專利名稱：多肽片段組合物及其在制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽片段組合物及其在制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合癥(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)，又稱為豬藍(lán)耳病，在1987年首次發(fā)現(xiàn)于美國，而后迅速傳播到加拿大。在歐洲，1990 年首次爆發(fā)于德國，然后是挪威、比利時、西班牙、英國、法國和丹麥。如今這種疾病已經(jīng)傳播到世界各地，包括南美洲、北美洲、歐洲和亞洲。最近，在我國出現(xiàn)了高毒力變異株，它是由PRRS病毒(PRRSV)引起的豬的一種高度傳染病，可引起母豬的繁殖障礙、各年齡豬發(fā)生呼吸道癥狀以及仔豬死亡，此外還可以導(dǎo)致免疫抑制從而誘發(fā)繼發(fā)感染，對全世界的養(yǎng)豬業(yè)都造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV屬于動脈炎病毒屬，根據(jù)病毒抗原的抗原性、基因組及致病性差異，PRRSV 可分為2個型，即歐洲型(LV株為代表)和美洲型(VR2332株為代表)。病毒粒子中含有一個核衣殼，核衣殼由正鏈RNA基因組和核衣殼蛋白(N)組成，核衣殼外邊被一層囊膜包裹; 病毒的囊膜含有6種病毒結(jié)構(gòu)蛋白小囊膜蛋白(E)、膜蛋白(M)以及N-糖基化蛋白GP2、 GP3、GP4禾口 GP5。M、N禾口 GP5三種蛋白是PRRS病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，E、GP2、GP3禾口 GP4是次要結(jié)構(gòu)蛋白。M蛋白和GP5以二硫鍵相連的異源二聚體的形式存在于囊膜中，而次要結(jié)構(gòu)蛋白E、GP2、GP3和GP4則可能是以非共價鍵結(jié)合在一起形成異源多聚體。目前對關(guān)于PRRS的免疫機(jī)制缺乏系統(tǒng)的了解，但不少學(xué)者認(rèn)為體液免疫(尤其是中和抗體)和T細(xì)胞介導(dǎo)免疫在清除機(jī)體PRRSV感染方面發(fā)揮主導(dǎo)作用。PRRSV感染豬后會在一定時期內(nèi)抑制宿主的天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)，尤其是抑制PRRSV特異性細(xì)胞免疫，使機(jī)體不能在感染早期及時清除病毒，從而造成病毒在機(jī)體內(nèi)的持續(xù)性感染。研究表明，Nsp9、Gp3、Gp4、Gp5、M和N等蛋白在介導(dǎo)T細(xì)胞免疫上發(fā)揮著重要功能。疫苗接種是預(yù)防PRRS最有效的方法，國內(nèi)外已有商業(yè)化的PRRS疫苗，包括弱毒疫苗和滅活疫苗。但是，弱毒疫苗在提供免疫保護(hù)的同時，還會持續(xù)散播疫苗病毒，使得病毒在豬場中循環(huán)存在，可能發(fā)生重組變異等，并存在著毒力返強(qiáng)等不安全性問題，有時甚至引發(fā)PRRS爆發(fā)。而滅活疫苗存在著免疫劑量大、免疫次數(shù)多、免疫產(chǎn)生周期長，不能對非疫苗株型的病毒侵染提供免疫保護(hù)等缺點，不太適合仔豬免疫，而仔豬帶毒是豬場PRRSV持續(xù)存在的重要原因。所以，通過弱毒疫苗或滅活疫苗難以控制和根除PRRSV在豬場的存在和流行。隨著近年來學(xué)者們對PRRSV本身以及病毒與動物的免疫應(yīng)答機(jī)制的深入研究，提供一種能克服PRRS滅活疫苗和弱毒疫苗的缺點，并同時啟動機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答的疫苗，已成為當(dāng)前PRRS疫苗的研究熱點，諸如基因工程疫苗(病毒載體、質(zhì)粒載體及細(xì)菌載體等載體疫苗)、亞單位疫苗等。而采用化學(xué)合成抗原表位(B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位)氨基酸序列的方法制備具保護(hù)作用的化學(xué)合成多肽疫苗，不含核酸，是最為理想的安全性疫苗，也是目前研制預(yù)防和控制感染性疾病的主要方向之一?；瘜W(xué)合成表位肽疫苗在口蹄疫的防治上已經(jīng)取得了顯著的成果。研制PRRS合成肽疫苗的關(guān)鍵之處在病毒組成蛋白上尋找可啟動機(jī)體細(xì)胞免疫和/或體液免疫的抗原決定簇(即T細(xì)胞抗原表位和B細(xì)胞抗原表位)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供多肽片段組合物及其在制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的多肽片段組合物，為序列表的序列1所示的多肽、序列表的序列2所示的多肽、序列表的序列3所示的多肽、序列表的序列4所示的多肽、序列表的序列5所示的多肽和序列表的序列6所示的多肽。多肽I (序列表的序列 1) :TMPPGFELYGGGGSGGGGSFLLVGFKCF ；多肽II (序列表的序列幻:CLLPSLLAIGGGGSGGGGSLAALICFVIRLAKNC ；多肽III(序列表的序列；3) :KGRLYRWRSPVIVEKGGGGSGGGGSCNDSTAPQKVLLAFS ；多肽IV(序列表的序列 4) :ALKVSRGRLLGLLHLGGGGSGGGGSFGYMTFVHFESTNRV ；多肽V (序列表的序列幻KFITSRCRLCLLGRKGGGGSGGGGSNPEKPHFPL ；多肽VI(序列表的序列 6) :VRHHFTPSEGGGGSGGGGSFSLPTQHTVRLIRATAS。所述多肽片段組合物中，所述各種多肽可等質(zhì)量混合后包裝，也可單獨(dú)包裝，使用時再等質(zhì)量混合。所述多肽片段組合物可用于制備預(yù)防和/或治療豬繁殖與呼吸綜合征的疫苗。所述多肽片段組合物和APP-N蛋白可用于制備預(yù)防和/或治療豬繁殖與呼吸綜合征的疫苗；所述APP-N蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有促進(jìn)免疫活性的功能的由序列7衍生的蛋白質(zhì)。所述APP-N蛋白具體可為如下1)或2)或3)的DNA分子編碼的蛋白1)序列表中序列8所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有促進(jìn)免疫活性的功能的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有促進(jìn)免疫活性的功能的DNA分子。本發(fā)明還保護(hù)一種預(yù)防和/或治療豬繁殖與呼吸綜合征的疫苗，它的活性成分為所述多肽片段組合物。所述多肽片段組合物中，所述各種多肽可等質(zhì)量混合后包裝，也可單獨(dú)包裝，使用時再等質(zhì)量混合。本發(fā)明還保護(hù)另一種預(yù)防和/或治療豬繁殖與呼吸綜合征的疫苗，它的活性成分為所述多肽片段組合物和所述APP-N蛋白。所述多肽片段組合物中，所述各種多肽可等質(zhì)量混合后包裝，也可單獨(dú)包裝，使用時再等質(zhì)量混合。所述活性成分中，所述各種多肽與所述APP-N蛋白均可等質(zhì)量混合后包裝，也均可單獨(dú)包裝，使用時再等質(zhì)量混合。以上任一所述的疫苗中還可含有佐劑，如白油。
以上任一所述的疫苗具體可由所述活性成分、水和白油組成。所述疫苗中，所述多肽I、所述多肽II、所述多肽III1、所述多肽IV、所述多肽V和所述多肽VI的濃度均為 0. 05mg/ml，所述白油的濃度為50% (體積比)。所述疫苗中，所述多肽I、所述多肽II、所述多肽III1、所述多肽IV、所述多肽V、所述多肽VI和所述APP-N蛋白的濃度均為0. 05mg/ml, 所述白油的濃度為50% (體積比)。以上任一所述的豬繁殖與呼吸綜合征具體可為PRRSV病毒VR2332毒株引發(fā)的豬繁殖與呼吸綜合征。以上任一所述疫苗的推薦免疫方法為分別第1天、第15天、第四天進(jìn)行免疫；免疫方式肌肉注射；每頭豬的單次免疫劑量2ml。本發(fā)明提供了一種多肽片段組合物，本發(fā)明提供的多肽片段組合物可以作為豬繁殖與呼吸綜合征合疫苗的活性成分，對于豬繁殖與呼吸綜合征的防治具有重大應(yīng)用價值。 本發(fā)明提供的疫苗，可以有效應(yīng)對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的抗原變異，且不存在生物安全性問題，易于大規(guī)合成，具有良好的應(yīng)用前景。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。白油購自北京信得威特生物技術(shù)公司。PRRSV病毒VR2332毒株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。實施例1、多肽片段和APP-N蛋白的合成一、多肽片段的合成設(shè)計六條多肽片段(均為T細(xì)胞抗原表位)，序列如下(由氮末端至碳末端)多肽I (序列表的序列 1) :TMPPGFELYGGGGSGGGGSFLLVGFKCF ；多肽II (序列表的序列幻:CLLPSLLAIGGGGSGGGGSLAALICFVIRLAKNC ；多肽III(序列表的序列；3) :KGRLYRWRSPVIVEKGGGGSGGGGSCNDSTAPQKVLLAFS ；多肽IV(序列表的序列 4) :ALKVSRGRLLGLLHLGGGGSGGGGSFGYMTFVHFESTNRV ；多肽V (序列表的序列幻KFITSRCRLCLLGRKGGGGSGGGGSNPEKPHFPL ；多肽VI(序列表的序列 6) VRHHFTPSEGGGGSGGGGSFSLPTQHTVRLIRATAS ；分別化學(xué)合成以上六條多肽。二、APP-N蛋白的合成APP-N蛋白是一種免疫增強(qiáng)劑，如序列表的序列7所示，其編碼基因(APP-N基因)如序列表的序列8所示。APP-N蛋白相關(guān)專利的申請日為2010年4月2日，申請?zhí)枮?201010140598. 6。1、酵母表達(dá)載體APP/pPICZ α A的構(gòu)建由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成序列8所示的APP-N基因，然后用如下引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引入Bio I和)(ba I酶切識別位點APP-F :5’ -CATCTCGAGGAGGATGAAGTGGATGTGG-3，；
5
APP-R 5，-CATTCTAGAGTATTCATCATCTTCTACTTCCTTTG-3，。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Bio I和)(ba I雙酶切后插入pPICZaA(購自上海普飛生物技術(shù)有限公司，V19520)的B10 I和)(ba I酶切位點之間，電轉(zhuǎn)化酵母菌株SMD1168H(購自美國invitrogen公司，C18400)，將轉(zhuǎn)化子鋪于含zeocin(購自美國 invitrogen公司，C19840) 100 μ g/mL的YPDS (含1 %酵母提取物，2 %酵母培養(yǎng)用胰化蛋白胨，2 %葡萄糖，IM山梨醇，2 %瓊脂)平板，42 V培養(yǎng)2-3天，直至長出單菌落，經(jīng)PCR鑒定后獲得陽性重組菌。將陽性重組菌提取質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果表明得到了重組質(zhì)粒APP-N/ pPICZ α A (在pPICZ α A的Xho I和Xba I酶切位點之間插入序列表的序列8所示的APP-N 基因)。將含有重組質(zhì)粒APP-N/pPICZ α A的酵母菌株SMDl 168H命名為重組菌SMD-APP-N/ pPICZαA。2、APP-N在酵母中的表達(dá)將重組菌SMD-APP-N/pPICZ α A先接種于BMGY液體培養(yǎng)基中，42 °C培養(yǎng) 18h (18-20h均可)，待OD600值為4時(2-6均可)，1500g離心5分鐘收集菌體；在BMMY液體培養(yǎng)基中，將菌體在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)使其0D_值達(dá)到1. O ；然后每M小時加入終濃度為0.5% (體積百分含量)的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，30°C誘導(dǎo)48小時。3、取5L步驟2得到的發(fā)酵液，IOOOOg離心10分鐘，收集菌體；將菌體用TE緩沖液洗滌后超聲破菌，然后用PBS緩沖液洗滌包涵體，用6M鹽酸胍水溶液溶解包涵體；用PBS 緩沖液進(jìn)行透析后離心取上清。4、將步驟3的上清液用醋酸調(diào)節(jié)pH值為4. 8 ；過陰離子交換層析柱(層析柱為 Capto Q，購自GE Healthcare ；陰離子交換層析柱填充物為高效瓊脂糖和右旋糖苷混合物； 柱長為10cm、柱子的內(nèi)徑為0. 77cm)，收集目標(biāo)洗脫峰分子篩層析柱(分子篩為SuperDex 75，購自GE Healthcare ;S印hacryl分子篩層析柱填充物為右旋糖苷交聯(lián)表氯醇；柱長為50cm、柱子的內(nèi)徑為1. 5cm)，收集目標(biāo)洗脫峰；過濾除菌后冷凍干燥即為 APP-N蛋白。陰離子交換層析包括如下步驟以Tris-Cl緩沖液QOmM，pH8. 0)作為起始液，以 NaCl濃度為IM的Tris-Cl緩沖液(20mM，pH8. 0)作為終止液，進(jìn)行線性梯度洗脫，洗脫時間為1小時，所述洗脫過程中NaCl濃度梯度變化速率恒定，每次收集Iml洗脫液，收集NaCl 濃度為0. 25M的Tris-Cl緩沖液所洗脫下來的溶液。分子篩層析包括如下步驟以NaCl濃度為150mM的Tris-Cl緩沖液(20mM，pH7. 5) 進(jìn)行，進(jìn)行時間為1小時，所述進(jìn)行過程中NaCl濃度恒定(在16ml處開始收取洗脫液，共收集5ml)。實施例2、疫苗的制備一、疫苗甲的制備1、用注射用水(無菌水)將實施例1制備的多肽I、多肽II、多肽III、多肽IV、多肽 V和多肽VI分別稀釋至1. 2mg/ml，然后等體積混合，制成水相抗原(6種多肽片段在水相抗原中的濃度均為0. 2mg/ml)。2、用注射用水(無菌水)將實施例1制備的APP-N蛋白(佐劑)稀釋至蛋白濃度為0. 2mg/ml,即為蛋白佐劑水相。3、在6°C條件下G 8°C均可)，將步驟1的水相抗原和步驟2的蛋白佐劑水相等體積混合，在混勻儀上按照50轉(zhuǎn)/分慢速混勻結(jié)合2小時，即為水相佐劑-抗原免疫原 (APP-N蛋白的濃度為100μ g/ml、多肽I的濃度為0. lmg/ml、多肽II的濃度為0. lmg/ml、多肽III的濃度為0. lmg/ml、多肽IV的濃度為0. lmg/ml、多肽V的濃度為0. lmg/ml、多肽VI的濃度為 0. lmg/ml)。4、在6°C條件下G 8°C均可)，將步驟3的水相佐劑-抗原免疫原和白油(佐劑)等體積混合，將混合物加入乳化管內(nèi)，在組織勻漿器下1500轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?0秒，即為白油-APP-抗原免疫原(又稱疫苗甲)。二、疫苗乙的制備1、用注射用水(無菌水)將實施例1制備的多肽I、多肽II、多肽III、多肽IV、多肽 V和多肽VI分別稀釋至0. 6mg/ml，然后等體積混合，制成水相抗原(6種多肽片段在水相抗原中的濃度均為0. lmg/ml)。2、在6°C條件下G 8°C均可)，將步驟1的水相抗原和白油(佐劑)等體積混合，將混合物加入乳化管內(nèi)，在組織勻漿器下1500轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?0秒，即為白油-抗原免疫原(又稱疫苗乙)。三、對照品甲的制備1、用注射用水(無菌水)將實施例1制備的APP-N蛋白(佐劑)稀釋至0. Img/ ml，即為蛋白佐劑水相。2、在6°C條件下G 8°C均可)，將步驟1的蛋白佐劑水相和白油(佐劑)等體積混合，將混合物加入乳化管內(nèi)，在組織勻漿器下1500轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?0秒，即為對照品甲。四、對照品乙的制備將注射用水(無菌水)作為對照品乙。實施例3、疫苗的效力實驗一、實驗動物50頭6周齡且PRRSV抗原、抗體雙陰性的健康豬(品種為長白豬，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所昌平動物實驗基地)。二、應(yīng)用疫苗免疫動物將實驗動物隨機(jī)分成5組，每組10只，分別進(jìn)行如下免疫第1組(實驗組甲)采用實施例2制備的疫苗甲進(jìn)行免疫；第2組(實驗組乙)采用實施例2制備的疫苗乙進(jìn)行免疫；第3組(陰性對照組)采用實施例2制備的對照品甲進(jìn)行免疫；第4組(空白對照組)采用實施例2制備的對照品乙進(jìn)行免疫；第5組(陽性對照組)采用PRRS市售疫苗進(jìn)行免疫；PRRS市售疫苗購自齊魯動物保健品有限公司，獸藥生字4200 080011054，為50ml/瓶的包裝(每ml病毒含量為彡 2 X IO7 0TCID50)。各組的免疫過程均為分別在實驗的第1天、第15天、第四天進(jìn)行免疫；免疫方式肌肉注射；每頭豬的單次免疫劑量2ml。三、淋巴細(xì)胞增殖實驗實驗的第43天，每頭豬分別采集全血，分離外周血單核淋巴細(xì)胞(PBMC)，進(jìn)行如下淋巴細(xì)胞增殖實驗
PBMC懸于含有IOmM HEPES、抗生素(青霉素和鏈霉素各100U/ml)和10% (體積百分含量)胎牛血清(ras)的raiM-1640培養(yǎng)基中，經(jīng)細(xì)胞計數(shù)后，均分至96孔板中QXlO6 個細(xì)胞/孔)，于含5% (X)2的37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24小時后加入滅活的PRRSV病毒 VR2332毒株作為刺激物，同時以Marc-145細(xì)胞(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)作為陰性對照的刺激物。培養(yǎng)72小時后加入MTT (20uL/孔)，培養(yǎng)5小時后再加入DMSO (150uL/孔)，混勻10分鐘測定570nm吸光值，計算刺激因子Si。SI = 0D570值(樣本孔-空白孔)/0D570 值(陰性孔-空白孔)。結(jié)果見表1。表1淋巴細(xì)胞增殖實驗刺激系數(shù)
權(quán)利要求
1.多肽片段組合物，為序列表的序列1所示的多肽、序列表的序列2所示的多肽、序列表的序列3所示的多肽、序列表的序列4所示的多肽、序列表的序列5所示的多肽和序列表的序列6所示的多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽片段組合物，其特征在于所述多肽片段組合物中，各種所述多肽的質(zhì)量均相等。
3.權(quán)利要求1或2所述多肽片段組合物在制備預(yù)防和/或治療豬繁殖與呼吸綜合征的疫苗中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1或2所述多肽片段組合物和APP-N蛋白在制備預(yù)防和/或治療豬繁殖與呼吸綜合征的疫苗中的應(yīng)用；所述APP-N蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有促進(jìn)免疫活性的功能的由序列7衍生的蛋白質(zhì)。
5.一種預(yù)防和/或治療豬繁殖與呼吸綜合征的疫苗，它的活性成分為權(quán)利要求1所述多肽片段組合物。
6.如權(quán)利要求5所述的疫苗，其特征在于所述多肽片段組合物中，各種所述多肽的質(zhì)量均相等。
7.一種預(yù)防和/或治療豬繁殖與呼吸綜合征的疫苗，它的活性成分為權(quán)利要求1所述多肽片段組合物和APP-N蛋白；所述APP-N蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列7的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有促進(jìn)免疫活性的功能的由序列7衍生的蛋白質(zhì)。
8.如權(quán)利要求7所述的疫苗，其特征在于所述多肽片段組合物中，各種所述多肽的質(zhì)量均相等。
9.如權(quán)利要求8所述的疫苗，其特征在于每種所述多肽的質(zhì)量均與所述APP-N蛋白的質(zhì)量相等。
10.如權(quán)利要求5至9中任一所述的疫苗，其特征在于所述疫苗還含有佐劑，所述佐劑優(yōu)選為白油。
全文摘要
本發(fā)明公開了多肽片段組合物及其在制備豬繁殖與呼吸綜合征疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的多肽片段組合物，為序列表的序列1所示的多肽、序列表的序列2所示的多肽、序列表的序列3所示的多肽、序列表的序列4所示的多肽、序列表的序列5所示的多肽和序列表的序列6所示的多肽。本發(fā)明提供的多肽片段組合物均可以作為豬繁殖與呼吸綜合征合疫苗的活性成分，對于豬繁殖與呼吸綜合征的防治具有重大應(yīng)用價值。本發(fā)明提供的疫苗，可以有效應(yīng)對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的抗原變異，且不存在生物安全性問題，易于大規(guī)合成，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號A61K39/00GK102321180SQ20111022982
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月11日
發(fā)明者劉文軍, 李晶, 楊利敏, 陳才偉 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所