呈現(xiàn)不同的分子組。第三，該寄生蟲(chóng)已經(jīng)進(jìn)化出了一系列措施以迷惑、隱藏于和誤導(dǎo)人免疫 系統(tǒng)。最后，可能同時(shí)有不僅物種不同并且毒株不同的多重瘧疾感染。
[0033] 因此，通過(guò)提供包含不同減毒重組麻疹-瘧疾載體(包含編碼幾種惡性瘧原蟲(chóng)抗原 的異源核酸)的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，本發(fā)明完成了現(xiàn)有技術(shù)長(zhǎng)久以來(lái)的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0034] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中提供了包含表達(dá)瘧疾抗原之重組麻疹疫苗病毒的麻疹-瘧疾聯(lián)合疫苗，其能引發(fā)針對(duì)麻疹和瘧疾兩者的免疫應(yīng)答和保護(hù)的。
[0035] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有表達(dá)MSP1瘧疾抗原的核苷酸序列的重組麻疹 疫苗病毒。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組麻疹疫苗病毒具有核苷酸序列，其表達(dá)來(lái)自3D7 毒株和FCB1毒株的錨定和分泌兩種形式的瘧疾抗原dl90或d83-30-38或d42。
[0036] 在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有表達(dá)多樣性覆蓋（DiCo, Diversity C〇Vering)AMAl瘧疾抗原的核苷酸序列的重組麻疹疫苗病毒。
[0037] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有表達(dá)CS瘧疾抗原的核苷酸序列的重組麻疹疫 苗病毒。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1 :麻疹病毒的反基因組DNA p( + )MV-EZ的示意圖。p( + )MV-EZ是衍生自 pBluescript的含有麻疹病毒(Edmoston Zagreb)完整序列的質(zhì)粒，其在T7RNA聚合酶啟動(dòng) 子(T7)的控制下，在位置1(麻疹病毒N基因之前）、2(麻疹病毒的P和Μ基因之間）和3(麻疹病 毒的Η和L基因之間）分別含有三個(gè)ATU，并由肝炎δ核酶和T7RNA聚合酶終止子(δΤ7〇精確地 終止。該質(zhì)粒的大小為18941 bp。
[0039] 圖2:來(lái)自3D7毒株的MSP-1合成基因（d-190)的示意圖。顯示了d-190基因片段(d-83-30-38和d-42)側(cè)翼區(qū)的編碼核苷酸和相應(yīng)的氨基酸。以彩色表示為克隆程序而添加的 獨(dú)特限制性位點(diǎn);SP:信號(hào)肽;GPI:編碼的糖基磷脂酰肌醇序列，其用于膜錨定區(qū)。
[0040] 圖3:來(lái)自FCB1毒株的MSP-1合成基因（d-190)的示意圖。顯示了d-190基因片段(d-83-30-38和d-42)側(cè)翼區(qū)的編碼核苷酸和相應(yīng)的氨基酸。以彩色表示為克隆程序而添加的 獨(dú)特限制性位點(diǎn)；SP:信號(hào)肽;GPI:編碼的糖基磷脂酰肌醇序列，其用于膜錨定區(qū)。SP和GPI 區(qū)來(lái)自3D7毒株。
[0041 ] 圖4:重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒p( + )MV2-EZ-dl90-3D7的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有d-190瘧疾基因（3D7毒株）的p( + )MV-EZ，該基因?yàn)?253bp，編碼GPI錨定形式的蛋白，通過(guò) SgrAI-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置2。該重組質(zhì)粒的大小是24323bp。
[0042] 圖5:重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒p( + )MV2-EZ-dl90*-3D7的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有d-190*瘧疾基因（3D7毒株）的p( + )MV-EZ，該基因?yàn)?160bp，編碼分泌形式的蛋白，通過(guò) SgrAI-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置2該重組質(zhì)粒的大小是24227bp。
[0043] 圖6:重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒 p( + )MV3-EZ-dl90-3D7 或 p( + )MV3-EZ-dl90*-3D7 的示意 圖。該質(zhì)粒衍生自含有d-190瘧疾基因（3D7毒株）（5253bp，編碼GPI錨定形式的蛋白）或d-190 *瘧疾基因（3D7毒株）（5160bp，編碼分泌形式的蛋白）的p( + )MV-EZ，所述基因通過(guò) SgrAI-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置3。重組質(zhì)粒p( + )MV3-EZ-dl90為24323bp，p( + ) MV3-EZ-dl90 * 為24227bp。
[0044] 圖7:重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒p ( + )MV2-EZ-d83-30-8-3D7的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有 d-83-30-38瘧疾基因（3D7毒株）的p( + )MV-EZ，該基因?yàn)?122bp，編碼GPI錨定形式的蛋白， 通過(guò)SgrAI-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置2。該重組質(zhì)粒的大小是23195bp。
[0045] 圖8:重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒p( + )MV2-EZ-d83-30-38*-3D7的示意圖。該質(zhì)粒衍生自 含有d-83-30-38*瘧疾基因（3D7毒株）的p( + )MV-EZ，該基因?yàn)?029bp，編碼分泌形式的蛋 白，通過(guò)SgrAI-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置2。該重組質(zhì)粒的大小是23105bp。
[0046] 圖9:重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒 p( + )MV3-EZ-d83-30-38-3D7 或 p( + )MV3-EZ-d83-30-38*-3D7的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有d-83-30-38瘧疾基因（3D7毒株）（4122bp，編碼GPI錨定形 式的蛋白）或d-83-30-38 *瘧疾基因（3D7毒株）（4029bp，編碼分泌形式的蛋白）的p( + )MV-EZ，所述基因通過(guò)SgrAI-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置3。重組質(zhì)粒p( + )MV3-EZ-d83-30-38為23195bp，p( + )MV3-EZ-d83-30-38* 為23105bp。
[0047] 圖10:重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒p( + )MV2-EZ-d42-3D7的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有d-42 瘧疾基因（3D7毒株）的p( + )MV-EZ，該基因?yàn)?347bp，編碼GPI錨定形式的蛋白，通過(guò)SgrAI-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置2。該重組質(zhì)粒的大小是20417bp。
[0048] 圖11:重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒p( + )MV2-EZ-d42 * -3D7的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有d-42*瘧疾基因（3D7毒株）的p( + )MV-EZ，該基因?yàn)?254bp，編碼分泌形式的蛋白，通過(guò)SgrAI-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置2。該重組質(zhì)粒的大小是20345bp。
[0049] 圖 12:重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒 p( + )MV3-EZ-d42-3D7 或 p( + )MV3-EZ-d42*-3D7 的示意 圖。該質(zhì)粒衍生自含有d-42瘧疾基因（3D7毒株）（1347bp，編碼GPI錨定形式的蛋白）或d- 42 *瘧疾基因（3D7毒株）（1254bp，編碼分泌形式的蛋白）的p( + )MV-EZ，通過(guò)SgrAI-BssHII 消化克隆于麻疹基因組的位置3。重組質(zhì)粒p( + )MV3-EZ-d42為20417bp，p( + )MV3-EZ-d42*為 20345bp〇
[0050] 圖13:重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒p( + )MV2-EZ-dl90-FCBl的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有d-190瘧疾基因（FCB1毒株）的p( + )MV-EZ，該基因?yàn)?013bp，編碼GPI錨定形式的蛋白，通過(guò) SgrAI-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置2。該重組質(zhì)粒的大小是24083bp。
[0051 ] 圖14:重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒p( + )MV3-EZ-dl90-FCBl的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有d-190瘧疾基因（FCB1毒株）的p( + )MV-EZ，該基因?yàn)?013bp，編碼GPI錨定形式的蛋白，通過(guò) SgrAI-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置3。該重組質(zhì)粒p( + )MV3-EZ-dl90為24083bp。
[0052] 圖15:CS合成基因的示意圖。顯示了 CS基因側(cè)翼區(qū)的編碼核苷酸和相應(yīng)的氨基酸。 以彩色表示為克隆程序而添加的獨(dú)特限制性位點(diǎn)。
[0053] 圖16:重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒p( + )MV2-EZ_CS的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有CS基因的p ( + )MV-EZ，該基因?yàn)?119bp，通過(guò)SgrAI-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置2。該重組質(zhì) 粒的大小是20219bp。
[0054] 圖17:重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒p( + )MV3-EZ_CS的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有CS基因的p ( + )MV-EZ，該基因?yàn)?119bp，通過(guò)SgrAI-BssHII消化克隆于麻疹基因組的位置3。該重組質(zhì) 粒的大小是20219bp。
[0055] 圖18:DiC〇-l完整合成基因的示意圖。顯示了 DiCo-1完整基因結(jié)構(gòu)域(胞外(ECT0) 和跨膜-胞內(nèi)（TRANS-CYT0))側(cè)翼區(qū)的編碼核苷酸和相應(yīng)的氨基酸。以彩色表示為克隆程序 添加的獨(dú)特限制性位點(diǎn);SP:人密碼子優(yōu)化的信號(hào)肽。
[0056]圖19:DiC〇-l胞外合成基因的示意圖。顯示了DiCo-Ι胞外基因結(jié)構(gòu)域側(cè)翼區(qū)的編 碼核苷酸和相應(yīng)的氨基酸。以彩色表示為克隆程序而添加的獨(dú)特限制性位點(diǎn)；SP:人密碼子 優(yōu)化的信號(hào)肽。
[0057]圖20:重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒p( + )MV2-EZ_DiCol-完整的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有 DiCol完整基因的p( + )MV-EZ，該基因?yàn)?689bp，編碼跨膜形式的蛋白，通過(guò)SgrAI-BssHII消 化克隆于麻疹基因組的位置2。該重組質(zhì)粒的大小是20753bp。
[0058] 圖21:重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒p( + )MV3-EZ-DiCol-完整的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有 DiCol完整基因的p( + )MV-EZ，該基因?yàn)?689bp，編碼跨膜形式的蛋白，通過(guò)SgrAI-BssHII消 化克隆于麻疹基因組的位置3。該重組質(zhì)粒的大小是20753bp。
[0059] 圖22:重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒p( + )MV2-EZ-DiCol-胞外的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有 DiCol胞外基因的p( + )MV-EZ，該基因?yàn)?458bp，編碼分泌形式的蛋白，通過(guò)SgrAI-BssHII消 化克隆于麻疹基因組的位置2。該重組質(zhì)粒的大小是20525bp。
[0060] 圖23:重組麻疹-瘧疾質(zhì)粒p( + )MV3-EZ-DiCol-胞外的示意圖。該質(zhì)粒衍生自含有 DiCol胞外基因的p( + )MV-EZ，該基因?yàn)?458bp，編碼分泌形式的蛋白，通過(guò)SgrAI-BssHII消 化克隆于麻疹基因組的位置3。該重組質(zhì)粒的大小是20525bp。
[0061 ]圖24:P( + )MV2EZ-GFP的完整核苷酸序列。參照核苷酸位置可如下所述描述序列：
[0062] -592-608 T7 啟動(dòng)子
[0063] -609-17354 MV Edmoston Zagreb反基因組
[0064] -4049-4054 Mlul 限制性位點(diǎn)
[0065] -4060-4067 SgrAI 限制性位點(diǎn)
[0066] -4079-4084 BssHII 限制性位點(diǎn)
[0067] -4085-4801 綠色熒光蛋白（GFP)ORF
[0068] -4805-4810 BssHII 限制性位點(diǎn)
[0069] -4817-4822 Aatll 限制性位點(diǎn)
[0070] -17355-17580 HDV核酶和T7終止子
[0071]圖25:p( + )MV3EZ-GFP的完整核苷酸序列。參照核苷酸位置可如下所述描述序列：
[0072] -592-608 T7 啟動(dòng)子
[0073] -609-17359 MV Edmoston Zagreb反基因組
[0074] -9851-9856 Mlul 限制性位點(diǎn)
[0075] -9862-9869 SgrAI 限制性位點(diǎn)
[0076] -9886-9891 BssHII 限制性位點(diǎn)
[0077] -9892-10608 綠色熒光蛋白（GFP)ORF
[0078] -10612-10617 BssHII限制性位點(diǎn)
[0079] -10624-10629 Aatll限制性位點(diǎn)
[0080] -17360-17585 HDV核酶和T7終止子
[0081 ] 圖26:AN101TE:這是由本發(fā)明人克隆的MSPld-1903D7序列0RF。參照核苷酸位置可 如下所述描述序列：
[0082] -1-3 起始密碼子
[0083] -4-99 d-1903D7 信號(hào)肽
[0084] -100-105 BamHI 限制性位點(diǎn)
[0085] -4014-4020 BstEII 限制性位點(diǎn)
[0086] -5152-5157 Acll 限制性位點(diǎn)
[0087] -5158-5250 GPI序列
[0088] -5251-5253 終止密碼子
[0089] 圖27:AN102TE:這是由本發(fā)明人克隆的MSPld-190*3D7序列0RF。參照核苷酸位置 可如下所述描述序列：
[0090] -1-3 起始密碼子
[0091] -4-99 d-190*3D7 信號(hào)肽
[0092] -100-105 BamHI 限制性位點(diǎn)
[0093] -4014-4020 BstEII 限制性位點(diǎn)
[0094] -5152-5157 Acll 限制性位點(diǎn)
[0095] -5158-5160 終止密碼子
[0096] 圖28:AN103TE:這是由本發(fā)明人克隆的MSPld-83-30-383D7序列0RF。參照核苷酸 位置可如下所述描述序列：
[0097] -1-3 起始密碼子
[0098] -4-99 d-83-30-383D7 信號(hào)肽
[0099] -100-105 BamHI 限制性位點(diǎn)
[0100] -4014-4020 BstEII 限制性位點(diǎn)
[0101] -4021-4026 Acll 限制性位點(diǎn)
[0102] -4027-4119 GPI序列
[0103] -4120-4122 終止密碼子
[0104] 圖29:AN104TE:這是由本發(fā)明人克隆的MSPld-83-30-38*3D7序列0RF。參照核苷 酸位置可如下所述描述序列：
[0105] -1-3 起始密碼子
[0106] -4-99 d-83-30-38*3D7 信號(hào)肽
[0107] -100-105 BamHI 限制性位點(diǎn)
[0108] -4014-4020 BstEII 限制性位點(diǎn)
[0109] -4027-4029 終止密碼子
[0110] 圖30:AN105TE:這是由本發(fā)明人克隆的MSPld-423D7序列0RF。參照核苷酸位置可 如下所述描述序列：
[0111] -1-3 起始密碼子
[0112] -4-99 d-423D7 信號(hào)肽
[0113] -100-105 BamHI 限制性位點(diǎn)
[0114] -108-114 BstEII 限制性位點(diǎn)
[0115] -1246-1251 Acll 限制性位點(diǎn)
[0116] -1252-1344 GPI序列
[0117] -1345-1347 終止密碼子
[0118] 圖31:AN106TE:這是由本發(fā)明人克隆的MSPld-42*3D7序列0RF。參照核苷酸位置 可如下所述描述序列：
[0119] -1-3 起始密碼子
[0120] -4-99 d-42*3D7 信號(hào)肽
[0121] -100-105 BamHI 限制性位點(diǎn)
[0122] -108-114 BstEII 限制性位點(diǎn)
[0123] -1246-1251 Acll 限制性位點(diǎn)
[0124] -1252-1254 終止密碼子
[0125] 圖32:AN107TE:這是由本發(fā)明人克隆的MSPld-190FCBl序列0RF。參照核苷酸位置 可如下所述描述序列：
[0126] -1-3 起始密碼子
[0127] -4-99 d-190FCBl 信號(hào)肽
[0128] -100-105 BamHI 限制性位點(diǎn)
[0129] -146-151 Hindlll 限制性位點(diǎn)
[0130] -3825-3831 BstEII 限制性位點(diǎn)
[0131] -4912-4917 Acll 限制性位點(diǎn)
[0132] -4918-5010 GPI序列
[0133] -5011-5013 終止密碼子
[0134] 圖33:AN108TE:這是由本發(fā)明人克隆的CS序列0RF。參照核苷酸位置可如下所述描 述序列：
[0135] -1-3 起始密碼子
[0136] -4-1116 CS 序列
[0137] -1117-1119 終止密碼子
[0138] 圖34:AN109TE:這是由本發(fā)明人克隆的DiCo 1完整序列0RF。參照核苷酸位置可如 下所述描述序列：
[0139] -1-3 起始密碼子
[0140] -4-99 DiCol 完整信號(hào)肽
[0141] -100-105 BamHI 限制性位點(diǎn)
[0142] -106-1686 DiCol 完整序列0RF
[0143] -1687-1689 終止密碼子