抗乙型肝炎病毒的疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫原性HBV肽組合物以及使用該組合物來治療HBV。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型肝炎病毒（HBV)感染是歐洲和全世界的肝臟相關(guān)的發(fā)病率和死亡率的一個(gè) 主因。估計(jì)每年有650000個(gè)個(gè)體死于肝功能衰竭或肝細(xì)胞癌。盡管疫苗接種計(jì)劃已經(jīng)在 許多國家使得HBV感染開始減少，但是由于來自流行地區(qū)的HBV攜帶者的移民，慢性乙型肝 炎（CHB)在歐洲是一個(gè)迅速增長的問題。
[0003] 從概念的觀點(diǎn)來看，慢性HBV感染可分為三個(gè)階段（或免疫應(yīng)答類型）：免疫耐 受、免疫活性和非活性慢性攜帶者。這些不同的慢性感染的階段對(duì)應(yīng)于特性血清學(xué)圖案并 且與患者對(duì)HBV的免疫應(yīng)答相關(guān)。通常，患有持續(xù)免疫活性慢性HBV感染的患者接受HBV 治療。
[0004] 有限的治療方案可用于慢性乙型肝炎（CHB)。利用抗病毒藥物（諸如，a-干擾素 和核苷/核苷酸類似物（NUC))來抑制病毒復(fù)制是降低慢性HBV感染的發(fā)病率和死亡率的 唯一途徑，其終極目標(biāo)是改善生存。然而，血清HBsAg的損失和抗HBs抗體的發(fā)展（血清轉(zhuǎn) 化）是對(duì)HBV感染的成功免疫應(yīng)答的標(biāo)志和臨床治愈的最接近結(jié)果。僅a-干擾素已經(jīng)能 夠誘導(dǎo)顯著的HBsAg損失，但只對(duì)于相對(duì)較低比例（〈10%)的患者是這樣的。干擾素具有 高成本、低耐受性，并且一些HBV基因型仍然很差地應(yīng)答治療。
[0005] 因此，NUC仍然是主要的治療策略，其中在歐洲五個(gè)NUC被批準(zhǔn)治療CHB。最有效 的和優(yōu)選的藥物（替諾福韋和恩替卡韋）具有非常有利的副作用分布并且能夠在幾乎所有 的患者中誘導(dǎo)HBVDNA抑制。然而，在大多數(shù)國家和國際準(zhǔn)則下，對(duì)于大多數(shù)患者需要終生 治療。即使在NUC治療的幾年之后，只有極少數(shù)的HBeAg陽性患者，并且沒有HBeAg陰性患 者，能夠清除HBsAg。NUC治療的長期安全性目前是未知的。因此，迫切需要能夠及時(shí)停止 NUC療法的概念。
[0006] 治療性疫苗接種是對(duì)于乙肝的一種有前途的干預(yù)，以此來誘導(dǎo)對(duì)于疾病的免疫控 制。T細(xì)胞應(yīng)答已被證明對(duì)于急性HBV感染的清除是至關(guān)重要的。然而，即使是在有效的抗 病毒治療下，基于HBsAg的治療性HBV疫苗尚未能示出出益處，這是因?yàn)閬碜愿咚降难h(huán) HBsAg的被誘導(dǎo)的免疫耐受性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明人已經(jīng)識(shí)別出HBV蛋白質(zhì)組的一些區(qū)域，這些區(qū)域在不同的HBV基因型之 間具有高度保守性，并且與HBV蛋白的其它類似保守區(qū)域相比，具有預(yù)料不到的更好的免 疫原性性質(zhì)。特別地，發(fā)明人使用體外測(cè)定出乎意料地表明，HBV聚合酶和HBV核心蛋白的 特定結(jié)構(gòu)域內(nèi)的肽序列能夠在來自感染了不同HBV基因型的慢性感染HBV的患者和/或來 自不同種族的慢性感染HBV患者的PBMC中引發(fā)應(yīng)答。特別地，本發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地識(shí) 別了HBV聚合酶的末端結(jié)構(gòu)域中的免疫顯性區(qū)。
[0008] 因此，本發(fā)明提供了一種包含長度為15至60個(gè)氨基酸的至少兩種肽的藥物組合 物，所述肽選自包括SEQIDNOs. 1-4中所示的序列之一或與SEQIDNOs. 1-4中所示的序列 之一具有至少80%同一性的序列的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸的序列的肽（或者所述肽選自包 括SEQIDNOs. 1-4中所示的序列之一的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸的序列或與SEQIDNOs. 1-4 中所示的序列之一具有至少80%同一性的序列的肽），其中，每個(gè)肽包含至少一個(gè)⑶8+T細(xì) 胞表位和/或至少一個(gè)CD4+T細(xì)胞表位，并且其中，每個(gè)肽在體外測(cè)定中在來自至少一種慢 性感染HBV個(gè)體的外周血單核細(xì)胞（PBMC)中引發(fā)應(yīng)答。
[0009] 所述組合物可以包括包含SEQIDNOs. 1-3中所示的序列之一的至少15個(gè)氨基酸 的至少一個(gè)肽以及包含在SEQIDN0 :4中所示序列的至少15個(gè)氨基酸的至少一個(gè)肽。
[0010] 所述肽中的至少一個(gè)可以包括SEQIDNOs. 24-33之一中所示的序列，或與SEQID NOs. 24-33中所示序列之一具有至少80%同一性的序列。所述肽中的一個(gè)或多個(gè)可以包括 位于N-末端和/或C-末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸以增加凈正電荷和/或減少肽的疏水性。 因此，該組合物可以包括包含SEQIDNOs:34至38之一中所示的序列的肽。
[0011] 該組合物可以進(jìn)一步包含衍生自表面蛋白的至少一個(gè)肽。衍生自HBV表面蛋 白的肽的長度可以是15至60個(gè)氨基酸，并且包括SEQIDN0 :55中所示的序列的至少15個(gè) 連續(xù)氨基酸的序列或與SEQIDN0 :55中所示序列的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少80%同 一性的序列，其中，所述肽包含至少一個(gè)⑶8+T細(xì)胞表位和/或至少一個(gè)⑶4+T細(xì)胞表位， 并且在體外測(cè)定中在來自至少一個(gè)慢性感染HBV的個(gè)體的外周血單核細(xì)胞（PBMC)中引起 應(yīng)答。
[0012] 組合物，其中所述組合物能夠在來自不同種族的至少兩個(gè)個(gè)體以及來自感染有不 同HBV基因型的兩個(gè)個(gè)體的PBMC中引發(fā)免疫應(yīng)答。
[0013] 該組合物能夠在以下中引發(fā)免疫應(yīng)答：(a)在來自感染HBV基因型A的個(gè)體、感染 HBV基因型B的個(gè)體、感染HBV基因型C的個(gè)體、和感染HBV基因型D的個(gè)體中的兩個(gè)、三 個(gè)或全部的PBMC中；和/或在來自感染HBV的東方或印度個(gè)體、感染HBV的高加索人（白 人）個(gè)體、和感染HBV的非洲或阿拉伯個(gè)體中的兩個(gè)、三個(gè)或全部的PBMC中。
[0014] 在本發(fā)明的組合物中的肽可以連接至碳氟化合物載體。該組合物可以進(jìn)一步包括 HBc、HBe或HBs抗原和/或佐劑。
[0015] 本發(fā)明提供了本發(fā)明的用于HBV感染的治療或預(yù)防的組合物，特別是用于HBeAg 陰性患者或HBeAg陽性患者的治療。本發(fā)明的組合物可與以下組合使用：（i)a干擾素和 /或核苷/核苷酸類似物（NUC);和/或（ii)抗PD1阻斷抗體、抗CTLA4阻斷抗體、抗TOIL 阻斷抗體、抗LAG3阻斷抗體、抗TM3阻斷抗體和/或環(huán)磷酰胺。利用該組合物的治療可導(dǎo) 致HBsAg損失或HBsAg血清轉(zhuǎn)換。
[0016] 本發(fā)明還提供了本發(fā)明的用于終末期肝病或肝細(xì)胞癌的治療或預(yù)防或用于丁型 肝炎病毒（HDV)感染的治療或預(yù)防的組合物。
[0017] 一種治療或預(yù)防HBV感染的方法，該方法包括給予需要其的受試者治療有效量的 根據(jù)本發(fā)明的組合物，并且還提供了根據(jù)本發(fā)明的組合物在制備用于治療或預(yù)防HBV的藥 物中的應(yīng)用。
[0018] 此外，本發(fā)明提供了長度為15到60個(gè)氨基酸的肽，包含SEDIDNOs:1-4中任一 個(gè)中所示的序列，或與在SEDIDNOs:1-4中所示序列之一具有至少80%同一性的序列的 至少15個(gè)連續(xù)氨基酸，所述肽包含至少一個(gè)⑶8+T細(xì)胞表位和/或至少一個(gè)⑶4+T細(xì)胞表 位，并且能夠在體外測(cè)定中在來自至少一個(gè)慢性感染HBV的個(gè)體的外周血單核細(xì)胞（PBMC) 中引發(fā)應(yīng)答。該肽可以包含SEDIDNO:5、6、14或15所示的序列的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸。
[0019] 本發(fā)明還提供了包含SEQIDNOs:24至38中所示的序列之一或與SEQIDNOs: 24至38所示的序列之一具有至少80%同一性的序列。
[0020] 本發(fā)明的肽可以被共價(jià)連接至碳氟化合物載體。
【附圖說明】
[0021] 圖1是處于免疫控制階段或正在進(jìn)行積極治療的慢性HBV感染的受試者的IFNY 應(yīng)答的比較。在利用HBV衍生的重疊短肽池庫（0.1yg/肽/mL)進(jìn)行10天培養(yǎng)之后，在 18h的IFNyELISpot(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)）測(cè)定法中，對(duì)PBMC進(jìn)行再刺激（5yg/肽/毫升）， 其中重疊肽的池1至23之一代表HBV蛋白質(zhì)組的特異性區(qū)域。
[0022] 圖2示出了對(duì)于在通過感染HBV基因型分組的HBV感染受試者中的HBV衍生的短 肽池的IFNy應(yīng)答的特異性。在利用HBV衍生的重疊短肽池庫（0. 1yg/肽/mL)的10天 培養(yǎng)之后，在18h的IFNyELISpot測(cè)定法中，對(duì)PBMC進(jìn)行再刺激（5yg/肽/毫升），其中 重疊肽的池1至23之一代表HBV蛋白質(zhì)組的特異性區(qū)域。
[0023] 圖3示出了對(duì)于在通過種族背景分組的慢性HBV感染受試者中的HBV衍生短肽池 的IFNy應(yīng)答。在利用HBV衍生的重疊短肽池庫（0. 1yg/肽/mL)的10天培養(yǎng)之后，在 18h的IFN丫ELISpot測(cè)定法中，對(duì)PBMC進(jìn)行再刺激（5yg/肽/毫升），其中重疊肽的池1 至23之一代表HBV蛋白質(zhì)組的特異性區(qū)域。
[0024] 圖4示出了在利用HBV聚合酶-和核心衍生的短肽池進(jìn)行刺激之后，在來自慢性 HBV和健康對(duì)照受試者的PBMC中的⑶4和⑶8T細(xì)胞的IFNy生產(chǎn)的代表性點(diǎn)圖。利用短 肽池庫（0. 1Ug/肽/mL)對(duì)來自受試者的PBMC刺激10天，隨后利用HBV衍生的短肽池2或 14進(jìn)行過夜刺激（5yg/肽/mL)，分別代表HBV聚合酶和核心的區(qū)域。結(jié)果表示為IFNY 產(chǎn)生細(xì)胞，作為親本⑶3/⑶4或⑶3/⑶8T細(xì)胞群的百分比。培養(yǎng)基或PMA/伊屋諾霉素中 的刺激分別被用作陰性和陽性對(duì)照，并且門控策略是基于陰性對(duì)照IFNY生產(chǎn)。
[0025] 圖5是在來自健康受試者和免疫控制期或經(jīng)受積極治療的慢性HBV感染的HBeAg 陰性患者的PBMC中對(duì)于HBV衍生的短肽池的IFNy應(yīng)答的比較，該短肽池代表35-40mer 肽。在利用HBV衍生的重疊短肽池庫（0. 1yg/肽/mL)的10天培養(yǎng)之后，在18h的 IFN丫ELISpot測(cè)定法中，對(duì)PBMC進(jìn)行再刺激（5yg/肽/毫升），其中重疊肽的池24至46 之一各自代表HBV蛋白質(zhì)組的35-40mer區(qū)域。
[0026] 圖6示出了對(duì)于在通過感染HBV基因型分組的HBV感染受試者中的表示35-40mer 肽的HBV衍生的短肽池的IFNy應(yīng)答的特異性。在利用HBV衍生的重疊短肽池庫（0. 1yg/ 肽/mL)的10天培養(yǎng)之后，在18h的IFNyELISpot測(cè)定法中，對(duì)PBMC進(jìn)行再刺激，其中重 疊肽的池24至46之一各自代表HBV蛋白質(zhì)組的特定區(qū)域。
[0027] 圖7示出了對(duì)于在通過種族背景分組的慢性HBeAg陰性HBV感染的受試者中的 表示35-40mer肽的HBV衍生的短肽池的IFNy應(yīng)答。在利用HBV衍生的重疊短肽池庫 (〇? 1yg/肽/mL)的10天培養(yǎng)之后，在18h的IFN丫ELISpot測(cè)定法中，對(duì)PBMC進(jìn)行再刺激 (5yg/肽/mL)，其中重疊肽的池24至46之一各自代表HBV蛋白質(zhì)組的35-40mer區(qū)域。
[0028] 圖8是由來自HBV感染的受試者的PBMC進(jìn)行的對(duì)于代表35-40mer肽的各個(gè)短肽 池的的細(xì)胞因子應(yīng)答的總結(jié)。在利用HBV衍生的短肽池庫進(jìn)行10天短期培養(yǎng)之后，來自 慢性eAg陰性HBV感染的受試者（n= 7-14)的PBMC被進(jìn)行培養(yǎng)過夜，其中利用最終濃度 為 5yg/ 肽/mL的HBV肽池 25、38、26、39、42、43、28 和 31 (代表肽P113、P753、P151、P797、 P856、P877、P277和P376)之一。細(xì)胞被染色，用于⑶3、⑶4和⑶8的細(xì)胞外表達(dá)，接著是 IFNy、IL_2和TNFa的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。通過流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)估。細(xì)胞因子的表達(dá) 針對(duì)每個(gè)受試者被標(biāo)準(zhǔn)化為媒介陰性對(duì)照。數(shù)據(jù)表示針對(duì)每個(gè)被評(píng)價(jià)因子的平均表達(dá)。應(yīng) 答的廣度示出為在每個(gè)堆疊柱狀圖上。
[0029] 圖9示出了IFNy斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)量（平均值），其在來自慢性HBV感染（HBeAg 陰性無活性攜帶者（無活性載體）或HBeAg陰性治療患者）的PBMC中測(cè)量。在利用九個(gè)未 共軛（未軛合）的 肽（NP113、NP151、NP277(K)、NP376、NP753(K)、NP797(K)、NP856(K)、 NP877和NP1266(K)) (0? 1yg/肽/毫升）進(jìn)行10天培養(yǎng)之后，在18h的IFNyELISpot測(cè) 定法中，對(duì)PBMC進(jìn)行再刺激，其中各個(gè)肽的濃度為5yg/ml。
[0030] 圖10示出了響應(yīng)于在來自慢性HBV感染（HBeAg陰性無活性攜帶者或HBeAg陰性 治療受試者）的PBMC中測(cè)量的HBV肽的對(duì)于IFNyELISpot測(cè)定法的應(yīng)答的頻率。在利 用九個(gè)未共軛的 肽（NP113、NP151、NP277 (K)、NP376、NP753 (K)、NP797 (K)、NP856 (K)、 NP877和NP1266(K)) (0? 1yg/肽/毫升）進(jìn)行10天培養(yǎng)之后，在18h的IFNyELISpot測(cè) 定法中，對(duì)PBMC進(jìn)行再刺激，其中各個(gè)肽的濃度為5yg/ml。
[0031] 圖11示出了IFNY斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)量（平均值），其是在來自通過感染HBV基 因型分組的慢性HBV感染受試者的PBMC中測(cè)量的。在利用九個(gè)未共軛的HBV肽（NP113、 NP151、NP277(K)、NP376、NP753(K)、NP797(K)、NP856(K)、NP877 和NP1266(K))(0? 1yg/ 肽 /毫升）進(jìn)行10天培養(yǎng)之后，在18h的IFN丫ELISpot測(cè)定法中，對(duì)PBMC進(jìn)行再刺激，其中 各個(gè)肽的濃度為5yg/ml。
[0032] 圖12示出了IFNy斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)量（平均值），其是在來自通過種族背景分 組的慢性HBV感染受試者的PBMC中測(cè)量的。在利用九個(gè)未共軛的HBV肽（NP113、NP151、 NP277 (K)、NP376、NP753 (K)、NP797 (K)、NP856 (K)、NP877 和NP1266 (K)) (0? 1yg/ 肽 / 毫升） 進(jìn)行10天培養(yǎng)之后，在18h的IFN丫ELISpot測(cè)定法中，對(duì)PBMC進(jìn)行再刺激，其中各個(gè)肽的 濃度為5yg/ml。
[0033] 圖13示出了在利用HBV衍生的肽進(jìn)行刺激之后在來自慢性HBV的PBMC中的產(chǎn) 生細(xì)胞因子的⑶4+和⑶8+T細(xì)胞的頻率。圖13A、13B、13C、13D和13E對(duì)應(yīng)于針對(duì)通過 HBV基因型A、B、C、D和非A/B/C/D感染的個(gè)體的群獲得的結(jié)果。在利用九個(gè)未共軛的HBV 肽（NP113、NP151、NP277(K)、NP376、NP753(K)、NP797(K)、NP856(K)、NP877 和NP1266(K)) (0. 1yg/肽/毫升）進(jìn)行10天培養(yǎng)之后，在18h的IFNyELISpot測(cè)定法中，對(duì)PBMC進(jìn)行 再刺激，其中各個(gè)肽的濃度為5yg/ml。結(jié)果表示為產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞，作為親本CD3/ CD4或CD3/CD8+T細(xì)胞群的百分比。在培養(yǎng)基或PMA/伊屋諾霉素中的刺激分別被用作陰性 和陽性對(duì)照，并且門控策略是基于陰性對(duì)照IFNy生產(chǎn)。
[0034] 圖14示出了通過來自利用FP-02. 1或NP02. 1免疫的BALB/c小鼠（n= 7)的脾 細(xì)胞進(jìn)行的IFNy生產(chǎn)。視圖表示了每106個(gè)脾細(xì)胞IFNy斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)量，其是在 疫苗的9個(gè)肽組分的應(yīng)答中測(cè)量的。采用配對(duì)t檢驗(yàn)（ns=不顯著）來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0035] 圖15示出了通過來自利用FP-02. 1或NP02. 1免疫的BALB/c小鼠（n= 7)的脾 細(xì)胞進(jìn)行的IFNy生產(chǎn)。視圖表示了每106個(gè)脾細(xì)胞IFNy斑點(diǎn)形成細(xì)胞的數(shù)量，其是在 疫苗的9個(gè)肽組分的應(yīng)答中測(cè)量的。柱代表每個(gè)單獨(dú)的肽的累積中位應(yīng)答。
[0036] 圖16示出，F(xiàn)P02. 1在單次免疫后促進(jìn)了對(duì)于由MHCI類分子限制的CTL表位的T 細(xì)胞應(yīng)答。
[0037] 圖17示出了通過利用FP-02. 1或NP02. 1免疫的BALB/c小鼠進(jìn)行的IFNy生產(chǎn)。 在對(duì)于九個(gè)肽的混合物的應(yīng)答中產(chǎn)生IFNySFC/106脾細(xì)胞的數(shù)量，針對(duì)每個(gè)脾細(xì)胞種群。
[0038] 序列表的簡(jiǎn)要描述
[0039]SEQIDNOs:1至38和40至72是HBV聚合酶的SEQIDN0 :39中所示的參考HBV 序列的區(qū)域的氨基酸序列，如下面的表1中所示。
[0040]
[0041]
[0042]
[0043] SEQIDNO:39是通過聚合酶的末端結(jié)構(gòu)域（位置1至181)、聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié) 構(gòu)域（位置182至549)、聚合酶的RNA酶結(jié)構(gòu)域H(位置550至702)、核心蛋白（位置703 至914)、X蛋白（位置915至1068)和表面蛋白（位置1069至1468)的線性共組裝建立的 虛擬HBV蛋白質(zhì)序列。從由基因型A、B、C和D共有序列生成的共有序列的共有獲得蛋白質(zhì) 組序列。
[0044] SEQIDNOs:73至219是池1至46中的每一個(gè)內(nèi)的短肽的氨基酸序列。SEQID NO: 220是池5的氨基酸序列。
【具體實(shí)施方式】
[0045] 肽組合物
[0046] 本發(fā)明提供了廣泛包含免疫原性肽序列的組合物，該免疫原性肽序列能夠引發(fā)多 表位⑶4+和⑶8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答，在人口覆蓋和HBV基因型覆蓋方面具有廣泛應(yīng)用。本發(fā) 明提供了一種藥物組合物，包括：來自長度為15到60個(gè)氨基酸的至少一種肽，其中，所述肽 包含HBV聚合酶的末端結(jié)構(gòu)域的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸的片段、HBV聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu) 域、HBV聚合酶或HBV核心蛋白的RNA酶H結(jié)構(gòu)域序列。所述肽的長度為15至60個(gè)氨基 酸，并選自包含在SEQIDNOs:1至4中所示的序列之一的至少15個(gè)連續(xù)氨基酸的序列的 肽。該肽包含至少一個(gè)CD8+T細(xì)胞表位和/或至少一個(gè)CD4+T細(xì)胞表位。該肽在體外測(cè)定 方法中在來自至少一個(gè)慢性感染的HBV個(gè)體的外周血單核細(xì)胞（PBMC)中引發(fā)應(yīng)答。
[0047] 該組合物可包含具有上文定義的性質(zhì)的多個(gè)肽。該組合物能夠在來自不同種族的 至少兩個(gè)個(gè)體和/或來自感染了不同HBV基因型的至少兩個(gè)個(gè)體的外周血單核細(xì)胞（PBMC) 中引發(fā)免疫應(yīng)答。
[0048] 肽序列
[0049] 本發(fā)明