙型肝炎抗原)，和由滅活的全細(xì)胞組成的抗原(全細(xì)胞百日咳抗原)等等。因此，可以預(yù)測基于組分的物理和化學(xué)特性，可實(shí)現(xiàn)與其它單一疫苗的抗原的聯(lián)合。對于疾病(嗜血桿菌流感、脊髓灰質(zhì)炎)來說另外的疫苗的聯(lián)合是可能的，這些疾病應(yīng)該通過根據(jù)本發(fā)明制備的聯(lián)合疫苗在嬰兒中預(yù)防。
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗試劑的人體疫苗接種時期可以在DTP疫苗或乙型肝炎疫苗接種時期之前。對于母體內(nèi)存在乙型肝炎抗原的情況，優(yōu)選在第二、四和六月接種三次。對于母體內(nèi)不存在乙型肝炎抗原的情況，作為適當(dāng)?shù)囊呙缃臃N時期，乙型肝炎疫苗在出生后單獨(dú)接種，然后用聯(lián)合疫苗進(jìn)行加強(qiáng)接種。對于嬰兒適合的疫苗接種能通過肌肉或皮下注射的方法進(jìn)行。本發(fā)明的聯(lián)合疫苗中白喉、破傷風(fēng)、百日咳和乙型肝炎抗原的劑量分別與用于嬰兒的各單一疫苗抗原的劑量相同。
實(shí)施例1乙型肝炎抗原的制備集約培養(yǎng)通過遺傳工程方法可以表達(dá)乙型肝炎表面抗原的酵母細(xì)胞。通過離心獲得的1kg酵母細(xì)胞沉淀以1∶2的比例稀釋到緩沖液中(0.5M氯化鈉，10mM EDTA，0.01％硫柳汞，0.1M磷酸鹽，pH7.0)。稀釋的溶液流過玻璃珠攪拌器(或Dynomil)破碎細(xì)胞壁等。獲得的溶液加入0.5％的中性表面活性劑(吐溫類或粹通類)，4C攪拌混合均勻。得到的溶液中加入氫氧化鈉至pH11，然后在4℃攪拌混合5小時。得到的溶液中加入稀釋的鹽酸至pH4。使用離心機(jī)(ROTORJA-14，Beckman Inc.美國)在6000rpm離心15分鐘，除去沉淀，獲得含有乙型肝炎表面抗原的上部溶液。上部溶液的pH調(diào)至7，然后在其中加入硅石并在4～25℃混合3～16小時，由此將乙型肝炎表面抗原吸附到硅石上。本發(fā)明中優(yōu)選使用的硅膠是含有精細(xì)水合硅石或無水硅石的有效表面積為100～500mm2/g的氣硅膠380(Degussa，美國)。為除去吸附上乙型肝炎表面抗原的硅石中的雜質(zhì)，將得到的溶液用pH7的磷酸鈉-氯化鈉緩沖液沖洗兩次。沖洗過的硅石在pH9.6的碳酸鈉緩沖液中接觸大約2小時從而使表面抗原解吸附。這樣分離的表面抗原在溶液中的蛋白純度超過90％。得到的溶液流過用上述鈉鹽緩沖液平衡的DEAE-瓊脂糖凝膠(PHAMACIA，瑞典)從而特異性附著表面抗原并用上述緩沖液除去柱中分離的物質(zhì)。輕微附著在柱上的雜質(zhì)用含有0.05～0.1M氯化鈉的緩沖液洗脫。其后，乙型肝炎表面抗原用含有0.2M氯化鈉的上述緩沖液洗脫。這樣洗脫的溶液用能分離分子量超過100,000的物質(zhì)的超濾膜濃縮，離心分離并除去沉淀，收集上部溶液，對收集的上部溶液進(jìn)行凝膠滲透層析(SepharoseCL-4B，PHAMACIA，瑞典)。含有純化的表面抗原的部分通過電泳驗(yàn)證并用作乙型肝炎抗原。另外，為減少各肝炎表面抗原的相互作用，加入吐溫80至每1毫升0、5、10μg，然后觀察吐溫80的效果(如圖2所示)。
實(shí)施例2白喉類毒素的制備白喉棒狀桿菌PW No.8在營養(yǎng)型瓊脂培養(yǎng)基(DIFCO，美國)中35℃培養(yǎng)24小時，并傳代培養(yǎng)兩次。單菌落于35℃在2毫升腦心浸液培養(yǎng)基(DIFCO，美國)中培養(yǎng)24小時，取1.2毫升接種到300毫升的改良的Mullet培養(yǎng)基中(參照Stainer等，Canadian J.Microbiol.，14155，1968)，并在35℃培養(yǎng)36小時。培養(yǎng)后，從培養(yǎng)液中除去細(xì)胞，收集毒素溶液并在4C加入硫酸銨。制成終濃度為25(w/v)％，pH為8.0的培養(yǎng)液。已經(jīng)調(diào)整pH和鹽濃度的培養(yǎng)液滴入已預(yù)先用含25(w/v)％的硫酸銨、pH8.0的10mM的tris緩沖液平衡的苯基-瓊脂糖凝膠柱中。與柱平衡溶液相同的緩沖液和含有15(w/v)％的硫酸銨的10mM的tris緩沖液(pH8.0)順序流過柱子從而除去雜質(zhì)。毒素用不含鹽的10mM的tris緩沖液(pH8.0)洗脫。收集洗脫下來的白喉毒素溶液并透析到含150mM氯化鈉的10mM磷酸鹽緩沖液中(pH7.4)。在透析過程完成后，加入甲醛液至終濃度為0.05(w/v)％，得到的溶液在37℃反應(yīng)1小時，加入賴氨酸從而獲得0.05M的終濃度，然后得到的溶液在37℃脫毒4周。類毒素溶液透析到含有氯化鈉的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中從而完全除去甲醛液，然后加入硫柳汞使終濃度為0.01(w/v)％。得到的溶液用作白喉類毒素溶液。
實(shí)施例3破傷風(fēng)類毒素的制備破傷風(fēng)梭菌(Harvard菌株)用無菌肝膽瓊脂培養(yǎng)基(DIFCO，美國)通過熔化瓊脂方法培養(yǎng)。從上述培養(yǎng)物中取一些菌落接種到2ml含0.3(w/v)％酵母提取物的低氧的腦心浸液培養(yǎng)基(DIFCO，美國)中，厭氧狀態(tài)35℃培養(yǎng)24小時。然后培養(yǎng)液接種到500ml含0.3(w/v)％酵母提取物的氮飽和的腦心浸液培養(yǎng)基(DIFCO，美國)中，厭氧狀態(tài)35℃培養(yǎng)7天。培養(yǎng)后，從培養(yǎng)液中除去細(xì)胞，收集毒素溶液并在4℃加入硫酸銨，從而獲得60(w/v)％的終濃度，混合至少24小時，充分混合從而通過離心獲得沉淀。這種沉淀溶解在少量蒸餾水中，除去不溶物質(zhì)。得到的溶液滴入已預(yù)先用含0.5M氯化鈉的10mM的tris緩沖液(pH8.0)平衡的Sephagrill S-100柱中。流過相同的緩沖液從而洗脫分離的毒素。收集破傷風(fēng)毒素溶液并透析到含150mM氯化鈉的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中。透析后，加入甲醛液，至終濃度為0.025(w/v)％，在37℃反應(yīng)1小時。其后，加入賴氨酸和碳酸氫鈉至終濃度分別為0.05mM和0.04M，在37℃成熟4周并脫毒。脫毒之后，類毒素溶液透析到含150mM氯化鈉的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中，完全除去甲醛液。加入硫柳汞至終濃度為0.01(w/v)％，然后用作破傷風(fēng)類毒素溶液。
實(shí)施例4純化的百日咳抗原蛋白的制備百日咳博德特氏菌Tohama phase 1在含15％兔血的Bodet-Gengo瓊脂培養(yǎng)基(DIFCO，美國)中35℃培養(yǎng)72小時并傳代兩次。接種一些菌落到50ml的stanor-sholte培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)48小時。這樣培養(yǎng)的溶液重新接種到500ml的更換的stanor-sholte培養(yǎng)基中(參照Imazumi等INFECT.-IMMUN.，1983，卷41，頁1138)，35℃培養(yǎng)36小時。加入10％的硫柳汞水溶液到培養(yǎng)液中，得到0.01％的終濃度從而阻止百日咳細(xì)菌的生長，然后通過離心除去細(xì)胞。將三倍體積的蒸餾水加入得到的溶液中，混合均勻。用1N硫酸將當(dāng)前pH值降至pH6.0。得到的溶液滴入已預(yù)先用pH6.0的10mM的磷酸鈉緩沖液平衡的CM-瓊脂糖凝膠柱中。用與柱平衡溶液相同的緩沖液過柱從而除去不與柱結(jié)合的物質(zhì)，與柱輕微結(jié)合的雜質(zhì)用與柱平衡溶液相同的含有100mM氯化鈉的緩沖液除去。當(dāng)不再有雜質(zhì)從柱上洗脫下來時，結(jié)合物質(zhì)用由含有相同體積的100mM氯化鈉和600mM氯化鈉的柱平衡溶液形成的線性梯度洗脫，因此分離了含有百日咳抗原蛋白如百日咳毒素和FHA(絲狀血細(xì)胞凝集素)的部分。抗原部分用兩倍體積的10mM磷酸鈉緩沖液(pH8.0)稀釋到pH8.0。得到的溶液滴入已預(yù)先用pH8.0的10mM的磷酸鈉緩沖液平衡的羥磷灰石柱中。用與柱平衡溶液相同的含有100mM氯化鈉的緩沖液過柱從而除去不與柱結(jié)合的物質(zhì)。含有100mM氯化鈉pH8.0的80mM的磷酸鈉緩沖液以滴定速率相同的速率過柱，從而分離百日咳毒素部分。當(dāng)分離完百日咳毒素，含有100mM氯化鈉pH8.0的250mM的磷酸鈉緩沖液以滴定速率相同的速率過柱，從而分離FHA(絲狀血細(xì)胞凝集素)部分。分離的百日咳毒素和FHA(絲狀血細(xì)胞凝集素)在含有0.15％氯化鈉的10mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.4)中4℃透析。將甘油和戊二醛(glutal aldehyde)加入到透析過的百日咳毒素樣品溶液中至終濃度為50(w/v)％和0.05(w/v)％，37℃脫毒4小時。加入天冬氨酸鈉至終濃度為0.025M，從而完成脫毒過程。將甘油和甲醛液加入到透析過的FHA(絲狀血細(xì)胞凝集素)樣品溶液中至終濃度為50(w/v)％和0.025(w/v)％，37℃脫毒24小時。加入賴氨酸至終濃度為0.025M，從而完成脫毒過程。各樣品溶液在室溫下透析到含0.15％氯化鈉的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)中。加入硫柳汞至終濃度為0.01(w/v)％。其后，脫毒的百日咳毒素樣品溶液和FHA(絲狀血細(xì)胞凝集素)樣品溶液以1∶4的比率混合，然后用作百日咳抗原蛋白。
實(shí)施例5全細(xì)胞百日咳抗原的制備百日咳細(xì)菌，百日咳博德特氏菌Tohama phase 1在含15％兔血的Bodet-Gengo瓊脂培養(yǎng)基(DIFCO，美國)上35℃培養(yǎng)72小時并傳代兩次。接種一些菌落到50ml的Stanor-sholte培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)48小時。得到的培養(yǎng)液重新接種到500ml更換的stanor-sholte培養(yǎng)基中(參照Imazumi等INFECT.-IMMUN.，1983，卷41，頁1138)，35℃培養(yǎng)36小時。加入10％的硫柳汞水溶液到培養(yǎng)液中得到0.01％的終濃度從而阻止百日咳細(xì)菌的生長并通過離心收集菌體。收集的菌體溶液在含0.15％氯化鈉的10mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.4)中4℃透析。加入甲醛液到已透析的百日咳菌體溶液中至終濃度為0.025(w/v)％，37℃脫毒4周。加入賴氨酸至終濃度為0.025M，從而完成脫毒過程。樣品溶液透析到含0.15％氯化鈉的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.4)中。加入硫柳汞至終濃度為0.01(w/v)％，然后用作全細(xì)胞百日咳抗原。
實(shí)施例6含有純化的百日咳抗原的聯(lián)合疫苗的制備步驟1.乙型肝炎疫苗的制備用實(shí)施例1中制備的乙型肝炎表面抗原制備乙型肝炎疫苗。氫氧化鋁溶液通過將氫氧化鋁凝膠加到磷酸鹽緩沖液中而制得。得到的溶液緩慢混合，滴入上述抗原溶液并在4℃緩慢攪拌15小時從而制備乙型肝炎疫苗。此時，肝炎表面抗原含量是60μg/ml，與一般的乙型肝炎表面抗原含量相比高度濃縮了三倍。第一個樣品中，氫氧化鋁凝膠中鋁離子含量為0.9mg/ml。第二個樣品中，氫氧化鋁凝膠中鋁離子含量為1.5mg/ml(如圖2所示)。
步驟2.DTP聯(lián)合疫苗的制備DTP聯(lián)合疫苗用實(shí)施例2、3、4中制備的各抗原制備。在傳統(tǒng)方法中氫氧化鋁溶液通過將氫氧化鋁凝膠加到磷酸鹽緩沖液中而制備。當(dāng)緩慢混合得到的溶液時，將各抗原溶液滴入其中并緩慢攪拌混合，從而實(shí)現(xiàn)均勻吸附，因此制備了DTP聯(lián)合疫苗。此時，各抗原含量與一般的DTP疫苗的各組分抗原含量相比濃縮了1.5倍。氫氧化鋁凝膠中鋁離子含量為0.3mg/ml。
步驟3.DTP-乙型肝炎聯(lián)合疫苗的制備在步驟1和2中制備的每種DTP疫苗和乙型肝炎疫苗以體積比2∶1的比率緩慢混合。在第一個樣品中，加入過量的氫氧化鋁凝膠，因此氫氧化鋁凝膠中鋁離子含量最終為0.7mg/ml，25℃連續(xù)攪拌混合1小時從而制成一種不與其它組分作用的穩(wěn)定的聯(lián)合疫苗。在第二個樣品中，不加入過量的氫氧化鋁凝膠，25℃連續(xù)攪拌混合1小時從而制成聯(lián)合疫苗。第一個樣品和第二個樣品的聯(lián)合疫苗的氫氧化鋁凝膠中鋁離子的含量為0.7mg/ml。對于抗體效價試驗(yàn)，聯(lián)合疫苗的組分為每毫升20μg乙型肝炎表面抗原、25Lf白喉類毒素、3Lf破傷風(fēng)類毒素、2.5μgPN百日咳類毒素和10μgPN百日咳FHA抗原(百日咳FHA(絲狀血細(xì)胞凝集素)抗原)(如圖2所示)。
實(shí)施例7含有全細(xì)胞百日咳抗原的聯(lián)合疫苗的制備步驟1.乙型肝炎疫苗的制備用實(shí)施例1中制備的乙型肝炎表面抗原制備乙型肝炎疫苗。將氫氧化鋁凝膠加到磷酸鹽緩沖液中從而制成氫氧化鋁溶液。當(dāng)溶液緩慢混合時，滴入上述抗原溶液并在4℃充分混合15小時從而制成乙型肝炎疫苗。此時，乙型肝炎表面抗原含量是60μg/ml，與一般的乙型肝炎表面抗原含量相比濃縮了三倍。第一個樣品中，氫氧化鋁凝膠中鋁離子含量為0.9mg/ml。第二個樣品中，氫氧化鋁凝膠中鋁離子含量為1.5mg/ml(如圖2所示)。
步驟2.DTP聯(lián)合疫苗的制備DTP聯(lián)合疫苗用實(shí)施例2、3和5中制備的各抗原制備。以傳統(tǒng)方法將氫氧化鋁凝膠加到磷酸鹽緩沖液中從而制成氫氧化鋁溶液。當(dāng)緩慢混合得到的溶液時，滴入上述抗原溶液并充分混合。完成均勻吸附從而制成DTP聯(lián)合疫苗。此時，各抗原含量與一般的DTP疫苗的各組分抗原含量相比濃縮了1.5倍。氫氧化鋁凝膠中鋁離子含量為0.3mg/ml。
步驟3.DTP-乙型肝炎聯(lián)合疫苗的制備在步驟1和2中制備的DTP疫苗和乙型肝炎疫苗以體積比2∶1的比率緩慢混合。在第一個樣品中，加入過量的氫氧化鋁凝膠，因此氫氧化鋁凝膠中鋁離子含量最終為0.7mg/ml，得到的溶液在25℃連續(xù)混合1小時從而制成一種不與其它組分作用的穩(wěn)定的聯(lián)合疫苗。在第二個樣品中，不加入過量的氫氧化鋁凝膠，溶液在25℃連續(xù)混合1小時從而制成聯(lián)合疫苗。樣品1和2的聯(lián)合疫苗的氫氧化鋁凝膠中鋁離子的含量是0.7mg/ml。對于抗體效價試驗(yàn)，聯(lián)合疫苗的組分為每毫升20μg乙型肝炎表面抗原、50Lf白喉類毒素、10Lf破傷風(fēng)類毒素、20 OE全細(xì)胞百日咳抗原(如圖2所示)。
實(shí)施例8.聯(lián)合疫苗中抗原性試驗(yàn)實(shí)施例6和7制備的聯(lián)合疫苗中抗原性試驗(yàn)是通過與對應(yīng)于各抗原含量的各抗原標(biāo)準(zhǔn)比較，利用單克隆抗體和多克隆抗體的酶免疫測定法(EIA)進(jìn)行。
另外，通過離心除去吸附到鋁鹽的抗原以檢測各抗原的吸附比率，并用上部溶液檢測分離的抗原的含量。
圖1和2中顯示的各結(jié)果的平均值表明各抗原的相對抗原性。
實(shí)施例9.聯(lián)合疫苗抗體形成試驗(yàn)乙型肝炎表面抗原的抗體形成試驗(yàn)將實(shí)施例6和7中制備的聯(lián)合疫苗和乙型肝炎疫苗接種到ICR小鼠上，其中16只小鼠組成組1，18天后從ICR小鼠收集血液。從血液中分離血清。以IU/ml單位為基礎(chǔ)用EIA(酶免疫測定法)獲得對應(yīng)于乙型肝炎表面抗原的抗體水平并用幾何均數(shù)抗體效價計算。計算聯(lián)合疫苗對于乙型肝炎疫苗的效價。
圖2c和2d顯示聯(lián)合疫苗對于各抗原的相對抗體效價，表1顯示各效價的數(shù)值。
白喉抗原的抗體形成試驗(yàn)將實(shí)施例6和7中制備的聯(lián)合疫苗和DTP疫苗接種到ICR小鼠上，其中16只小鼠組成組1。28天后從ICR小鼠收集血液。從血液中分離血清。以IU/ml單位為基礎(chǔ)用EIA(酶免疫測定法)測量對應(yīng)于血清中百日咳抗原的抗體水平并用幾何均數(shù)抗體效價計算。其后，與DTP疫苗比較，檢測聯(lián)合疫苗的效價。
圖2c和2d顯示聯(lián)合疫苗對于各抗原的相對抗體效價，表1顯示各效價的數(shù)值。
破傷風(fēng)抗原的抗體形成試驗(yàn)將實(shí)施例6和7中制備的聯(lián)合疫苗和DTP疫苗被種到ICR小鼠上，其中16只小鼠組成組1。28天后從ICR小鼠收集血液。從血液中分離血清。以IU/ml的單位為基礎(chǔ)用EIA(酶免疫測定法)測量對應(yīng)于血清中百日咳抗原的抗體水平并用幾何均數(shù)抗體效價計算。其后，與DTP疫苗比較，檢測聯(lián)合疫苗的效價。
圖2c和2d顯示聯(lián)合疫苗對于各抗原的相對抗體效價，表1顯示各效價的數(shù)值。
百日咳抗原的抗體形成試驗(yàn)將實(shí)施例6和7中制備的聯(lián)合疫苗和DTP疫苗接種到ICR小鼠上，其中16只小鼠組成組1。28天后從ICR小鼠收集血液。從血液中分離血清。以IU/ml單位為基礎(chǔ)用EIA(酶免疫測定法)測量對應(yīng)于血清中百日咳抗原的抗體水平并用幾何均數(shù)抗體效價計算。其后，與DTP疫苗比較，檢測聯(lián)合疫苗的效價。
圖2c和2d顯示聯(lián)合疫苗對于各抗原的相對抗體效價，表1顯示各價的數(shù)值。
表1

實(shí)施例10猴的比較性效力試驗(yàn)通過驗(yàn)證在靈長類動物體內(nèi)聯(lián)合疫苗的免疫原性并與傳統(tǒng)的單一疫苗比較來進(jìn)行試驗(yàn)。將實(shí)施例6中制備的聯(lián)合疫苗接種到由相同數(shù)量雄猴和雌猴組成的六只猴子(組2)上，同時將每種組分疫苗接種到由相同數(shù)量雄猴和雌猴組成的六只猴子(組1)上。在第30和60天再次接種與接種到各組的產(chǎn)品同樣的產(chǎn)品。在初次接種日期算起的第1、29、58和86天從各實(shí)驗(yàn)動物身上收集血液，根據(jù)適合于猴血清的ELISA方法檢測抗每種疾病的抗體效價。
圖3顯示抗各組的各抗原的幾何均數(shù)抗體效價。
本發(fā)明涉及一種聯(lián)合疫苗的制備方法，所述聯(lián)合疫苗用于同時預(yù)防應(yīng)該在嬰兒中預(yù)防的如白喉、破傷風(fēng)、百日咳和乙型肝炎等疾病。通過本發(fā)明，可以利用根據(jù)本發(fā)明制備的聯(lián)合疫苗來同時預(yù)防應(yīng)在嬰兒中預(yù)防的如白喉、破傷風(fēng)、百日咳和乙型肝炎等疾病。
由于本發(fā)明以不離開其精神或本質(zhì)特征的多種形式體現(xiàn)出來，因此除非另外指出，應(yīng)理解上述實(shí)施方式并不受前面敘述的任何細(xì)節(jié)的限制，而是如在附加的權(quán)利要求中定義的那樣在其精神和范疇內(nèi)廣泛解釋，因此所有屬于權(quán)利要求中的集合和范圍或這種集合和范圍的等效物的改變和修正都包含于附加的權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1.一種聯(lián)合疫苗的制備方法，該方法包括將針對各種疾病的每種保護(hù)性抗原獨(dú)立地吸附到吸附劑上的吸附步驟；和將上述吸附到吸附劑上的每種保護(hù)性抗原混合的聯(lián)合步驟。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的保護(hù)性抗原是從包括白喉抗原、破傷風(fēng)抗原、百日咳抗原、乙型肝炎抗原或其中的兩種或多種組合中選擇出的抗原。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述吸附劑是氫氧化鋁凝膠。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中在聯(lián)合疫苗制成后所述氫氧化鋁凝膠中的鋁離子濃度在0.5～1.25mg/ml的范圍內(nèi)。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，該方法還包括以下步驟加入所述吸附劑，其中氫氧化鋁凝膠中鋁離子的最終濃度不超過0.5～1.25mg/ml的范圍。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其中基于兒童劑量，作為乙型肝炎抗原的重組的乙型肝炎表面抗原以5～10μg的量聯(lián)合。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，該方法還包括以下步驟加入中性表面活性劑，如吐溫20、吐溫80和粹通X-100。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的乙型肝炎抗原在2～8℃與吸附劑一起攪拌混合3～20小時，并使所述的乙型肝炎抗原成熟和吸附。
9.如權(quán)利要求2所述的方法，其中基于兒童劑量，作為白喉抗原的脫毒白喉類毒素以10～25Lf的量聯(lián)合。
10.如權(quán)利要求2所述的方法，其中基于兒童劑量，作為破傷風(fēng)抗原的脫毒破傷風(fēng)類毒素以1～5Lf的量聯(lián)合。
11.如權(quán)利要求2所述的方法，其中基于兒童劑量，含有純化抗原的百日咳抗原以低于20μgPN的量聯(lián)合；或基于兒童劑量，全細(xì)胞百日咳抗原以低于20 OE的量聯(lián)合。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述純化的百日咳抗原包含百日咳類毒素和百日咳絲狀血細(xì)胞凝集素。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12任一項所述的方法制備的聯(lián)合疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種聯(lián)合疫苗的制備方法，所述聯(lián)合疫苗能同時預(yù)防多種疾病，例如，預(yù)防應(yīng)該在嬰兒中預(yù)防的白喉、破傷風(fēng)、百日咳和乙型肝炎。根據(jù)本發(fā)明，聯(lián)合疫苗的制備方法包括以下步驟將針對各種疾病，如應(yīng)在嬰兒中預(yù)防的白喉、破傷風(fēng)、百日咳和乙型肝炎的每種保護(hù)性抗原獨(dú)立地吸附到氫氧化鋁凝膠吸附劑上；和吸附后使吸附到吸附劑上的各種保護(hù)性抗原聯(lián)合。在本發(fā)明中，可以使用本發(fā)明制備的聯(lián)合疫苗來同時預(yù)防多種疾病，例如，預(yù)防應(yīng)該在嬰兒中預(yù)防的白喉、破傷風(fēng)、百日咳和乙型肝炎。
文檔編號A61K39/29GK1484531SQ02803593
公開日2004年3月24日 申請日期2002年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月10日
發(fā)明者金奎完, 池希定, 李閏京, 金浣奎, 李喜九, 金元謙 申請人:Lg生命科學(xué)株式會社