專利名稱：乙型肝炎－戊型肝炎聯(lián)合疫苗及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種聯(lián)合疫苗及其制備方法，特別是涉及乙型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗(乙—戊肝聯(lián)合疫苗)及其制備方法。
背景技術：
病毒性肝炎是由多種肝炎病毒引起的以肝臟損害為主的急性或持續(xù)性傳染病，在世界各地均有流行。乙型肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所致，廣泛流行于世界各地，我國是乙肝的高流行區(qū)，全國有1.2億多人為HBV攜帶者，每年新發(fā)病人多達900多萬。自1985年全國開展乙肝疫苗接種以來，在免疫兒童中乙肝病毒攜帶率已由10％左右降低為1％左右；1991年，WHO將乙肝疫苗接種納入擴大免疫計劃，對嬰兒和成人實施普遍的免疫接種；我國于1992年將乙肝疫苗的免疫接種納入國家計劃免疫項目。實踐證明，如同其它疫苗可預防疾病一樣，接種乙肝疫苗是預防和控制乙肝傳播和流行的有效措施。
戊型肝炎(戊肝)是經糞-口途徑傳播的急性病毒性肝炎，由戊型肝炎病毒(HEV)感染所致。1986-1988年我國新疆發(fā)生戊肝大流行，是世界上最大的一次戊肝爆發(fā)性流行，12萬余人受到感染。據我國2004年的統(tǒng)計報告表明，在各種肝炎的發(fā)病率中，戊肝發(fā)病率有上升趨勢。然而，由于HEV細胞培養(yǎng)非常困難，因此目前難以研制滅活疫苗或減毒活疫苗，國內外的研究大都集中于通過基因重組技術來研制基因工程亞單位疫苗。
含有兩種或兩種以上抗原、可以預防兩種或兩種以上疾病的聯(lián)合疫苗的研究一直受到眾多學者關注，并以其方便、多效、低成本成為新一代疫苗研究的熱點。與單一疫苗相比，聯(lián)合疫苗可以減少疫苗的接種次數，避免因漏種而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐熱，其生產、運輸、儲存、銷售乃至全部使用過程均需在較低溫度下進行，即所謂的“冷鏈”，這種環(huán)環(huán)相扣的冷鏈運作，費用極高，使疫苗成本居高不下。而使用聯(lián)合疫苗，則可以大大降低冷鏈運作的費用，因此具有顯著的優(yōu)越性。百日咳-白喉-破傷風三聯(lián)疫苗在計劃免疫中已使用多年即為一成功之例。近年來一些新的聯(lián)合疫苗如甲肝和乙肝聯(lián)合疫苗也已經獲得專利(歐洲專利0339667)。但是，同作為病毒性肝炎的乙肝和戊肝的聯(lián)合疫苗，迄今為止其研制在國內外尚未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種方便、多效、低成本、并能夠有效預防人及動物乙肝和戊肝的乙—戊肝聯(lián)合疫苗及其制備方法。
本發(fā)明采用如下技術方案一種乙—戊肝聯(lián)合疫苗，包括HEV重組蛋白以及重組HBsAg，所說的重組HBsAg含量為50-500μg/ml，HEV重組蛋白的含量為50-500μg/ml。
一種用于制備上述乙—戊肝聯(lián)合疫苗的方法(a)在制備最終的乙—戊肝聯(lián)合疫苗之前，將重組HBsAg吸附于佐劑氫氧化鋁凝膠，將HEV重組蛋白吸附于佐劑氫氧化鋁凝膠，調整pH至5.5-9.6；(b)將調整了pH的上述組份混合。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點本發(fā)明的聯(lián)合疫苗可以有效的用于預防人及動物的乙肝和戊肝。動物實驗表明，乙—戊肝聯(lián)合疫苗的免疫效果明顯優(yōu)于單價疫苗，因此本發(fā)明提供的聯(lián)合疫苗具有比單價疫苗更好的免疫原性。
與單一疫苗相比，聯(lián)合疫苗可以減少疫苗的接種次數，避免因漏種而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐熱，其生產、運輸、儲存、銷售乃至全部使用過程所需的“冷鏈運作”，費用極高。而使用聯(lián)合疫苗，則可以大大降低疫苗成本，因此具有顯著的優(yōu)越性。
由于本發(fā)明的聯(lián)合疫苗中使用了經充分證明具有良好安全性及免疫原性的乙肝疫苗，所以能夠大大降低聯(lián)合疫苗的生產成本和市場價格。
本發(fā)明也提供了聯(lián)合疫苗的貯藏方法，包括將明膠加入乙-戊肝聯(lián)合疫苗，或使用硅涂層的玻璃瓶作為聯(lián)合疫苗的貯藏瓶。優(yōu)選明膠的濃度范圍為0.5-0.7w/v％。
本發(fā)明的乙-戊肝聯(lián)合疫苗中，使用的氫氧化鋁凝膠可以購買或采用已知方法進行制備。該類佐劑為本領域技術人員所熟知的，易于獲得和制備。
根據本發(fā)明聯(lián)合疫苗的優(yōu)選實施方案，聯(lián)合疫苗中所含的重組HBsAg含量為50-500μg/ml，HEV重組蛋白的含量為50-500μg/ml，氫氧化鋁凝膠濃度為0.6-1.5mg/ml。
動物實驗表明，根據本發(fā)明聯(lián)合疫苗的優(yōu)選實施方案制備的乙-戊肝聯(lián)合疫苗能夠誘導機體產生針對HBV和HEV的高滴度、特異性抗體，特別是乙—戊肝聯(lián)合疫苗的免疫效果明顯優(yōu)于單價疫苗，因此本發(fā)明提供的聯(lián)合疫苗具有比單價疫苗更好的免疫原性。
具體實施例方式
實施例中乙-戊肝聯(lián)合疫苗以HBV-HEV或HBV-HEV聯(lián)合疫苗表示。
實施例1一種乙—戊肝聯(lián)合疫苗，包括HEV重組蛋白以及重組HBsAg，所說的重組HBsAg含量為50-500μg/ml，HEV重組蛋白的含量為50-500μg/ml。
本實施例還包括免疫佐劑，該免疫佐劑為氫氧化鋁凝膠溶液，氫氧化鋁凝膠的濃度范圍調整為0.6-1.5mg/ml。
上述重組HBsAg是由酵母細胞，哺乳動物細胞，或其他可用細胞表達的基因工程重組蛋白，其特征在于包括任何HBV的HBsAg或其片斷，其優(yōu)選的序列為HBsAg S抗原的226個氨基酸序列(見Tiollais等，Nature，317,489(1985))。HEV重組蛋白的氨基末端位于戊型肝炎病毒開放閱讀框架2編碼的380位至480位氨基酸之間，其羧基末端位于580位至650位氨基酸之間或由此氨基酸產生的衍生物，其所述的序列為RGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRPLMTIQQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVCISTYTTNLGSGPVSISAVGVLAPHSALAALEDTVDYPARAHTFDDFCPECRALGLQ
優(yōu)先選用第453位至631位氨基酸序列(p179)。其所述的序列如下VIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVCISTYTTNLGSGPVSISAVGVLAPHSALAVLEDTVDYP本發(fā)明的HBV-HEV聯(lián)合疫苗還含有0.5-0.7w/v％用量的明膠。
實施例2一種用于制備上述HBV-HEV聯(lián)合疫苗的方法(a)在制備最終的HBV-HEV聯(lián)合疫苗之前，將重組HBsAg吸附于氫氧化鋁凝膠，將HEV重組蛋白吸附于氫氧化鋁凝膠，調整pH至5.5-9.6(b)將調整了pH的上述組份混合。
實施例3重組HBsAg的制備培養(yǎng)通過基因工程方法制備的可以表達重組HBsAg的酵母細胞，通過離心獲得的酵母細胞沉淀以1∶2的比例稀釋到緩沖液中(0.5M NaCl，10mM EDTA，0.01％ HgSO4，pH 7.0)。稀釋后的溶液用玻璃珠攪拌器破碎細胞壁。獲得的溶液加入0.5％的中性表面活性劑，4℃攪拌混合均勻。得到的溶液中加入NaOH至pH 11，然后4℃攪拌混合5小時。得到的溶液加入HCl至pH4。離心去除沉淀，調整pH值至7.0。然后用硅膠吸附、葡聚糖層析等方法純化重組HBsAg，純化后產物通過電泳驗證并用以疫苗制備。
重組HBsAg也可按2000年版《中國生物制品規(guī)程》中《重組(CHO細胞)乙型肝炎疫苗制造及檢定規(guī)程》制備。
實施例4HEV重組蛋白的表達和純化(1)以HEV 4型中國株基因序列為模板，用引物1(5’-CCC CCC ATG GTTATC CAG GAC TAT GAT AAT C-3’)和引物2(5’-CCC CTC GAG TCA AGG GTAATC AAC AGT GTC CTC CA-3’)擴增ORF2編碼多肽453-631(p179)的基因片段。PCR條件為94℃-45秒，52℃-45秒，72℃-50秒，35個循環(huán)。PCR產物經瓊脂糖凝膠回收純化，克隆入質粒載體pET28(a)+中。
(2)將表達質粒轉化入表達菌株E.coli BL-21(DE3)中，挑取單菌落，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD550＝0.6～0.8，用終濃度為0.2～1.0mMIPTG進行誘導，誘導溫度為37℃，搖床搖速為200rpm，3-4小時后離心收集菌體，用細胞裂解液(50mM Tris-HCl，pH 7.2，300mM NaCl)懸浮菌體沉淀，凍融6次后超聲破碎菌體，離心收集上清液，再用離子交換、葡聚糖層析等方法進行純化，最后使用UV280、SDS-PAGE等方法進行檢測。
實施例5制備重組HBsAg和HEV重組蛋白氫氧化鋁凝膠吸附溶液為了增加免疫原性，分別將重組HBsAg和HEV重組蛋白吸附于氫氧化鋁凝膠(1)將重組HBsAg和氫氧化鋁凝膠攪拌混合；(2)將HEV重組蛋白和氫氧化鋁凝膠攪拌混合。再將(1)和(2)所得的溶液混合，調整重組HBsAg的濃度為200μg/ml，HEV重組蛋白濃度為200μg/ml，氫氧化鋁凝膠的濃度為1.0mg/ml；所得的混合溶液即為重組HBsAg和HEV重組蛋白氫氧化鋁凝膠吸附溶液。
實施例6HBV-HEV聯(lián)合疫苗的免疫原性實驗A實驗動物分組和免疫方案選用6-8周齡的雌性BALB/C純系小鼠250只(揚州大學比較醫(yī)學實驗中心提供)，隨機分為24組，每組10只。A組空白對照組，注射濃度為1.0mg/ml的氫氧化鋁凝膠，0.1ml/只；B組乙肝疫苗組，注射乙肝疫苗(重組HBsAg含量為50μg/ml)，0.1ml/只；C組乙肝疫苗組，注射乙肝疫苗(重組HBsAg含量為100μg/ml)，0.1ml/只；；D組乙肝疫苗組，注射乙肝疫苗(重組HBsAg含量為200μg/ml)，0.1ml/只；；E組乙肝疫苗組，注射乙肝疫苗(重組HBsAg含量為500μg/ml)，0.1ml/只；F組戊肝疫苗組，注射HEV重組蛋白(50μg/ml)，0.1ml/只；G組戊肝疫苗組，注射HEV重組蛋白(100μg/ml)，0.1ml/只；H組戊肝疫苗組，注射HEV重組蛋白(200μg/ml)，0.1ml/只；I組戊肝疫苗組，注射HEV重組蛋白(500μg/ml)，0.1ml/只；J組HBV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射HEV重組蛋白(50μg/ml)+乙肝疫苗(重組HBsAg含量為50μg/ml)，0.1ml/只；K組HBV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射HEV重組蛋白(100μg/ml)+乙肝疫苗(重組HBsAg含量為50μg/ml)，0.1ml/只；L組HBV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射HEV重組蛋白(200μg/ml)+乙肝疫苗(重組HBsAg含量為50μg/ml)，0.1ml/只；M組HBV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射HEV重組蛋白(500μg/ml)+乙肝疫苗(重組HBsAg含量為50μg/ml)，0.1ml/只；N組HBV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射HEV重組蛋白(50μg/ml)+乙肝疫苗(重組HBsAg含量為100μg/ml)，0.1ml/只；O組HBV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射HEV重組蛋白(100μg/ml)+乙肝疫苗(重組HBsAg含量為100μg/ml)，0.1ml/只；P組HBV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射HEV重組蛋白(200μg/ml)+乙肝疫苗(重組HBsAg含量為100μg/ml)，0.1ml/只；Q組HBV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射HEV重組蛋白(500μg/ml)+乙肝疫苗(重組HBsAg含量為100μg/ml)，0.1ml/只；R組HBV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射HEV重組蛋白(50μg/ml)+乙肝疫苗(重組HBsAg含量為200μg/ml)，0.1ml/只；S組HBV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射HEV重組蛋白(100μg/ml)+乙肝疫苗(重組HBsAg含量為200μg/ml)，0.1ml/只；T組HBV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射HEV重組蛋白(200μg/ml)+乙肝疫苗(重組HBsAg含量為200μg/ml)，0.1ml/只；U組HBV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射HEV重組蛋白(500μg/ml)+乙肝疫苗(重組HBsAg含量為200μg/ml)，0.1ml/只；V組HBV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射HEV重組蛋白(50μg/ml)+乙肝疫苗(重組HBsAg含量為500μg/ml)，0.1ml/只；W組HBV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射HEV重組蛋白(100μg/ml)+乙肝疫苗(重組HBsAg含量為500μg/ml)，0.1ml/只；X組HBV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射HEV重組蛋白(200μg/ml)+乙肝疫苗(重組HBsAg含量為500μg/ml)，0.1ml/只；Y組HBV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射HEV重組蛋白(500μg/ml)+乙肝疫苗(重組HBsAg含量為500μg/ml)，0.1ml/只；各組實驗動物分別于0、4、6周注射相應疫苗三次，其中0周背部皮下多點注射0.1ml相應疫苗，4、6周腹腔注射0.05ml相應疫苗。
B檢測方法B-1血清采集所有動物均于免疫前、免疫后2、4、6、8、10、14、18、24、48周經眼眶靜脈采血，-20℃凍存，于實驗結束后統(tǒng)一檢測。
B-2乙肝、戊肝抗體檢測采用ELISA檢測各組動物血清(1∶100稀釋)，檢測各動物抗體產生情況，以1∶10的免疫前血清作為陰性對照，P/N比值大于2.1為抗體陽性血清。
將不同組別、不同時間的免疫血清分別系列稀釋，以1∶100為起點，采用ELISA法檢測乙肝、戊肝抗體滴度。
C結果C-1如表1-1所示，使用不同劑量的乙肝疫苗免疫小鼠的結果表明，產生陽性血清小鼠的百分數隨乙肝疫苗免疫劑量的提高而升高，D組和E組之間無明顯差異。如表1-2所示，免疫血清中乙肝抗體滴度隨乙肝疫苗免疫劑量、免疫次數的增加而升高，至8-10周時達到最高水平(1∶102400)，D組和E組48周后免疫血清滴度仍可維持1∶51200。
表1-1不同劑量的乙肝疫苗誘生小鼠乙肝抗體的產生情況

表1-1不同劑量的乙肝疫苗誘生小鼠乙肝抗體的產生水平

C-2如表2-1所示，使用不同劑量的戊肝疫苗免疫小鼠的結果表明，產生陽性血清小鼠的百分數隨戊肝疫苗免疫劑量的提高而升高，當戊肝重組蛋白免疫劑量≥200μg/ml時，全部小鼠均能產生陽性血清。
如表2-2所示，免疫血清中戊肝抗體滴度同樣與戊肝疫苗免疫劑量、免疫次數有關，H組和I組免疫血清抗體滴度高于F組和G組，血清抗體滴度于8-10周時達到最高水平(1∶102400)，H組和I組48周后免疫血清滴度仍可維持1∶25600。
表2-1不同劑量的戊肝疫苗誘生小鼠戊肝抗體的產生情況

表2-2不同劑量的戊肝疫苗誘生小鼠戊肝抗體的產生水平

C-3如表3-1所示，乙肝疫苗(重組HBsAg含量為50μg/ml)與不同劑量的HEV重組蛋白進行聯(lián)合免疫小鼠的結果表明，B、J、K組分別有60％、80％、90％的動物能夠誘導出乙肝抗體，L、M組100％的動物誘導出乙肝抗體。
表3-2表明，乙肝疫苗(重組HBsAg含量為50μg/ml)與不同劑量的HEV重組蛋白聯(lián)合免疫小鼠后，小鼠乙肝抗體產生水平明顯高于單價乙肝疫苗組(重組HBsAg含量為50μg/ml)，且L、M組優(yōu)于J、K組，48周后，L、M組的血清抗體滴度仍可維持在1∶51200。
表3-1乙肝疫苗(重組HBsAg含量為50μg/ml)與不同劑量的HEV重組蛋白進行聯(lián)合免疫誘生小鼠乙肝抗體的產生情況

表3-2乙肝疫苗(重組HBsAg含量為50μg/ml)與不同劑量的HEV重組蛋白進行聯(lián)合免疫誘生小鼠乙肝抗體的產生水平

C-4如表4-1所示，乙肝疫苗(重組HBsAg含量為100μg/ml)與不同劑量的HEV重組蛋白進行聯(lián)合免疫小鼠的結果表明，C組有90％的動物能夠誘導出乙肝抗體，N、O、P、Q組的動物均能誘導出抗乙肝抗體。
表4-2表明，乙肝疫苗(重組HBsAg含量為100μg/ml)與不同劑量的HEV重組蛋白聯(lián)合免疫小鼠后，小鼠乙肝抗體產生水平明顯高于單價乙肝疫苗組(重組HBsAg含量為100μg/ml)，且P、Q組優(yōu)于N、O組，48周后，P、Q組的血清抗體滴度仍可維持在1∶51200。
表4-1乙肝疫苗(重組HBsAg含量為100μg/ml)與不同劑量的HEV重組蛋白進行聯(lián)合免疫誘生小鼠乙肝抗體的產生情況

表4-2乙肝疫苗(重組HBsAg含量為100μg/ml)與不同劑量的HEV重組蛋白進行聯(lián)合免疫誘生小鼠乙肝抗體的產生水平

C-5如表5-1所示，乙肝疫苗(重組HBsAg含量為200μg/ml)與不同劑量的HEV重組蛋白進行聯(lián)合免疫小鼠的結果表明，D、R、S、T、U組的動物均能誘導出乙肝抗體。
表5-2表明，乙肝疫苗(重組HBsAg含量為200μg/ml)與不同劑量的HEV重組蛋白聯(lián)合免疫小鼠后，小鼠乙肝抗體產生水平明顯高于單價乙肝疫苗組(重組HBsAg含量為200μg/ml)，且T、U組優(yōu)于R、S組，48周后，T、U組的血清抗體滴度仍可維持在1∶102400。
表5-1乙肝疫苗(重組HBsAg含量為200μg/ml)與不同劑量的HEV重組蛋白進行聯(lián)合免疫誘生小鼠乙肝抗體的產生情況

表5-2乙肝疫苗(重組HBsAg含量為200μg/ml)與不同劑量的HEV重組蛋白進行聯(lián)合免疫誘生小鼠乙肝抗體的產生水平

C-6如表6-1所示，乙肝疫苗(重組HBsAg含量為500μg/ml)與不同劑量的HEV重組蛋白進行聯(lián)合免疫小鼠的結果表明，E、V、W、X、Y組的動物均能誘導乙肝抗體。
表6-2表明，乙肝疫苗(重組HBsAg含量為500μg/ml)與不同劑量的HEV重組蛋白聯(lián)合免疫小鼠后，小鼠乙肝抗體產生水平明顯高于單價乙肝疫苗組(重組HBsAg含量為500μg/ml)，且X、Y組優(yōu)于V、W組，48周后，X、Y組的血清抗體滴度仍可維持在1∶102400。
表6-1乙肝疫苗(重組HBsAg含量為500μg/ml)與不同劑量的HEV重組蛋白進行聯(lián)合免疫誘生小鼠乙肝抗體的產生情況

表6-2乙肝疫苗(重組HBsAg含量為500μg/ml)與不同劑量的HEV重組蛋白進行聯(lián)合免疫誘生小鼠乙肝抗體的產生水平

C-7如表7-1所示，HEV重組蛋白(50μg/ml)與不同劑量的乙肝疫苗進行聯(lián)合免疫小鼠的結果表明，F(xiàn)組有80％的動物能誘導出抗HEV的陽性血清，J、N、R、V組的動物均能誘導出抗HEV的陽性血清。
表6-2表明，HEV重組蛋白(50μg/ml)與不同劑量的乙肝疫苗聯(lián)合免疫小鼠后，小鼠乙肝抗體產生水平明顯高于單價戊肝疫苗組(50μg/ml)，且R、V組優(yōu)于J、N組，48周后，R、V組的血清抗體滴度仍可維持在1∶51200。
表7-1 HEV重組蛋白(50μg/ml)與不同劑量的乙肝疫苗進行聯(lián)合免疫誘生小鼠戊肝抗體的產生情況

表7-2 HEV重組蛋白(50μg/ml)與不同劑量的乙肝疫苗進行聯(lián)合免疫誘生小鼠戊肝抗體的產生水平

C-8如表8-1所示，HEV重組蛋白(100μg/ml)與不同劑量的乙肝疫苗進行聯(lián)合免疫小鼠的結果表明，G組有80％的動物能誘導出抗HEV的陽性血清，K、O、S、W組的動物均能誘導出抗HEV的陽性血清。
表8-2表明，HEV重組蛋白(100μg/ml)與不同劑量的乙肝疫苗聯(lián)合免疫小鼠后，小鼠乙肝抗體產生水平明顯高于單價戊肝疫苗組(100μg/ml)，且S、W組優(yōu)于K、O組，48周后，S、W組的血清抗體滴度仍可維持在1∶51200。
表8-1 HEV重組蛋白(100μg/ml)與不同劑量的乙肝疫苗進行聯(lián)合免疫誘生小鼠戊肝抗體的產生情況

表8-2 HEV重組蛋白(100μg/ml)與不同劑量的乙肝疫苗進行聯(lián)合免疫誘生小鼠戊肝抗體的產生水平

C-9如表9-1所示，HEV重組蛋白(200μg/ml)與不同劑量的乙肝疫苗進行聯(lián)合免疫小鼠的結果表明，H、L、P、T、X組的動物均能誘導出抗HEV的陽性血清。
表9-2表明，HEV重組蛋白(200μg/ml)與不同劑量的乙肝疫苗聯(lián)合免疫小鼠后，小鼠乙肝抗體產生水平明顯高于單價戊肝疫苗組(200μg/ml)，且T、X組優(yōu)于L、P組，48周后，T、X組的血清抗體滴度仍可維持在1∶102400。
表9-1 HEV重組蛋白(200μg/ml)與不同劑量的乙肝疫苗聯(lián)合免疫誘生小鼠戊肝抗體的產生情況

表9-2 HEV重組蛋白(200μg/ml)與不同劑量的乙肝疫苗進行聯(lián)合免疫誘生小鼠戊肝抗體的產生水平

C-10如表10-1所示，HEV重組蛋白(500μg/ml)與不同劑量的乙肝疫苗進行聯(lián)合免疫小鼠的結果表明，I、M、Q、U、Y組的動物均能誘導出抗HEV的陽性血清。
表10-2表明，HEV重組蛋白(500μg/ml)與不同劑量的乙肝疫苗聯(lián)合免疫小鼠后，小鼠乙肝抗體產生水平明顯高于單價戊肝疫苗組(500μg/ml)，且U、Y組優(yōu)于M、Q組，48周后，U、Y組的血清抗體滴度仍可維持在1∶102400。
表10-1 HEV重組蛋白(500μg/ml)與不同劑量的乙肝疫苗聯(lián)合免疫誘導小鼠戊肝抗體的產生情況

表10-2 HEV重組蛋白(500μg/ml)與不同劑量的乙肝疫苗進行聯(lián)合免疫誘生小鼠戊肝抗體的產生水平

以上的實施例結果表明，不同劑量配比的乙—戊肝聯(lián)合疫苗的免疫效果均優(yōu)于單價疫苗；其中以T組(HEV重組蛋白(200μg/ml)+乙肝疫苗(重組HBsAg含量為200μg/ml))、U組(HEV重組蛋白(500μg/ml)+乙肝疫苗(重組HBsAg含量為200μg/ml)、X組(HEV重組蛋白(200μg/ml)+乙肝疫苗(重組HBsAg含量為500μg/ml))、Y組(HEV重組蛋白(500μg/ml)+乙肝疫苗(重組HBsAg含量為500μg/ml))效果較好，比較該幾組疫苗之間的免疫效果亦無明顯差異。因此，我們認為乙—戊肝聯(lián)合疫苗中重組HBsAg和HEV重組蛋白的劑量≥200μg/ml時可以取的很好的免疫效果，且其中以HEV重組蛋白(200μg/ml)+乙肝疫苗(重組HBsAg含量為200μg/ml)的成本相對最低。
權利要求
1.一種乙型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗(乙-戊肝聯(lián)合疫苗)，其特征在于包括戊型肝炎病毒(HEV)重組蛋白以及重組乙型肝炎病毒表面抗原(重組HBsAg)，所說的重組HBsAg含量為50-500μg/ml，HEV重組蛋白的含量為50-500μg/ml。
2.根據權利要求1所述的乙-戊肝聯(lián)合疫苗，其特征在于重組HBsAg為酵母細胞，哺乳動物細胞，或其他可用細胞表達的基因工程重組蛋白。
3.根據權利要求1所述的乙-戊肝聯(lián)合疫苗，其特征在于重組HBsAg為基因工程重組抗原或其片段或含pre S1/pre S2成分的抗原。
4.根據權利要求1所述的乙-戊肝聯(lián)合疫苗，其特征在于HEV重組蛋白的氨基末端位于其開放閱讀框架2編碼蛋白的380位至480位氨基酸之間，其羧基末端位于580位至650位氨基酸之間或由此蛋白片段產生的衍生物。
5.根據權利要求1所述的乙-戊肝聯(lián)合疫苗，其特征在于包括免疫佐劑，該免疫佐劑為氫氧化鋁凝膠溶液，氫氧化鋁凝膠的濃度范圍調整為0.6-1.5mg/ml。
6.根據權利要求1所述的乙-戊肝聯(lián)合疫苗，其特征在于含有0.5-0.7w/v％用量的明膠。
7.一種用于制備權利要求1所述乙-戊肝聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于(a)在制備最終的乙-戊肝聯(lián)合疫苗之前，將重組HBsAg吸附于氫氧化鋁凝膠，將HEV重組蛋白吸附于氫氧化鋁凝膠，調整pH至5.5-9.6；(b)將調整了pH的上述組份混合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乙型肝炎－戊型肝炎聯(lián)合疫苗(乙－戊肝聯(lián)合疫苗)，包括戊型肝炎病毒(HEV)重組蛋白以及重組乙型肝炎病毒表面抗原(重組HBsAg)，所說的重組HBsAg含量為50－500μg/ml，HEV重組蛋白的含量為50－500μg/ml。及乙－戊肝聯(lián)合疫苗的制備方法(a)在制備最終的乙－戊肝聯(lián)合疫苗之前，將重組HBsAg吸附于氫氧化鋁凝膠，將HEV重組蛋白吸附于氫氧化鋁凝膠，調整pH至5.5－9.6；(b)將調整了pH的上述組份混合。使用聯(lián)合疫苗，則可以大大降低疫苗成本，因此具有顯著的優(yōu)越性。
文檔編號A61P31/14GK1814286SQ20051012260
公開日2006年8月9日 申請日期2005年11月29日 優(yōu)先權日2005年11月29日
發(fā)明者孟繼鴻, 戴星, 董晨, 張敏 申請人:東南大學