專利名稱：：一種鴨病毒性肝炎滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種鴨病毒性肝炎滅活疫苗及其制備方法，屬于獸醫(yī)生物制品
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：鴨病毒性肝炎(DuckViralH印atitis，DVH)是由鴨肝炎病毒(或稱鴨病毒性肝炎病毒)(Duckh印atitisvirus,DHV)引起的雛鴨的一種高度致死性、傳播迅速的病毒性疾病，其特征是病程短促，臨床表現(xiàn)角弓反張，病變主要為肝臟腫大并有出血斑點。DVH不僅引起雛鴨發(fā)病，死亡率高，而且使成年鴨呈隱性感染，向外排毒，成為病原的傳播者。在疾病嚴重爆發(fā)時，雛鴨死亡速度驚人，對該病如果不進行及時的控制，會給養(yǎng)鴨業(yè)帶來極大的經(jīng)濟損失。鴨肝炎病毒的病毒顆粒無囊膜，屬于微RNA病毒科。病毒粒子呈二十面體對稱，直徑2040nm，在電子顯微鏡下從肝臟超薄切片上觀察到34nm的顆粒，目前對于鴨病毒性肝炎的分子生物學(xué)的研究相對較少。鴨肝炎病毒有3個血清型，即I、II、III型，3個血清型都可引起鴨病毒性肝炎，但是目前普遍存在的鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒I型引起的。據(jù)報道，n型病毒與i型病毒無抗原相關(guān)性；m型病毒與i型病毒之間無抗原關(guān)系。郭玉璞等根據(jù)病毒中和實驗和血清被動保護實驗結(jié)果，證實我國流行的DHV病原為I型鴨肝炎病毒。DHV-I型對外界環(huán)境的抵抗力特別強，可耐受乙醚、碳氟化合物、氯仿、胰酶及30%的甲醇和硫酸錢的處理，具有一定的熱穩(wěn)定性，在37"C條件下可存活21d，56。C加熱23h才能使其完全失活，一些常用消毒劑對該病毒滅活效果也不明顯。I型鴨病毒性肝炎，Levine和Hofstad于1945年在美國首次發(fā)現(xiàn)該病(Levine，P.P.，andM.S.Hofstad.1945.Duckdiseaseinvestigation.AnnuRepNewYorkStateVetCollIthaca,pp.5556)，1950年，Levine和Fabricant在紐約長島首次用雞胚分離出I型鴨肝炎病毒(Levine,P.P，andJ.Fabricant.1950.Ahitherto-undescribedvirusdiseaseofducksinNorthAmerica.CornellVet40:7186)。1954年，AsplinJ艮道了英國爆發(fā)流行病毒性肝炎(Asplin，F(xiàn).D.1965.Duckhepatitis:vaccinationagainsttwoserologicaltypes.VetRec77:1529-1530)，隨后德國、加拿大、法國、日本等國相繼報道了DHV的流行。在我國，1963年，黃均建最早于上海報道了DVH的發(fā)生(黃均建等.小鴨病毒性肝炎研究.1963.上海農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所單行本)，1980年，北京大學(xué)王平等報道了北京地區(qū)DVH的流行(王平等.北京小鴨病毒性肝炎的研究(一)診斷與防治，北京大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報.1980.1:56-74)。目前我國還沒有商品化的鴨病毒性肝炎疫苗。近年來，不斷有使用I型鴨病毒性肝炎弱毒疫苗或高免卵黃抗體進行預(yù)防或治療無效的鴨群爆發(fā)疑似鴨病毒性肝炎，使得防制鴨肝炎病毒感染的難度不斷增大。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是利用本發(fā)明人由野外分離到的一株擁有優(yōu)良免疫原性的鴨肝炎病毒強毒株作為生產(chǎn)疫苗的病毒株，接種到易感雞胚上，收獲胚液，滅活后乳化，制成-種安全、有效的鴨病毒性肝炎疫苗，有針對性的防制鴨肝炎病毒感染。1疫苗生產(chǎn)用毒株(1)病毒來源本發(fā)明制備所用的生產(chǎn)病毒是一株鴨病毒性肝炎I型病毒，由本發(fā)明人從野外發(fā)病鴨體內(nèi)分離到，命名為鴨肝炎病毒(DuckH印atitisvirus，DHV)QL株(2009年07月15日本株病毒(DHVQL株)已送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCCNo.3202)。(2)DHVQL株病毒株特性1)病毒形態(tài)DHVQL株病毒病毒粒子呈二十面體對稱，直徑2040nm，在電子顯微鏡下從肝臟超薄切片上觀察到34nm的顆粒。2)分子生物學(xué)鑒定從組織毒提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，根據(jù)Genbank發(fā)表的DHV全基因序列設(shè)計的一對特異性引物Pl:5'-ACAGGAGCCAAGGGTTAT-3，；P2:5'-GCCAGGTGGTTGATGTM-3'進行RT-PCR擴增，，將擴增后的產(chǎn)物經(jīng)酶切顯示出序列大小為488bp的目的條帶，鑒定為DHV陽性。3)血凝性DHVQL株病毒對雞、豚鼠、兔、豬紅細胞均不凝集。4)對鴨胚的半數(shù)感染量(EIDso)經(jīng)測定DHVQL株病毒3代組織的毒EID5。為107°EID5。/0.2ml。5)對雛鴨的致病力測定DHVQL株病毒3代組織毒對雛鴨的致病力測定結(jié)果顯示當(dāng)攻10"EIDs。時，可以使雛鴨100/100發(fā)病，即最小感染量(MID)為105°EID5。；半數(shù)感染量(瓜。)為10:"3;半數(shù)致死量(LD5。)為10278。6)穩(wěn)定性將DHVQL株經(jīng)尿囊腔內(nèi)接種910日齡無特異性病原(SPF)雞胚傳10代，每0.2ml病毒含量均在10"EID5。以上，則DHVQL株在10代以內(nèi)是穩(wěn)定的，可以作為疫苗生產(chǎn)用種毒。7)免疫原性為了DHVQL株的疫苗研究，進行了免疫原性試驗，結(jié)果顯示DHVQL株E2E10代均具有良好的免疫原性。8)特異性將毒種稀釋至10"EID5。/0.2ml，與等量抗鴨肝炎病毒特異性血清混合，室溫放置l小時后，接種SPF雞胚10個，觀察120小時。在24120小時內(nèi)不引起特異性死亡，且至少存活8個。2鴨病毒性肝炎滅活疫苗的制備步驟為-生產(chǎn)用種毒制備一制苗用毒液的制備一孵育與觀察一收獲一滅活一乳化—配苗一分裝一28。C保存。1)生產(chǎn)用種毒制備將毒種用滅菌生理鹽水稀釋至l(T3，尿囊腔內(nèi)接種910日齡SPF雞胚，每胚0.2ml，接種后96小時，置04'C冷卻424小時，收獲胚液，選擇無細菌生長、病毒含量》106°EID5。/0.2ral的胚液作為生產(chǎn)用毒種。2)制苗用毒液的制備選擇發(fā)育良好、910日齡的易感雞胚作為制苗用材料。取生產(chǎn)用種毒，用滅菌生理鹽水作10—2稀釋，尿囊腔內(nèi)接種910日齡非免疫雞胚，每胚0.2ral，接種后密封針孔，置3637。C繼續(xù)孵育。3)孵育與觀察雞胚接種后每日照蛋1次，24小時以前死亡的雞胚棄去。以后每46小時照蛋1次，死亡的雞胚隨時挑出，置28。C保存，直至96小時，不論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置于28。C冷卻424小時。4)收獲將冷卻的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然后以無菌手術(shù)剝除氣室部卵殼，揭去卵殼膜，剪破絨毛尿囊腔膜及羊膜(謹防卵黃破裂)，吸取胚液。對每個雞胚在吸取胚液前均應(yīng)注意檢查，凡胎兒腐敗、胚液混濁及有任何污染可疑者，棄去不用。每若干個雞胚分為一組，吸取胚液放于同一滅菌的容器內(nèi)，每組抽樣，應(yīng)無細菌生長，28'C保存。5)滅活將檢驗合格的雞胚液分別進行滅活，加入甲醛至總量的0.2%。然后在37'C滅活40小時(以瓶內(nèi)溫度達到37卩開始記時)，期間振搖34次。滅活后2『C保存。6)乳化按常規(guī)方法制備油佐劑疫苗(參見《中國獸藥典》)。油相制備取注射用白油94份，加司本-806份，混合后，加硬脂酸鋁2份，隨加隨攪拌至透明為止，高壓滅菌備用。水相制備取滅菌吐溫-804份，加入滅活胚液96份，充分振搖，使吐溫-80完全溶解。乳化取油相2份放于乳化缸內(nèi)，開動電機慢速轉(zhuǎn)動攪拌，同時緩慢加入水相l(xiāng)份，加完后再以10000r/min攪拌25分鐘，在終止攪拌前加入1%硫柳汞溶液，使其最終濃度為0.01%。7)分裝定量分裝，加蓋密封，28'C保存。3鴨病毒性肝炎滅活疫苗的檢驗方法(1)物理性狀外觀應(yīng)為為乳白色乳狀液。劑型為油包水型(W/0)。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，應(yīng)呈油滴狀，不擴散。粘度用lml吸管(出口內(nèi)徑為1.2mm)，吸取25。C左右的疫苗，令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需時間，應(yīng)不超過8秒。穩(wěn)定性在37'C左右條件下放置21日或?qū)⒁呙?ml加入離心管，經(jīng)3000r/min離心15分鐘，應(yīng)不破乳。不符合規(guī)定者判為不合格。(2)無菌檢驗按《中國獸藥典》規(guī)定進行，應(yīng)為無菌生長。(3)安全檢驗用37日齡的櫻桃谷鴨10只，各頸部皮下注射疫苗lml，觀察14日，應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。(4)效力檢驗用l日齡左右的櫻桃谷鴨10只，各皮下注射疫苗0.3ml，21日時，連同條件相同的對照鴨5只，各腿部肌肉注射1(TEID5。強毒，觀察7日，應(yīng)全部健活。(5)甲醛、硫柳汞含量測定按《中國獸藥典》的規(guī)定方法進行測定，其甲醛溶液量(40°/。甲醛)不應(yīng)超過0.2%;汞類防腐劑殘留量應(yīng)不超過0.01%。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明是利用本發(fā)明人由野外分離得到的一株擁有優(yōu)良免疫原性的鴨肝炎病毒強毒株作為生產(chǎn)疫苗的病毒株，接種到易感雞胚上，收獲胚液，滅活后乳化，制成一種安全、有效的鴨病毒性肝炎疫苗。本發(fā)明有針對性的防制鴨肝炎病毒感染，擬補了市場上的空白，為控制養(yǎng)殖場鴨病毒性肝炎的擴散提供了條件。實施例以下實施例進一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。實施例1DHVQL株病毒種子病毒的純凈性檢驗1)無菌檢驗T.G、G.P小管和G.A斜面培養(yǎng)基均未觀察到菌落。2)支原體檢驗在觀察期內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)小瓶和小管培養(yǎng)物顏色出現(xiàn)明顯變化，移植的液體培養(yǎng)物在固體培養(yǎng)基上無"煎蛋"狀支原體菌落。3)外源病毒檢驗兩組雞胚7日內(nèi)全部存活，剖檢胎兒發(fā)育正常，絨毛尿囊膜無病變，雞胚液無血凝性。DHVQL株病毒中未見細菌、霉菌和支原體生長，無外源病毒污染，證明其是純凈的。實施例2疫苗制備1毒種繁殖將毒種用滅菌生理鹽水稀釋至10—3，尿囊腔內(nèi)接種910日齡SPF雞胚，每胚0.2ml，接種后96小時，置04'C冷卻424小時，收獲胚液，選擇無細菌生長、病毒含量>l(TEID5。/0.2ml的胚液作為生產(chǎn)用毒種。2制苗用毒液的制備選擇發(fā)育良好、910日齡的易感雞胚作為制苗用材料。取生產(chǎn)用種毒，用滅菌生理鹽水作10—2稀釋，尿囊腔內(nèi)接種910日齡非免疫雞胚，每胚0.2ml，接種后密封針孔，置3637。C繼續(xù)孵育。3孵育與觀察雞胚接種后每日照蛋l(fā)次，24小時以前死亡的雞胚棄去。以后每46小時照蛋1次，死亡的雞胚隨時挑出，置28。C保存，直至96小時，不論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置于28。C冷卻424小時。4收獲將冷卻的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然后以無菌手術(shù)剝除氣室部卵殼，揭去卵殼膜，剪破絨毛尿囊腔膜及羊膜(謹防卵黃破裂)，吸取胚液。對每個雞胚在吸取胚液前均應(yīng)注意檢查，凡胎兒腐敗、胚液混濁及有任何污染可疑者，棄去不用。每若干個雞胚分為一組，吸取胚液放于同一滅菌的容器內(nèi)，每組抽樣，應(yīng)無細菌生長，28'C保存。5滅活將檢驗合格的雞胚液分別進行滅活，加入甲醛至總量的0.2%。然后在37'C滅活40小時(以瓶內(nèi)溫度達到37C開始記時)，期間振搖34次。滅活后28。C保存，應(yīng)不超過一個月。6乳化油相制備取注射用白油94份，加司本-806份，混合后，加硬脂酸鋁2份，隨加隨攪拌至透明為止，高壓滅菌備用。水相制備取滅菌吐溫-804份，加入滅活胚液96份，充分振搖，使吐溫-80完全溶解。乳化取油相2份放于乳化缸內(nèi)，開動電機慢速轉(zhuǎn)動攪拌，同時緩慢加入水相l(xiāng)份，加完后再以10'000r/min攪拌25分鐘，在終止攪拌前加入P/。硫柳汞溶液，使其最終濃度為0.01%。7分裝定量分裝，加蓋密封，28'C保存。實施例3疫苗的成品檢驗(1)物理性狀外觀應(yīng)為為乳白色乳狀液。劑型為油包水型(W/0)。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，應(yīng)呈油滴狀，不擴散。粘度用lml吸管(出口內(nèi)徑為1.2mm)，吸取25'C左右的疫苗，令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需時間，應(yīng)不超過8秒。穩(wěn)定性在37。C左右條件下放置21日或?qū)⒁呙?ml加入離心管，經(jīng)3000r/min離心15分鐘，應(yīng)不破乳。不符合規(guī)定者判為不合格。(2)無菌檢驗按《中國獸藥典》規(guī)定進行，應(yīng)為無菌生長。(3)安全檢驗用37日齡的櫻桃谷鴨10只，各頸部皮下注射疫苗lml，觀察14日，應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。(4)效力檢驗用1日齡左右的櫻桃谷鴨10只，各皮下注射疫苗0.3ml，21日時，連同條件相同的對照鴨5只，各腿部肌肉注射105°EID5。強毒，觀察7日，應(yīng)全部健活。(5)甲醛、硫柳汞含量測定按《中國獸藥典》的規(guī)定方法進行測定，其甲醛溶液量(40%甲醛)不應(yīng)超過0.2%;汞類防腐劑殘留量應(yīng)不超過0.01%。實施例4鴨病毒性肝炎滅活疫苗的安全性試驗本發(fā)明人利用鴨肝炎病毒QL株研制出鴨病毒性肝炎滅活疫苗，我們對其進行了安全性試驗的研究。1各種劑量對不同日齡櫻桃谷雛鴨的安全性試驗將3個批次(0704001、0704002、0704003)的疫苗，頸部皮下接種1日齡、3日齡、5日齡櫻桃谷鴨雛鴨，每組10只，0.3ml/只。接種后觀察14天內(nèi)，所有雛鴨接種部位未出現(xiàn)腫脹，未見全身不良反應(yīng)。2單劑量重復(fù)使用的安全性試驗將0704001批次的疫苗頸部皮下接種3日齡櫻桃谷雛鴨種鴨各10只，每周1次，每次0.3ml，重復(fù)3次；頸部皮下接種30周齡種鴨10只，每周1次，每次0.5ml，重復(fù)3次。最后1次接種后2周，鴨接種部位未出現(xiàn)腫脹，也未見全身不良反應(yīng)。3—次超劑量接種的安全試驗將3個批次(0704001、0704002、0704003)的疫苗，分別頸部皮下注射接種IO只3日齡雛鴨，1ml/只；10只種鴨2ml/只。超劑量接種的10只3日齡雛鴨和IO只種鴨，接種后觀察14天，所有鴨未接種部位未出現(xiàn)腫脹，未見全身不良反應(yīng)。4疫苗對產(chǎn)蛋鴨生產(chǎn)性能的影響試驗取0704001批疫苗，將處于產(chǎn)蛋高峰期的28周齡產(chǎn)蛋鴨100只分為2組，每組50只，其中1組每只肌肉注射疫苗0.5ml，另外1組每只肌肉注射疫苗lml，另取50只同條件的鴨作為對照，肌肉注射生理鹽水，每只0.5ml，同條件下飼養(yǎng)，觀察2周，免疫鴨只對疫苗的應(yīng)激反應(yīng)很小，采食正常，精神良好，產(chǎn)蛋量和和體重未受影響，與對照組相比，各種生產(chǎn)性能指標(biāo)無明顯差異。具體結(jié)果見表L表l疫苗對產(chǎn)蛋高峰期蛋鴨的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>以3批疫苗進行安全性檢驗，頸部皮下或肌肉注射1日齡、3日齡和5日齡雛鴨，2周后觀察，接種部位無腫脹，無全身不良反應(yīng)；以0.3ml/只劑量連續(xù)3次接種3日齡鴨和以0.5ml/只劑量連續(xù)3次接種28周齡種鴨，接種后，接種部位無腫脹，無全身不良反應(yīng)，說明疫苗對鴨只是安全的。以lnil/只劑量接種3日齡鴨和以2ml/只劑量連接種28周齡種鴨，接種后，接種部位無腫脹，無全身不良反應(yīng)，說明超劑量接種疫苗對鴨只是安全的。以0.5ml劑量和lml劑量免疫處于產(chǎn)蛋高峰期的蛋鴨，觀察結(jié)果表明，疫苗對鴨的應(yīng)激反應(yīng)小，對其體重產(chǎn)蛋量沒有影響。實施例5鴨病毒性肝炎滅活疫苗效力試驗本發(fā)明人利用鴨肝炎病毒QL株研制出3批(0704001、0704002、0704003)鴨病毒性肝炎滅活疫苗，經(jīng)過實驗室安全試驗證明，疫苗對鴨是安全的，在此基礎(chǔ)上我們又對其進行了免疫效力試驗的研究。1.對雛鴨的效力試驗將i日齡櫻桃谷鴨分為IO個組，每組10只，其中1組作為對照。取3個不同批號的疫苗，每批疫苗分3個注射劑量，頸部皮下注射O.lml/只、0.3ml/只和0.5ml/只，21曰時，連同對照鴨10只，各肌肉注射106°EID5DHVQL株強毒，觀察14日，0.lml劑量組攻毒保護在8/10以上，0.3ml劑量組和0.5ml劑量組攻毒保護均為10/10，對照組10/10發(fā)病或死亡，具體結(jié)果見表l。2.對種鴨的效力試驗將產(chǎn)蛋前1個月左右的櫻桃谷鴨分為10個組，每組10只，其中1組作為對照。取3個不同批號的疫苗，每批疫苗分3個注射劑量，頸部皮下注射0.5ml/只、lml/只和1.5m1/只。將種鴨生產(chǎn)時，將孵出的鴨蛋孵化至雛鴨7日齡時，連同對照鴨所孵7日齡雛鴨，每組均為10只，各肌肉注射105°EID5。QL株強毒，觀察14日，0.5ml劑量組攻毒保護均在8/10以上，lml劑量組和1.5ml劑量組攻毒保護均為10/10，對照組10/10發(fā)病或死亡，具體結(jié)果見表2。表2鴨病毒性肝炎滅活疫苗效力試驗結(jié)果疫苗批號雛鴨效力試驗種鴨效力試驗疫苗劑量鴨數(shù)攻毒劑量EID50攻毒保護數(shù)疫苗劑量鴨數(shù)攻毒劑量EID50攻毒保護數(shù)07040010.1ml101058/100.5ml101058/100.3ml1010510/101,0ml1010510/100.5ml1010510/101.5ml1010510/1007040020.1ml101058/100.5ml101059/100.3ml1010510/101.0ml1010510/100.5ml1010510/101.5ml1010510/1007040030.1ml101059/100.5ml101058/100.3ml1010510/101.0ml1010510/100.5ml1010510/101.5ml1010510/10對照組/101050/10/101050/10就次力試驗表明，以O(shè).lml劑量免疫l日齡櫻桃谷雛鴨，攻毒保護率在80%以上，以0.3ml劑量和0.5ml劑量進行免疫，攻毒保護率為100%,對照組全部發(fā)病或死亡，保護率為O;以0.5ml劑量免疫產(chǎn)蛋前l(fā)個月左右的櫻桃谷種鴨，所孵雛鴨攻毒保護率在80%以上，以1.Oml劑量和1.5ml劑量進行免疫，，所孵雛鴨攻毒保護率為100%，對照組全部發(fā)病或死亡，保護率為O。序列表<110>齊魯動物保健品有限公司<120>—種鴨病毒性肝炎滅活疫苗及其制備方法<160>2<170〉<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>對人工序列的描述鴨肝炎病毒PCR引物P1<■>1ACAGGAGCCAAGGGTTAT18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>對人工序列的描述鴨肝炎病毒PCR引物P2<400>2GCCAGGTGGTTGATGTAA18權(quán)利要求1.一種鴨病毒性肝炎滅活疫苗，其特征是將本疫苗含有保藏號為CGMCCNo.3202的經(jīng)滅活的鴨病毒性肝炎病毒。2.—種鴨病毒性肝炎滅活疫苗的制備方法，其特征是將保藏號為CGMCCNo.3202的生產(chǎn)用種毒，用滅菌生理鹽水作10—2稀釋，經(jīng)尿囊腔內(nèi)接種910日齡的易感雞胚，每胚0.2ml，密封針孔，37X:繼續(xù)孵化96h，置于28'C冷卻424h，無菌收獲吸取胚液，將檢驗合格的雞胚液加入甲醛至總量的0.2%，然后在37'C滅活40h，按常規(guī)法制備成油佐劑滅活疫苗。全文摘要本發(fā)明涉及一種鴨肝炎滅活疫苗及其制備方法。是利用本發(fā)明人由野外分離得到的一株擁有優(yōu)良免疫原性的鴨肝炎病毒強毒CGMCCNo.3202株作為生產(chǎn)疫苗的病毒株，接種到易感雞胚上，收獲胚液，滅活后乳化，制成一種安全、有效的鴨病毒性肝炎疫苗。本發(fā)明有針對性的防制鴨病毒性肝炎病毒感染，擬補了市場上的空白，為控制養(yǎng)殖場鴨病毒性肝炎的擴散提供了條件。文檔編號A61K39/29GK101612397SQ20091015792公開日2009年12月30日申請日期2009年7月17日優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日發(fā)明者徐龍濤,李秀娟,蕾王,禚寶山申請人:齊魯動物保健品有限公司