專利名稱：甲型肝炎－戊型肝炎聯(lián)合疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種聯(lián)合疫苗及其制備方法，特別是涉及甲型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
近年來隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展，人員流動日益增加，多種傳染病的發(fā)生也日益頻繁，嚴重威脅公眾的健康，并給國家造成了巨大的經(jīng)濟負擔。因此為了有效控制傳染病的流行，研究和開發(fā)預(yù)防性疫苗具有重要的理論意義和現(xiàn)實意義。
甲型肝炎(甲肝)和戊型肝炎(戊肝)是經(jīng)糞-口途徑傳播的急性病毒性肝炎，我國常見的甲肝和戊肝地發(fā)病形式有流行和散發(fā)兩種。1988年上海因食用毛蚶導致甲肝急性大流行，出現(xiàn)30余萬例甲肝病例；1986-1988年新疆發(fā)生戊肝大流行，12萬余人受到感染，是世界上最大的一次戊肝爆發(fā)性流行。據(jù)我國2004年的統(tǒng)計報告表明，在各種肝炎的發(fā)病率中，戊肝發(fā)病率有上升趨勢，甲肝發(fā)病率基本維持往年水平。
甲肝疫苗已經(jīng)上市多年，戊肝疫苗則尚在研制中。甲肝疫苗有滅活疫苗和減毒活疫苗兩種，前者安全性好，后者生產(chǎn)成本較低。發(fā)達國家主要使用滅活疫苗，我國以減毒活疫苗為主，兩者的生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)非常成熟。而戊型肝炎病毒由于細胞培養(yǎng)非常困難，因此目前難以研制滅活疫苗或減毒活疫苗，國內(nèi)外的研究大都集中于通過基因重組技術(shù)來研制基因工程亞單位疫苗。
含有兩種或兩種以上抗原、可以預(yù)防兩種或兩種以上疾病的聯(lián)合疫苗的研究一直受到眾多學者關(guān)注，并以其方便、多效、低成本成為新一代疫苗研究的熱點。與單一疫苗相比，聯(lián)合疫苗可以減少疫苗的接種次數(shù)，避免因漏種而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐熱，其生產(chǎn)、運輸、儲存、銷售乃至全部使用過程均需在較低溫度下進行，即所謂的“冷鏈”，這種環(huán)環(huán)相扣的冷鏈運作，費用極高，使疫苗成本居高不下。而使用聯(lián)合疫苗，則可以大大降低冷鏈運作的費用，因此具有顯著的優(yōu)越性。百日咳-白喉-破傷風三聯(lián)疫苗在計劃免疫中已使用多年即為一成功之例。近年來一些新的聯(lián)合疫苗如甲肝和乙肝聯(lián)合疫苗也已經(jīng)獲得專利(歐洲專利0339667)。但是，同作為腸道傳播性肝炎的甲肝和戊肝的聯(lián)合疫苗，迄今為止其研制在國內(nèi)外尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種方便、多效、低成本、并能夠有效預(yù)防人及動物甲型肝炎和戊型肝炎的甲型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗及其制備方法。
本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種甲型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗，包括戊型肝炎病毒重組蛋白以及甲型肝炎減毒活疫苗或甲型肝炎滅活疫苗。所說的甲型肝炎減毒活疫苗，其病毒滴度為5-10LogCCID50/ml，或甲型肝炎滅活疫苗，其病毒抗原含量為250-1000U/ml，戊型肝炎病毒重組蛋白的含量為5-50ug/ml。
一種用于制備上述甲型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗的方法
(a)在制備最終的甲型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗之前，將甲型肝炎減毒活疫苗病毒和/或甲型肝炎滅活疫苗病毒吸附于氫氧化鋁凝膠，將戊型肝炎病毒重組蛋白吸附于氫氧化鋁凝膠，調(diào)整pH至5.5-9.6；
(b)將調(diào)整了pH的上述組份混合。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點
本發(fā)明的聯(lián)合疫苗可以有效的用于預(yù)防人及動物的甲型肝炎和戊型肝炎。動物實驗表明，甲型肝炎減毒活疫苗和/或甲型肝炎滅活疫苗能夠明顯增加戊型肝炎病毒重組蛋白的免疫原性，戊型肝炎病毒重組蛋白(≤40ug/ml)與甲型肝炎減毒活疫苗和/或甲型肝炎滅活疫苗制備的甲型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗的免疫效果優(yōu)于高劑量的戊型肝炎病毒重組蛋白(＞40ug/ml)與甲型肝炎減毒活疫苗和/或甲型肝炎滅活疫苗制備的甲型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗的免疫效果。因此本發(fā)明提供的聯(lián)合疫苗具有單價疫苗同樣甚至更好的免疫原性。
含有兩種或兩種以上抗原、可以預(yù)防兩種或兩種以上疾病的聯(lián)合疫苗以其方便、多效、低成本成為新一代疫苗研究的熱點。與單一疫苗相比，聯(lián)合疫苗可以減少疫苗的接種次數(shù)，避免因漏種而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐熱，其生產(chǎn)、運輸、儲存、銷售乃至全部使用過程均需在較低溫度下進行，即所謂的“冷鏈”，這種環(huán)環(huán)相扣的冷鏈運作，費用極高，使疫苗成本居高不下。而使用聯(lián)合疫苗，則可以大大降低冷鏈運作的費用，因此具有顯著的優(yōu)越性。
由于本發(fā)明的聯(lián)合疫苗中使用了已經(jīng)充分證明具有良好安全性及免疫原性的甲型肝炎減毒活疫苗和/或甲型肝炎滅活疫苗，所以能夠大大降低聯(lián)合疫苗的生產(chǎn)成本和市場價格。
本發(fā)明也提供了聯(lián)合疫苗的貯藏方法，包括將明膠加入甲型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗，或使用硅涂層的玻璃瓶作為聯(lián)合疫苗的貯藏瓶。優(yōu)選明膠的濃度范圍為0.5-0.7w/v％。
本發(fā)明的甲型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗中，使用的氫氧化鋁凝膠可以購買或采用已知方法進行制備。該佐劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，易于獲得和制備。
根據(jù)本發(fā)明聯(lián)合疫苗的優(yōu)選實施方案，聯(lián)合疫苗中所含的甲型肝炎減毒活疫苗的病毒滴度為5-10LogCCID50/ml和/或甲型肝炎滅活疫苗的病毒抗原含量為250-1000U/ml，戊型肝炎病毒重組蛋白的含量為5-50ug/ml，氫氧化鋁凝膠濃度為0.6-1.5mg/ml。
動物實驗表明，根據(jù)本發(fā)明聯(lián)合疫苗的優(yōu)選實施方案制備的甲型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗能夠誘導機體產(chǎn)生針對甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒的高滴度、特異性抗體，而且體外實驗證實，該聯(lián)合疫苗所誘導的抗體具有明確的中和作用。特別是，甲型肝炎減毒活疫苗和/或甲型肝炎滅活疫苗能夠明顯增加戊型肝炎病毒重組蛋白的免疫原性，戊型肝炎病毒重組蛋白(≤40ug/ml)與甲型肝炎減毒活疫苗和/或甲型肝炎滅活疫苗制備的甲型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗的免疫效果優(yōu)于高劑量的戊型肝炎病毒重組蛋白(＞40ug/ml)與甲型肝炎減毒活疫苗和/或甲型肝炎滅活疫苗制備的甲型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗的免疫效果。因此本發(fā)明提供的聯(lián)合疫苗具有單價疫苗同樣甚至更好的免疫原性。
以往大量的研究證實，位于戊型肝炎病毒開放閱讀框架2羧基端2/3端的氨基酸含有戊型肝炎病毒特異性的中和抗原表位。在此研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)戊型肝炎病毒第4基因型毒株開放閱讀框架2中編碼的474-619位氨基酸為含有戊型肝炎病毒中和抗原表位的最小片段，進而還發(fā)現(xiàn)編碼453-631位氨基酸的優(yōu)選蛋白片段能夠在大腸桿菌中獲得高效表達，能夠誘導機體產(chǎn)生特異性中和抗體。

具體實施例方式
實施例中甲型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗以HAV-HEV或HAV-HEV聯(lián)合疫苗表示。
實施例1
一種HAV-HEV聯(lián)合疫苗，包括戊型肝炎病毒重組蛋白以及甲型肝炎減毒活疫苗或甲型肝炎滅活疫苗，所說的甲型肝炎減毒活疫苗，其病毒滴度為5-10LogCCID50/ml，或甲型肝炎滅活疫苗，其病毒抗原含量為250-1000U/ml，戊型肝炎病毒重組蛋白的含量為5-50ug/ml。
本實施例還包括免疫佐劑，該免疫佐劑為氫氧化鋁凝膠溶液，氫氧化鋁凝膠的濃度范圍調(diào)整為0.6-1.5mg/ml，
上述甲型肝炎減毒活疫苗是甲型肝炎減毒活疫苗L-A-1、H2疫苗株或其他可用疫苗株；甲型肝炎滅活疫苗是甲型肝炎病毒HM175株或其他可用疫苗株；戊型肝炎病毒重組蛋白的氨基末端位于戊型肝炎病毒開放閱讀框架2編碼的380位至480位氨基酸之間，其羧基末端位于580位至650位氨基酸之間或由此氨基酸產(chǎn)生的衍生物，其所述的序列為RGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRPLMTIQQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVCISTYTTNLGSGPVSISAVGVLAPHSALAALEDTVDYPARAHTFDDFCPECRALGLQ
優(yōu)先選用第453位至631位氨基酸序列(p179)。其所述的序列如下VIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVCISTYTTNLGSGPVSISAVGVLAPHSALAVLEDTVDYP
本發(fā)明的HAV-HEV聯(lián)合疫苗還含有0.5-0.7w/v％用量的明膠。
實施例2
一種用于制備上述HAV-HEV聯(lián)合疫苗的方法
(a)在制備最終的HAV-HEV聯(lián)合疫苗之前，將甲型肝炎減毒活疫苗病毒和/或甲型肝炎滅活疫苗病毒吸附于氫氧化鋁凝膠，將戊型肝炎病毒重組蛋白吸附于氫氧化鋁凝膠，調(diào)整pH至5.5-9.6；
(b)將調(diào)整了pH的上述組份混合。
下面進一步舉例說明。
實施例3甲型肝炎減毒活疫苗病毒原液的制備
以含有10％小牛血清的基本培養(yǎng)基(MEM)(pH 7.2-7.6)培養(yǎng)人二倍體成纖維細胞MRC5，細胞形成致密單層后棄去生長培養(yǎng)液，并以Hanks’液反復洗滌細胞后，接種預(yù)先制備的甲型肝炎病毒種子液。34-36℃吸附2小時后，向培養(yǎng)物中補加細胞生長維持液，并于34-36℃培養(yǎng)4周，每周換液1-2次。培養(yǎng)后棄去維持液和殘留的小牛血清，直接加入含3mM NaCl但不含酚紅的199綜合培養(yǎng)液34-36℃繼續(xù)培養(yǎng)3-4天。然后收集細胞，經(jīng)過反復凍融和細胞破碎后離心，收集的上清液即為甲型肝炎減毒活疫苗病毒原液。
實施例4甲型肝炎滅活疫苗病毒原液的制備
按照疫苗制備要求，采用人二倍體成纖維細胞MRC5進行甲型肝炎疫苗株HM175的細胞培養(yǎng)，將培養(yǎng)所得的病毒純化后用福爾馬林滅活，具體制備方法和技術(shù)路線如下
(1)培養(yǎng)人二倍體成纖維細胞MRC5，待細胞長成單層后，用Hanks’液充分洗滌細胞單層，除去殘留的小牛血清，接種甲型肝炎疫苗株HM175，37℃吸附2小時，棄去接種物，再洗滌，然后加入不含小牛血清的培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)，待細胞病變達“+++”時收獲，凍融3次后離心，制備HAV種子批，用空斑試驗滴定其感染滴度，分裝后低溫保存；
(2)如上所述，大量培養(yǎng)甲型肝炎疫苗株HM175，收獲后加入終濃度為1％NP40，凍融3次后離心，收集凍融上清液；
(3)用超濾法濃縮病毒，再用葡聚糖柱層析或密度梯度離心法純化病毒；
(4)純化病毒經(jīng)純度鑒定后，用終濃度1∶4000的福爾馬林滅活，37℃作用15天；
(5)用細胞培養(yǎng)多次傳代的方法檢測有無殘留活病毒，同時對滅活病毒進行蛋白濃度和抗原滴度的測定。
實施例5戊型肝炎病毒重組蛋白的表達和純化
(1)以戊型肝炎病毒IV型中國株基因序列為模板，用引物1(5’-CCC CCCATG GTT ATC CAG GAC TAT GAT AAT C-3’)和引物2(5’-CCC CTC GAG TCAAGG GTA ATC AAC AGT GTC CTC CA-3’)擴增ORF2編碼多肽453-631(p179)的基因片段。PCR條件為94℃-45秒，52℃-45秒，72℃-50秒，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化，克隆入質(zhì)粒載體pET28(a)+中。
(2)將表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達菌株E.coli BL-21(DE3)中，挑取單菌落，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD550＝0.6～0.8，用終濃度為0.2～1.0mMIPTG進行誘導，誘導溫度為37℃，搖床搖速為200rpm，3-4小時后離心收集菌體，用細胞裂解液(50mM Tris-HCl，pH 7.2，300mM NaCl)懸浮菌體沉淀，凍融6次后超聲破碎菌體，離心收集上清液，再用離子交換、葡聚糖層析等方法進行純化，最后使用UV280、SDS-PAGE等方法進行檢測。
實施例6制備甲型肝炎減毒活疫苗病毒和戊型肝炎重組蛋白氫氧化鋁凝膠吸附溶液
為了增加免疫原性，分別將甲型肝炎減毒活疫苗的病毒原液和戊型肝炎病毒重組蛋白吸附于氫氧化鋁凝膠(1)將甲型肝炎減毒活疫苗的病毒原液和氫氧化鋁凝膠攪拌混合；(2)將戊型肝炎重組蛋白和氫氧化鋁凝膠攪拌混合。再將(1)和(2)所得的溶液混合，調(diào)整甲型肝炎減毒活疫苗的病毒滴度為6.5LogCCID50/ml，戊型肝炎重組蛋白濃度為20ug/ml，氫氧化鋁凝膠的濃度為1.0mg/ml；所得的混合溶液即為甲型肝炎減毒活疫苗和戊型肝炎病毒重組蛋白氫氧化鋁凝膠吸附溶液。
實施例7制備甲型肝炎滅活疫苗和戊型肝炎病毒重組蛋白氫氧化鋁凝膠吸附溶液
為了增加免疫原性，分別將甲型肝炎滅活疫苗的病毒原液和戊型肝炎重組蛋白吸附于氫氧化鋁凝膠(1)將甲型肝炎滅活疫苗的病毒原液和氫氧化鋁凝膠攪拌混合；(2)將戊型肝炎重組蛋白和氫氧化鋁凝膠攪拌混合。再將(1)和(2)所得的溶液混合，調(diào)整甲型肝炎滅活疫苗的病毒抗原含量為500U/ml，戊型肝炎重組蛋白濃度為20ug/ml，氫氧化鋁凝膠的濃度為1.0mg/ml；所得的混合溶液即為甲型肝炎滅活疫苗和戊型肝炎病毒重組蛋白氫氧化鋁凝膠吸附溶液。
實施例8減毒HAV-HEV聯(lián)合疫苗的免疫原性實驗
A實驗動物分組和免疫方案
選用6-8周齡的雌性BALB/C純系小鼠240只(揚州大學比較醫(yī)學實驗中心提供)，隨機分為24組，每組10只。A組空白對照組，注射氫氧化鋁凝膠(濃度為1.0mg/ml)，0.1ml/只；B組甲肝減毒活疫苗組，注射甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為3.25LogCCID50/ml)，0.1ml/只；C組甲肝減毒活疫苗組，注射甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為6.5LogCCID50/ml)，0.1ml/只；D組甲肝減毒活疫苗組，注射甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為10LogCCID50/ml)，0.1ml/只；E組戊肝疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(5ug/ml)，0.1ml/只；F組戊肝疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(10ug/ml)，0.1ml/只；G組戊肝疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(20ug/ml)，0.1ml/只；H組戊肝疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(40ug/ml)，0.1ml/只；I組戊肝疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(80ug/ml)，0.1ml/只；J組減毒HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(5ug/ml)+甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為3.25LogCCID50/ml)，0.1ml/只；K組減毒HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(10ug/ml)+甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為3.25LogCCID50/ml)，0.1ml/只；L組減毒HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(20ug/ml)+甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為3.25LogCCID50/ml)，0.1ml/只；M組減毒HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(40ug/ml)+甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為3.25LogCCID50/ml)，0.1ml/只；N組減毒HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(80ug/ml)+甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為3.25LogCCID50/ml)，0.1ml/只；O組減毒HAV-HEY聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(5ug/ml)+甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為6.5LogCCID50/ml)，0.1ml/只；P組減毒HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(10ug/ml)+甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為6.5LogCCID50/ml)，0.1ml/只；Q組減毒HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(20ug/ml)+甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為6.5LogCCID50/ml)，0.1ml/只；R組減毒HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(40ug/ml)+甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為6.5LogCCID50/ml)，0.1ml/只；S組減毒HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(80ug/ml)+甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為6.5LogCCID50/ml)，0.1ml/只；T組減毒HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(5ug/ml)+甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為10LogCCID50/ml)，0.1ml/只；U組減毒HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(10ug/ml)+甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為10LogCCID50/ml)，0.1ml/只；V組減毒HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(20ug/ml)+甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為10LogCCID50/ml)，0.1ml/只；W組減毒HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(40ug/ml)+甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為10LogCCID50/ml)，0.1ml/只；X組減毒HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(80ug/ml)+甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為10LogCCID50/ml)，0.1ml/只；各組實驗動物分別于0、4、6周注射相應(yīng)疫苗三次，其中0周背部皮下多點注射0.1ml相應(yīng)疫苗，4、6周腹腔注射0.05ml相應(yīng)疫苗。
B檢測方法
B-1甲肝抗體體外中和實驗
采用快速空斑中和實驗法檢測甲肝抗體。將1∶1000稀釋的抗血清100ul與含100TCID50/100ul甲肝病毒懸液混合，同時設(shè)對照組，37℃作用1小時后，加入24孔細胞培養(yǎng)板，并加入含10％小牛血清的FRHK4細胞懸液0.4ml/孔(約4×105細胞)，混勻，置CO2培養(yǎng)箱37℃孵育60-90分鐘后吸盡液體，加入含10％小牛血清營養(yǎng)凝膠(含1％瓊脂糖)0.5ml/孔，倒置孵育72小時，再加入中性紅凝膠0.25ml/孔，繼續(xù)孵育72小時，計數(shù)空斑，最后將能減少病毒空斑數(shù)目90％的抗血清判為陽性血清。
B-2戊肝抗體體外中和實驗
采用基于PCR的體外中和實驗方法，將1∶40稀釋的抗血清100ul與含100TCID50/100ul戊肝病毒懸液混合，37℃作用1小時后接種PLC/PRF/5細胞，37℃培養(yǎng)2小時后，Hank’s液洗滌細胞3次，使用Trizol法提取核酸，采用引物3(5’-CCG ACA GAA TTG ATT TCG TCG GC-3’)、引物4(5’-GTT GTC TCG GCCAAT GGC GAG CC-3’)、引物5(5’-TCG GCG GCG GTG AGA GAG AGC CA-3’)、引物6(5’-CCG TAA GTG GAC TGG TCG TAC TC-3’)進行逆轉(zhuǎn)錄-巢式PCR檢測戊型肝炎病毒核酸，巢式PCR條件為第一輪94℃-45秒，50℃-45秒，72℃-50秒，35個循環(huán)，引物為引物3和引物6；第二輪94℃-45秒，52℃-45秒，72℃-50秒，30個循環(huán)，引物為引物4和引物5；PCR陰性判為中和試驗陽性，最后將能中和病毒的抗血清判為陽性血清。
C結(jié)果
C-1如表一所示，使用不同劑量的甲肝減毒活疫苗免疫小鼠的結(jié)果表明，產(chǎn)生陽性血清小鼠的百分數(shù)隨甲肝減毒活疫苗免疫劑量的提高而升高。
表一 不同劑量的甲肝減毒活疫苗誘生小鼠抗HAV陽性血清的結(jié)果
C-2如表二所示，使用不同劑量的戊肝疫苗免疫小鼠的結(jié)果表明，產(chǎn)生陽性血清小鼠的百分數(shù)隨戊肝重組蛋白免疫劑量的提高而升高，當戊肝重組蛋白免疫劑量≥20ug/ml時，全部小鼠均能產(chǎn)生陽性血清。
表二 不同劑量的戊肝重組蛋白誘生小鼠抗HEV陽性血清的結(jié)果
C-3如表三所示，甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為3.25LogCCID50/ml)與不同劑量的戊肝重組蛋白進行聯(lián)合免疫小鼠的結(jié)果表明，B、J、K、L、M組有60％的動物能誘導出抗HAV的陽性血清，N組有30％的動物能誘導出抗HAV的陽性血清。
表三 甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為3.25LogCCID50/ml)與不同劑量的戊肝重組蛋白進行聯(lián)合免疫誘生小鼠抗HAV陽性血清的結(jié)果
C-4如表四所示，甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為6.5LogCCID50/ml)與不同劑量的戊肝重組蛋白進行聯(lián)合免疫小鼠的結(jié)果表明，C、O、P、Q、R組的動物均能誘導出抗HAV的陽性血清，S組只有60％的動物能誘導出抗HAV的陽性血清。
表四 甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為6.5LogCCID50/ml)與不同劑量的戊肝重組蛋白進行聯(lián)合免疫誘生小鼠抗HAV陽性血清的結(jié)果
C-5如表五所示，甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為10LogCCID50/ml)與不同劑量的戊肝重組蛋白進行聯(lián)合免疫小鼠的結(jié)果表明，D、T、U、V、W組的動物均能誘導出抗HAV的陽性血清，X組只有60％的動物能誘導出抗HAV的陽性血清。
表五 甲肝減毒活疫苗(病毒滴度為10LogCCID50/ml)與不同劑量的戊肝重組蛋白進行聯(lián)合免疫誘生小鼠抗HAV陽性血清的結(jié)果
C-6如表六所示，戊肝重組蛋白(5ug/ml)與不同劑量的甲肝減毒活疫苗進行聯(lián)合免疫小鼠的結(jié)果表明，E組有80％的動物能誘導出抗HEV的陽性血清，J、O、T組的動物均能誘導出抗HEV的陽性血清。
表六 戊肝重組蛋白(5ug/ml)與不同劑量的甲肝減毒活疫苗進行聯(lián)合免疫誘生小鼠抗HEV陽性血清的結(jié)果
C-7如表七所示，戊肝重組蛋白(10ug/ml)與不同劑量的甲肝減毒活疫苗進行聯(lián)合免疫小鼠的結(jié)果表明，F(xiàn)組有80％的動物能誘導出抗HEV的陽性血清，K、P、U組的動物均能誘導出抗HEV的陽性血清。
表七 戊肝重組蛋白(10ug/ml)與不同劑量的甲肝減毒活疫苗進行聯(lián)合免疫誘生小鼠抗HEV陽性血清的結(jié)果
C-8如表八所示，戊肝重組蛋白(20ug/ml)與不同劑量的甲肝減毒活疫苗進行聯(lián)合免疫小鼠的結(jié)果表明，G、L、Q、V組的動物均能誘導出抗HEV的陽性血清。
表八 戊肝重組蛋白(20ug/ml)與不同劑量的甲肝減毒活疫苗進行聯(lián)合免疫誘生小鼠抗HEV陽性血清的結(jié)果
C-9如表九所示，戊肝重組蛋白(40ug/ml)與不同劑量的甲肝減毒活疫苗進行聯(lián)合免疫小鼠的結(jié)果表明，H、M、R、W組的動物均能誘導出抗HEV的陽性血清。
表九 戊肝重組蛋白(40ug/ml)與不同劑量的甲肝減毒活疫苗進行聯(lián)合免疫誘生小鼠抗HEV陽性血清的結(jié)果
C-10如表十所示，戊肝重組蛋白(80ug/ml)與不同劑量的甲肝減毒活疫苗進行聯(lián)合免疫小鼠的結(jié)果表明，I、N、S、X組的動物均能誘導出抗HEV的陽性血清。
表十 戊肝重組蛋白(80ug/ml)與不同劑量的甲肝減毒活疫苗進行聯(lián)合免疫誘生小鼠抗HEV陽性血清的結(jié)果
以上的實施例結(jié)果表明，不同劑量的甲肝減毒活疫苗與不同劑量的戊肝重組蛋白進行聯(lián)合免疫小鼠時，不同劑量的甲肝減毒活疫苗均能增強戊肝重組蛋白的免疫效果(表六、表七)；戊肝重組蛋白劑量≤40ug/ml時，對甲肝減毒活疫苗的免疫效果無影響(表三、表四、表五)。
實施例九滅活HAV-HEV聯(lián)合疫苗的免疫原性實驗
A實驗動物分組和免疫方案
選用6-8周齡的雌性BALB/C純系小鼠240只(揚州大學比較醫(yī)學實驗中心提供)，隨機分為24組，每組10只。A組空白對照組，注射氫氧化鋁凝膠(濃度為1.0mg/ml)，0.1ml/只；B組甲肝滅活疫苗組，注射甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為200U/ml)，0.1ml/只；C組甲肝滅活疫苗組，注射甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為500U/ml)，0.1ml/只；D組甲肝滅活疫苗組，注射甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為1000U/ml)，0.1ml/只；E組戊肝疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(5ug/ml)，0.1ml/只；F組戊肝疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(10ug/ml)，0.1ml/只；G組戊肝疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(20ug/ml)，0.1ml/只；H組戊肝疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(40ug/ml)，0.1ml/只；I組戊肝疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(80ug/ml)，0.1ml/只；J組滅活HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(5ug/ml)+甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為200U/ml)，0.1ml/只；K組滅活HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(10ug/ml)+甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為200U/ml)，0.1ml/只；L組滅活HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(20ug/ml)+甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為200U/ml)，0.1ml/只；M組滅活HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(40ug/ml)+甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為200U/ml)，0.1ml/只；N組滅活HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(80ug/ml)+甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為200U/ml)，0.1ml/只；O組滅活HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(5ug/ml)+甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為500U/ml)，0.1ml/只；P組滅活HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(10ug/ml)+甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為500U/ml)，0.1ml/只；Q組滅活HAV-HE聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(20ug/ml)+甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為500U/ml)，0.1ml/只；R組滅活HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(40ug/ml)+甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為500U/ml)，0.1ml/只；S組滅活HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(80ug/ml)+甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為500U/ml)，0.1ml/只；T組滅活HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(5ug/ml)+甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為1000U/ml)，0.1ml/只；U組滅活HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(10ug/ml)+甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為1000U/ml)，0.1ml/只；V組滅活HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(20ug/ml)+甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為1000U/ml)，0.1ml/只；W組滅活HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(40ug/ml)+甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為1000U/ml)，0.1ml/只；X組滅活HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊肝病毒重組蛋白(80ug/ml)+甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為1000U/ml)，0.1ml/只；各組實驗動物分別于0、4、6周注射相應(yīng)疫苗三次，其中0周背部皮下多點注射0.1ml相應(yīng)疫苗，4、6周腹腔注射0.05ml相應(yīng)疫苗。
B檢測方法
B-1甲肝抗體體外中和實驗
采用快速空斑中和實驗法檢測甲肝抗體。將1∶1000稀釋的抗血清100ul與含100TCID50/100ul甲肝病毒懸液混合，同時設(shè)對照組，37℃作用1小時后，加入24孔細胞培養(yǎng)板，并加入含10％小牛血清的FRHK4細胞懸液0.4ml/孔(約4×105細胞)，混勻，置CO2培養(yǎng)箱37℃孵育60-90分鐘后吸盡液體，加入含10％小牛血清營養(yǎng)凝膠(含1％瓊脂糖)0.5ml/孔，倒置孵育72小時，再加入中性紅凝膠0.25ml/孔，繼續(xù)孵育72小時，計數(shù)空斑，最后將能減少病毒空斑數(shù)目90％的抗血清判為陽性血清。
B-2戊肝抗體體外中和實驗
采用基于PCR的體外中和實驗方法，將1∶40稀釋的抗血清100ul與含100TCID50/100ul戊肝病毒懸液混合，37℃作用1小時后接種PLC/PRF/5細胞，37℃培養(yǎng)2小時后，Hank’s液洗滌細胞3次，使用Trizol法提取核酸，采用引物3(5’-CCG ACA GAA TTG ATT TCG TCG GC-3’)、引物4(5’-GTT GTC TCG GCCAAT GGC GAG CC-3’)、引物5(5’-TCG GCG GCG GTG AGA GAG AGC CA-3’)、引物6(5’-CCG TAA GTG GAC TGG TCG TAC TC-3’)進行逆轉(zhuǎn)錄-巢式PCR檢測戊型肝炎病毒核酸，巢式PCR條件為第一輪94℃-45秒，50℃-45秒，72℃-50秒，35個循環(huán)，引物為引物3和引物6；第二輪94℃-45秒，52℃-45秒，72℃-50秒，30個循環(huán)，引物為引物4和引物5；PCR陰性判為中和試驗陽性，最后將能中和病毒的抗血清判為陽性血清。
C結(jié)果
C-1如表一所示，使用不同劑量的甲肝滅活疫苗免疫小鼠的結(jié)果表明，產(chǎn)生陽性血清小鼠的百分數(shù)隨甲肝滅活疫苗免疫劑量的提高而升高。
表一 不同劑量的甲肝滅活疫苗誘生小鼠抗HAV陽性血清的結(jié)果
C-2如表二所示，使用不同劑量的戊肝疫苗免疫小鼠的結(jié)果表明，產(chǎn)生陽性血清小鼠的百分數(shù)隨戊肝重組蛋白免疫劑量的提高而升高，當戊肝重組蛋白免疫劑量≥20ug/ml時，全部小鼠均能產(chǎn)生陽性血清。
表二 不同劑量的戊肝重組蛋白誘生小鼠抗HEV陽性血清的結(jié)果
C-3如表三所示，甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為200U/ml)與不同劑量的戊肝重組蛋白進行聯(lián)合免疫小鼠的結(jié)果表明，B、J、K、L、M組有60％的動物能誘導出抗HAV的陽性血清，N組有30％的動物能誘導出抗HAV的陽性血清。
表三 甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為200U/ml)與不同劑量的戊肝重組蛋白進行聯(lián)合免疫誘生小鼠抗HAV陽性血清的結(jié)果
C-4如表四所示，甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為500U/ml)與不同劑量的戊肝重組蛋白進行聯(lián)合免疫小鼠的結(jié)果表明，C、O、P、Q、R組的動物均能誘導出抗HAV的陽性血清，S組只有60％的動物能誘導出抗HAV的陽性血清。
表四 甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為500U/ml)與不同劑量的戊肝重組蛋白進行聯(lián)合免疫誘生小鼠抗HAV陽性血清的結(jié)果
C-5如表五所示，甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為1000U/ml)與不同劑量的戊肝重組蛋白進行聯(lián)合免疫小鼠的結(jié)果表明，D、T、U、V、W組的動物均能誘導出抗HAV的陽性血清，X組只有60％的動物能誘導出抗HAV的陽性血清。
表五 甲肝滅活疫苗(病毒抗原含量為1000U/ml)與不同劑量的戊肝重組蛋白進行聯(lián)合免疫誘生小鼠抗HAV陽性血清的結(jié)果
C-6如表六所示，戊肝重組蛋白(5ug/ml)與不同劑量甲肝滅活疫苗進行聯(lián)合免疫小鼠的結(jié)果表明，E組有80％的動物能誘導出抗HEV的陽性血清，J、O、T組的動物均能誘導出抗HEV的陽性血清。
表六 戊肝重組蛋白(5ug/ml)與不同劑量的甲肝滅活疫苗進行聯(lián)合免疫誘生小鼠抗HEV陽性血清的結(jié)果
C-7如表七所示，戊肝重組蛋白(10ug/ml)與不同劑量甲肝滅活疫苗進行聯(lián)合免疫小鼠的結(jié)果表明，F(xiàn)組有80％的動物能誘導出抗HEV的陽性血清，K、P、U組的動物均能誘導出抗HEV的陽性血清。
表七 戊肝重組蛋白(10ug/ml)與不同劑量的甲肝滅活疫苗進行聯(lián)合免疫誘生小鼠抗HEV陽性血清的結(jié)果
C-8如表八所示，戊肝重組蛋白(20ug/ml)與不同劑量的甲肝滅活疫苗進行聯(lián)合免疫小鼠的結(jié)果表明，G、L、Q、V組的動物均能誘導出抗HEV的陽性血清。
表八 戊肝重組蛋白(20ug/ml)與不同劑量的甲肝滅活疫苗進行聯(lián)合免疫誘生小鼠抗HEV陽性血清的結(jié)果
C-9如表九所示，戊肝重組蛋白(40ug/ml)與不同劑量的甲肝滅活疫苗進行聯(lián)合免疫小鼠的結(jié)果表明，H、M、R、W組的動物均能誘導出抗HEV的陽性血清。
表九 戊肝重組蛋白(40ug/ml)與不同劑量的甲肝滅活疫苗進行聯(lián)合免疫誘生小鼠抗HEV陽性血清的結(jié)果
C-10如表十所示，戊肝重組蛋白(80ug/ml)與不同劑量的甲肝滅活疫苗進行聯(lián)合免疫小鼠的結(jié)果表明，I、N、S、X組的動物均能誘導出抗HEV的陽性血清。
表十 戊肝重組蛋白(80ug/ml)與不同劑量的甲肝滅活疫苗進行聯(lián)合免疫誘生小鼠抗HEV陽性血清的結(jié)果
以上的實驗結(jié)果表明，不同劑量的甲肝滅活疫苗與不同劑量的戊肝重組蛋白進行聯(lián)合免疫小鼠時，不同劑量的甲肝滅活疫苗均能增強戊肝重組蛋白的免疫效果(表六)；戊肝重組蛋白劑量≤40ug/ml時，對甲肝滅活疫苗的免疫效果無影響(表三、表四、表五)。
實施例10減毒HAV-HEV聯(lián)合疫苗和滅活HAV-HEV聯(lián)合疫苗的免疫原性比較
A實驗動物分組和免疫方案
選用6-8周齡雌性BALB/C純系小鼠20只(揚州大學比較醫(yī)學實驗中心提供)，隨機分為2組，每組10只，A組減毒HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊型肝炎病毒重組蛋白(20ug/ml)+甲型肝炎減毒活疫苗(病毒滴度為6.5LogCCID50/ml)，0.1ml/只；B組滅活HAV-HEV聯(lián)合疫苗組，注射戊型肝炎病毒重組蛋白(20ug/ml)+甲型肝炎滅活疫苗(病毒抗原含量為500U/ml)，0.1ml/只。各組實驗動物分別于0、4、6周注射相應(yīng)疫苗三次，其中0周背部皮下多點注射0.1ml相應(yīng)疫苗，4、6周腹腔注射0.05ml相應(yīng)疫苗。
B檢測方法
B-1甲肝抗體體外中和實驗
采用快速空斑中和實驗法檢測甲肝抗體。將1∶1000稀釋的抗血清100ul與含100TCID50/100ul甲肝病毒懸液混合，同時設(shè)對照組，37℃作用1小時后，加入24孔細胞培養(yǎng)板，并加入含10％小牛血清的FRHK4細胞懸液0.4ml/孔(約4×105細胞)，混勻，置CO2培養(yǎng)箱37℃孵育60-90分鐘后吸盡液體，加入含10％小牛血清營養(yǎng)凝膠(含1％瓊脂糖)0.5ml/孔，倒置孵育72小時，再加入中性紅凝膠0.25ml/孔，繼續(xù)孵育72小時，計數(shù)空斑，最后將能減少病毒空斑數(shù)目90％的抗血清判為陽性血清。
B-2戊肝抗體體外中和實驗
采用基于PCR的體外中和實驗方法，將1∶40稀釋的抗血清100ul與含100TCID50/100ul戊肝病毒懸液混合，37℃作用1小時后接種PLC/PRF/5細胞，37℃培養(yǎng)2小時后，Hank’s液洗滌細胞3次，使用Trizol法提取核酸，采用引物3(5’-CCG ACA GAA TTG ATT TCG TCG GC-3’)、引物4(5’-GTT GTC TCG GCCAAT GGC GAG CC-3’)、引物5(5’-TCG GCG GCG GTG AGA GAG AGC CA-3’)、引物6(5’-CCG TAA GTG GAC TGG TCG TAC TC-3’)進行逆轉(zhuǎn)錄-巢式PCR檢測戊型肝炎病毒核酸，巢式PCR條件為第一輪94℃-45秒，50℃-45秒，72℃-50秒，35個循環(huán)，引物為引物3和引物6；第二輪94℃-45秒，52℃-45秒，72℃-50秒，30個循環(huán)，引物為引物4和引物5；PCR陰性判為中和試驗陽性，最后將能中和病毒的抗血清判為陽性血清。
C結(jié)果
結(jié)果如表一、表二所示，使用該方案中的減毒HAV-HEV聯(lián)合疫苗(A組)和滅活HAV-HEV聯(lián)合疫苗(B組)的免疫結(jié)果表明，A組和B組的實驗動物均能誘導出抗HAV、抗HEV的陽性血清。
表一 不同組進行免疫誘生小鼠抗HAV陽性血清的結(jié)果
表二 不同組進行免疫誘生小鼠抗HEV陽性血清的結(jié)果
實施例11明膠的使用
為了增加所制備的HAV-HEV聯(lián)合疫苗的穩(wěn)定性，加入終濃度為0.5-0.7w/v％的明膠，結(jié)果在2-8℃貯藏3個月后沒有觀察到疫苗的聚集和對貯存用玻璃瓶的黏附。
權(quán)利要求
1、一種甲型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗，其特征在于包括戊型肝炎病毒重組蛋白以及甲型肝炎減毒活疫苗或甲型肝炎滅活疫苗，所說的甲型肝炎減毒活疫苗，其病毒滴度為5-10LogCCID50/ml，所說的甲型肝炎滅活疫苗，其病毒抗原含量為250-1000U/ml，戊型肝炎病毒重組蛋白的含量為5-50ug/ml。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗，其特征在于包括免疫佐劑，該免疫佐劑為氫氧化鋁凝膠溶液，氫氧化鋁凝膠的濃度范圍調(diào)整為0.6-1.5mg/ml。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗，其特征在于甲型肝炎減毒活疫苗的病毒是L-A-1、H2減毒疫苗株或其他可用疫苗株。
4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗，其特征在于甲型肝炎滅活疫苗的病毒是HM175疫苗株或其他可用疫苗株。
5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗，其特征在于戊型肝炎病毒重組蛋白的氨基末端位于其開放閱讀框架2編碼蛋白的380位至480位氨基酸之間，其羧基末端位于580位至650位氨基酸之間或由此蛋白片段產(chǎn)生的衍生物。
6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗，其特征在于含有0.5-0.7w/v％用量的明膠。
7、一種用于制備權(quán)利要求1所述甲型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗的方法，其特征在于
(a)在制備最終的甲型肝炎-戊型肝炎聯(lián)合疫苗之前，將甲型肝炎減毒活疫苗病毒和/或甲型肝炎滅活疫苗病毒吸附于氫氧化鋁凝膠，將戊型肝炎病毒重組蛋白吸附于氫氧化鋁凝膠，調(diào)整pH至5.5-9.6；
(b)將調(diào)整了pH的上述組份混合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甲型肝炎－戊型肝炎聯(lián)合疫苗，包括戊型肝炎病毒重組蛋白以及甲型肝炎減毒活疫苗或甲型肝炎滅活疫苗；一種用于制備上述甲型肝炎－戊型肝炎聯(lián)合疫苗的方法在制備最終的甲型肝炎－戊型肝炎聯(lián)合疫苗之前，將甲型肝炎減毒活疫苗病毒和/或甲型肝炎滅活疫苗病毒吸附于氫氧化鋁凝膠，將戊型肝炎病毒重組蛋白吸附于氫氧化鋁凝膠，將調(diào)整了pH的上述組份混合。本發(fā)明具有方便、多效、低成本、并能夠有效預(yù)防人及動物甲型肝炎和戊型肝炎等優(yōu)點。
文檔編號A61P31/00GK1883704SQ20051004073
公開日2006年12月27日 申請日期2005年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月24日
發(fā)明者孟繼鴻, 戴星, 董晨 申請人:東南大學