麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗的制作方法
【專利說明】
[00011 本申請是中國專利申請CN201080024777.1的分案申請，原申請是國際申請?zhí)朠CT/ IN2010/000287于2011年12月5日進入中國國家階段的申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及含有不同的減毒重組麻疹-瘧疾載體的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，所述載體 包含編碼幾種惡性皰原蟲(Plasmodium falciparum)抗原的異源核酸。優(yōu)選地，其涉及包含 核酸的病毒載體，所述核酸編碼惡性皰原蟲的環(huán)子孢子(circumsporozoite，CS)蛋白、惡性 皰原蟲的裂殖子表面蛋白l(merozoite surface protein 1，MSP-1)及其糖基化和分泌形 式的衍生物（P-42; p-83-30-38)和錨定或分泌形式的惡性瘧原蟲的頂膜抗原1 (apical membrane antigen 1，AMA1)。所述病毒載體源自減毒麻疹病毒，其基于用作疫苗并且有效 地遞送目的基因還有效地結(jié)合并感染相關(guān)免疫細胞的毒株。在一個優(yōu)選的實施方案中，CS、 MSP1和AMA1蛋白從病毒中產(chǎn)生，從而使它們在哺乳動物(優(yōu)選人）中引發(fā)強免疫應(yīng)答;所述 蛋白的表達因為人密碼子優(yōu)化而升高。另外，本發(fā)明涉及所述重組疫苗在瘧疾的預(yù)防性治 療中的用途。
【背景技術(shù)】
[0003] 麻疹病毒
[0004] 本發(fā)明涉及含有重組減毒麻疹病毒(表達惡性瘧原蟲(Pf)的抗原）的疫苗及其用 于制備重組的麻疹-瘧疾疫苗的用途，所疫苗賦予針對麻疹和瘧疾抗原兩者的免疫力。 [0005] 麻疼病毒(MV)是單分子負鏈RNA病毒目（Mononegavirales)的成員，即具有非區(qū)段 負鏈RNA基因組的病毒。MV的非區(qū)段基因組具有反信使極性(antimessage polarity);因 此，所述基因組RNA不在體內(nèi)或體外翻譯。另外，只有在當其以核糖核蛋白 (ribonucleoprotein，RNP)復(fù)合物(見下文）的形式非常特異地與三種病毒蛋白相結(jié)合時才 有生物學活性。非區(qū)段(_)鏈RNA病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制及其病毒顆粒的組裝已被詳細地綜述 (1)。麻疹病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制不涉及所感染細胞的核，而是發(fā)生在所感染細胞的胞質(zhì)中。麻 疹病毒基因組包含編碼來自六個基因（命名為1?1、？、!1和1^的六個主要結(jié)構(gòu)蛋白以及來 自P基因的另外兩個非結(jié)構(gòu)蛋白C和V(涉及對抗基本免疫應(yīng)答和轉(zhuǎn)錄/復(fù)制的調(diào)節(jié))的基因。 基因順序是314(包括C和V)、M、F、H和L5'。此外，從末端區(qū)轉(zhuǎn)大約50個核苷酸的短前導 RNA。所述基因分別編碼病毒的核殼體(ribonucleocapsid，RNP)蛋白，即核蛋白（N)、磷蛋白 (P)和大聚合酶/復(fù)制酶蛋白（L)，它們非常緊密地與基因組RNA結(jié)合，形成RNP。編碼病毒衣 殼蛋白的其他基因包括血凝素(H)、融合蛋白（F)和基質(zhì)蛋白（MhMV基因的轉(zhuǎn)錄遵循遞減的 梯度：當聚合酶在基因組模板上操作時，與從下游基因相比其從上游基因合成更多的RNA。 在該不連續(xù)的轉(zhuǎn)錄模式下，mRNA被加帽和聚腺苷化。相反，在復(fù)制模式中，L蛋白產(chǎn)生全長的 反基因組和基因組RNA，其立即被N、P和L蛋白覆蓋以形成感染性子代RNP。
[0006] 麻疼病毒已于1954年分離:Enders和Peebles用David Edmoston(感染麻疼的兒 童）的血接種原代人腎細胞，且所得的MV Edmoston毒株(2)隨后適于在多種細胞系中生長。 對雞胚、雞胚成纖維細胞(chick embryo fibroblast，CEF)和/或犬腎細胞和人二倍體細胞 的適應(yīng)產(chǎn)生了減毒的Edmonston A和B(3)、Zagreb(EZ)和AIK-C種。1963年，Edmonston B被 批準為第一個MV疫苗。Edmonston A和B在CEF中進一步傳代產(chǎn)生了更為減毒的Schwarz和 Moraten病毒(3)，最近證明它們的序列相同（4,5)。因為Edmonston B疫苗是反應(yīng)原性的，其 于1975年被放棄，并被Schwarz/Moraten疫苗所替代。也使用幾種其他疫苗毒株：日本的 AIK-C、Schwarz F88、CAM70、TD97，俄羅斯的Leningrad-16,還有Edmonston Zagreb<XAM70 和TD97中國毒株并不是來自Edmonston。Schwarz/Moraten和AIK-C疫苗是在CEF中生產(chǎn)的。 Zagreb疫苗是在人二倍體細胞(WI-38)中生產(chǎn)的。如今，通常使用Schwarz/Moraten、AIK_C 和EZ疫苗(6)，但原則上說，這些減毒疫苗毒株的任何一種都是同一種被證明安全并且誘導 長期的免疫應(yīng)答的獨特MV血清型，它們可用于本發(fā)明的目的。
[0007] 單次或兩次低劑量注射之后，MV疫苗誘導終生免疫力。針對麻疹的保護通過抗體 以及⑶4和⑶8T細胞介導。已證明接種后MV特異性抗體和⑶8細胞維持長達25年(7)。
[0008] 在大多數(shù)國家，MV疫苗易于大規(guī)模生產(chǎn)，并可低成本地分發(fā)。因為MV基因組的減毒 來自多種突變的優(yōu)勢組合，所以該疫苗非常穩(wěn)定并且從未觀察到致病性的恢復(fù)(6)。
[0009] 對于安全性，MV僅在細胞質(zhì)中復(fù)制，排除了整合進入宿主DNA的可能性。這些特性 使得活減毒MV疫苗成為用作多價接種載體的有吸引力候選。這樣的疫苗可被證明針對其他 病原物質(zhì)與針對載體病毒本身一樣有效引發(fā)長期免疫保護。
[0010] Martin Billeter及同事克隆了對應(yīng)于Edmonston MV的反基因組的cDNA，并建立 了獨創(chuàng)和高效的反向遺傳學方法來拯救所述病毒（8)，如國際專利申請W0 97/06270中所 述。從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并表達MV的N和P蛋白以及噬菌體T7RNA聚合酶的輔助細胞系293-3-46中回 收重組麻疹病毒。為了拯救任何變體或重組MV，隨后用編碼L蛋白的表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染輔助 細胞系，且最重要的是與任何反基因組質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染，該反基因組質(zhì)粒被適合地構(gòu)建以獲 得適于產(chǎn)生子代MV的任何突變的或重組的反基因組RNA。所述瞬時轉(zhuǎn)染的步驟首先引起轉(zhuǎn) 錄，優(yōu)選通過所具有的T7RNA聚合酶引起。所產(chǎn)生的反基因組RNA立即（在新生狀態(tài)中）被病 毒N、P和L蛋白覆蓋，以獲得反基因組RNP，從中生產(chǎn)基因組RNP。隨后，基因組RNP由所附的L 所轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生全部病毒mRNA及其相應(yīng)的蛋白質(zhì)。最后，通過復(fù)制擴增基因組和反基因組RNP。 [0011]在對本方法稍加變化的方法中，不使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的293-3-46輔助細胞，而是瞬時 轉(zhuǎn)染市售的293T細胞，同時使用原專利說明中詳述的全部5種質(zhì)粒，它們編碼N、P和T7聚合 酶（以前用于產(chǎn)生輔助細胞系），以及編碼L的質(zhì)粒和反基因組質(zhì)粒。注意在"完全瞬時轉(zhuǎn)染" 方法中，還可以使用變體表達質(zhì)粒并且為避免共同使用T7RNA聚合酶，而是使用已具有的 RNA聚合酶II來表達L蛋白和反基因組(9)。
[0012] 為拯救單個的重組MV，所使用的反基因組質(zhì)粒包含編碼麻疹病毒全長反基因組 ( + )RNA的cDNA，結(jié)合編碼異源目的抗原的核酸序列(異源核苷酸序列），以MV-特異性轉(zhuǎn)錄起 始和終止序列為側(cè)翼，從而形成額外的轉(zhuǎn)錄單位(ATU)。該MV Edmonston毒株載體已由最初 的MV拯救發(fā)明者開發(fā)用于外源基因的表達（10)，并已證明其大的插入容量（多達5kb)和表 達轉(zhuǎn)基因（例如乙型肝炎病毒表面抗原、猿或人免疫缺陷病毒(SIV或HIV)、腮腺炎病毒和人 IL-12)的高穩(wěn)定性（11 ;12)。特別地，早期就已產(chǎn)生單獨或聯(lián)合表達乙型肝炎病毒表面和核 心抗原的重組麻疹病毒，并被證明在遺傳修飾的小鼠中誘導體液免疫應(yīng)答。
[0013] 通過對麻疹病毒的特性的發(fā)現(xiàn)，尤其是其在體內(nèi)引發(fā)高滴度的中和抗體的能力和 其作為長期細胞免疫應(yīng)答的強誘導劑的特性，本發(fā)明人提出它可能是生產(chǎn)表達來自惡性瘧 原蟲抗原的重組病毒以誘導針對所述瘧原蟲的中和抗體的良好候選物，其優(yōu)選可適合在動 物中并且更優(yōu)選在人中實現(xiàn)至少一定程度的保護。
[0014] 特別地，本發(fā)明已經(jīng)選擇MV毒株并且尤其是所疫苗毒株在已暴露的嬰兒群體（因 為他們沒有MV免疫性）中作為誘導針對麻疹和惡性瘧原蟲(其組分表達在設(shè)計的重組MV中） 的免疫力候選載體。
[0015] 然而成人人群甚至已被MV免疫的個體也可從MV重組免疫中獲益，因為再施用本發(fā) 明的重組形式MV病毒引起抗-MV抗體的加強（13)。
[0016] 本發(fā)明尤其涉及具有來自惡性瘧原蟲之異源基因的重組麻疹病毒的制備。
[0017] 本發(fā)明的重組麻疹病毒的有利免疫特性可在動物模型中顯示，所述動物模型選自 對麻疹病毒易感的動物，并且在其中測定針對異源抗原和/或針對麻疹病毒的體液和/或細 胞免疫應(yīng)答。在適合用作表征免疫應(yīng)答的模型的那些動物中，技術(shù)人員尤其可使用表達 ⑶46(MV的一種特異性受體)的轉(zhuǎn)基因小鼠。可隨后在猴中測試最有希望的重組體。
[0018] 重組麻疹病毒的核苷酸序列必須包含總數(shù)為6的倍數(shù)的核苷酸。遵從這一"六規(guī)則 (rule of six)"是必要要求，不僅適用于MV，也適用于屬于副粘病毒亞科的所有病毒。顯 然，N蛋白分子(每個接觸六個核苷酸）必須從5'至3'末端精確地覆蓋基因組的和反基因組 RNA，。
[0019] 值得注意的是，ATU可在反基因組cDNA的不同位置。因此，利用上述MV mRNA的天然 表達梯度，插入的ATU的表達水平可被改變?yōu)檫m合的水平。ATU優(yōu)選的位置為L-基因的上游、 Μ基因的上游和N基因的上游，它們分別導致異源蛋白的低、中和強表達。
[0020] 瘧原蟲
[0021 ]瘧疾目前是世界上最普遍的感染性疾病之一，尤其是在熱帶和亞熱帶地區(qū)。在世 界范圍內(nèi)，瘧疾感染每年導致數(shù)億個體的嚴重疾病，殺死1至3百萬人，主要是發(fā)展中國家和 新興國家的嬰兒。瘧疾的廣泛發(fā)生和升高的發(fā)生率的原因是廣泛禁用DDT和耐藥寄生蟲以 及耐殺蟲劑寄生蟲載體數(shù)目的增加。其他因素包括環(huán)境和氣候改變、社會動亂和增加的人 口流動性。
[0022] 瘧疾由蚊子傳播的血液原生動物寄生蟲引起，該寄生蟲屬于頂復(fù)合器門 (Apicomplexa)皰原蟲屬（Plasmodium)。皰原蟲屬中的四個種感染人：三日皰原蟲 (卩.11^131436)引起三日癥(]\^131^3 91^1^3113);間日癥原蟲（？.￥；^3叉）和卵形癥原蟲 (P.ovale)，二者都引起間日癥(Malaria tertiana);和惡性癥原蟲(P.falciparum)，其為 熱帶皰(Malaria tropica)的病原體并且是幾乎全部致命感染的原因。很多其他種在動物 中引起疾病，例如小鼠中的約氏瘧原蟲(P.yoelii)和伯氏瘧原蟲(P.berghei)。
[0023] 瘧原蟲具有由幾階段組成的生活周期。每個階段能誘導針對相應(yīng)發(fā)生階段特異性 抗原的特異性免疫應(yīng)答。皰原蟲通過幾種雌性皰蚊(Anopheles mosquitoe)傳播至人。感染 的蚊子將"子孢子(sporozoite)"形式的瘧原蟲注入哺乳動物血流。侵入肝細胞之前子孢子 在循環(huán)中存留幾分鐘。在這個階段，寄生蟲位于細胞外環(huán)境中并且暴露于抗體的攻擊，該攻 擊主要針對子孢子表面的主要組分"環(huán)子孢子"（CS)蛋白。一旦進入肝中，寄生蟲復(fù)制并發(fā) 育成所謂的"裂殖體(schizont)"。這些裂殖體的存在比率為每個感染細胞多至20,000。在 寄生蟲的該細胞內(nèi)階段，宿主免疫應(yīng)答中主要起作用的是T-淋巴細胞，尤其是CD8+T-淋巴 細胞。在約一周的肝感染后，數(shù)千個所謂"裂殖子"被釋放進入血流。頂膜抗原1(AMA1)和裂 殖子表面蛋白1 (MSP1)都存在于感染的肝細胞產(chǎn)生的裂殖子上:它們是負責侵入紅細胞的 無性血液階段裂殖體的基本組分。一旦進入紅細胞，它們成為抗體介導的免疫應(yīng)答和T-細 胞分泌的細胞因子的靶標。侵入紅細胞后，裂殖體進行幾個階段的復(fù)制，產(chǎn)生所謂的"營養(yǎng) 體"和裂殖體與裂殖子，它們可感染新的紅細胞。有限量的營養(yǎng)體可演變成為構(gòu)成寄生蟲有 性階段的"配子體"。當易感的蚊子消化紅細胞時，配子體從紅細胞中釋放，產(chǎn)生幾個雄性配 子體和一個雌性配子體。這些配子受精導致合子形成并隨后轉(zhuǎn)化成為動合子，之后成為卵 囊，并最終成為唾液腺子孢子。針對配子體階段的特異性表面抗原的靶向抗體可在蚊子的 中腸 (mid gut)中阻斷該周期。這樣的抗體不會保護哺乳動物宿主，但會通過降低感染的蚊 子及其寄生蟲負荷的數(shù)目來降低瘧疾的傳播。
[0024] MSP-1以190-200kDa (d-190)前體合成，其在裂殖過程中被蛋白水解加工成為83、 30、38和42kDa(d-42)的片段（14)。在侵入紅細胞時，42kDa被進一步地切割產(chǎn)生從復(fù)合物剩 余部分脫落的33kDa片段和含有兩個表皮生長因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)域的19kDa片段，其在侵入 過程中與裂殖子膜保持連接。該繼發(fā)切割是成功侵入紅細胞的先決條件(15)。
[0025] MSP-1基本上是雙態(tài)蛋白，在以KI和MAD20原型為特征的雙態(tài)等位基因中表現(xiàn)出高 保守性。
[0026] AMA-1(16)是結(jié)構(gòu)上保守的I型膜內(nèi)在蛋白質(zhì)，在惡性瘧原蟲中其包含622aa(Pf/ AMA-1)，組成為胞質(zhì)區(qū)（50aa)、跨膜區(qū)和胞外結(jié)構(gòu)域，其折疊為N-末端前序列（pro-sequence)和三個結(jié)構(gòu)域(01、011、0111)。所述蛋白的表達在裂殖后期最多：蛋白水解加工 AMA-1的前體(83kDa)以切去前序列，將所述蛋白轉(zhuǎn)化成為66kDa的形式，這允許裂殖子的重 新定位?？贵w主要識別DI和DII，并且似乎與幾個等位基因變體有同樣好的反應(yīng)性。對Dili 應(yīng)答的抗體一般較低，在成人中水平增加(17，18)。
[0027] PfAMA-Ι含有64個多態(tài)性位置(所述前序列中9個，胞外結(jié)構(gòu)域中52個，胞質(zhì)區(qū)3 個），其中多數(shù)是雙態(tài)的，它們是宿主免疫應(yīng)答的重要表位。為開發(fā)基于PfAMA-Ι的疫苗，覆 蓋多態(tài)性應(yīng)是重要的：多樣性覆蓋(Diversity Covering) (DiCol、2和3)PfAMA-l是人工序 列，它以可能的最大程度代表PfAMAl胞外結(jié)構(gòu)域的天然多態(tài)性。已證明它們誘導針對多種 攜帶不同PfAMAl等位基因的寄生蟲有功能的免疫應(yīng)答。該方式可提供這樣的手段，通過它 可產(chǎn)生靶向PfAMAl的疫苗，從而可誘導針對大范圍的天然PfAMAl等位基因的強且具有功能 性的保護（19)。
[0028] CS蛋白（CSP)具有約420個aa和58kDa的分子量。它是子孢子的主要表面蛋白：對于 從卵囊成熟為子孢子和侵入肝細胞（由帶正電荷的氨基酸的保守基序介導)來說，其功能是 必不可少的。CSP的組成為5'和3'末端的兩個非重復(fù)區(qū)和由多個重復(fù)的4殘基長的基序組成 的可變物種特異性中央?yún)^(qū)，其是CSP中的主要表位。因為CSP至少在裂殖前3天還可以檢測 到，所以無論是抗體介導的針對細胞外子孢子的免疫應(yīng)答還是細胞介導的針對裂殖體的免 疫應(yīng)答，它都被認為是吸引人的疫苗靶點(20)。
[0029] 目前，開發(fā)瘧疾疫苗的途徑可根據(jù)上文所述的寄生蟲可存在的不同階段來分類。
[0030] 疫苗可以分為三種可能類型：i)紅細胞前疫苗，其針對子孢子和/或裂殖體感染的 細胞。這些類型疫苗主要基于CS，并應(yīng)當理想地賦予由體液和細胞免疫應(yīng)答介導的無蟲免 疫，阻止瘧疾感染;ii)無性血液期疫苗，其針對裂殖子感染的細胞:MSP1和AMA1是主要的瘧 疾疫苗候選物，設(shè)計用于將臨床嚴重程度最小化。這些疫苗應(yīng)降低發(fā)病率和死亡率，并旨在 阻止寄生蟲進入紅細胞和/或在其中發(fā)育；iii)傳播阻斷疫苗，其設(shè)計用于阻止寄生蟲在蚊 子宿主中的生長。這類疫苗應(yīng)當有利于降低大量人群的瘧疾感染率。除了這些疫苗，正在研 究所謂的多組分和/或多階段疫苗以來尋求開發(fā)靶向寄生蟲生命周期的多個階段的瘧疾疫 苗的可行性。
[0031]目前的全球瘧疾疫苗形勢看起來很有希望，有47個新的疫苗候選物，31個在臨床 前開發(fā)，在臨床試驗中縮小至16個。這些中的一個，GSK Biologicals和PATH-MVI開發(fā)的 RTS，S疫苗應(yīng)當在2008年進入最終的III期臨床試驗(21)。其他令人感興趣的疫苗候選物是 基于使用活重組病毒作為載體，例如國際專利申請US2006127413中描述的Modified Vaccinia Ankara(MVA)、痘病毒（US6214353、AU7060294、AU1668197、W09428930和 US5756101)、腺病毒（US2007071726、US2005265974、US2007088156 和 CA2507915)、冷適應(yīng)減 毒流感病毒或基于酵母（例如畢赤酵母(Pichia pastoris)和酵母屬（Saccharomyces spp ·))或基于細菌（例如沙門氏菌屬（Salmonella spp ·) (US5112749)和大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)(EB0 191748))表達系統(tǒng)的疫苗(22)。
[0032]盡管針對瘧疾的疫苗開發(fā)在30多年前就已開始，但是當前還沒有上市的針對瘧疾 的疫苗。很多因素使得瘧疾疫苗的開發(fā)困難并具有挑戰(zhàn)。首先，該寄生蟲的大小和遺傳復(fù)雜 性意味著每次感染向人免疫系統(tǒng)呈現(xiàn)數(shù)千種抗原。理解其中哪些可成為疫苗開發(fā)的有用靶 標是復(fù)雜的，到現(xiàn)在為止，已經(jīng)鑒定出了至少40個不同的有希望的抗原。第二，該寄生蟲經(jīng) 過幾個生命階段的改變，甚至在人宿主中也是如此，在生命周期的每個階段，其向免疫系統(tǒng)