一種檢測與補骨脂肝毒性有關(guān)的代謝產(chǎn)物的方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供一種檢測與補骨脂肝毒性有關(guān)的代謝產(chǎn)物的方法。所述代謝產(chǎn)物為補骨脂素和/或異補骨脂素的二氫二醇代謝產(chǎn)物;所述方法包括補骨脂素和/或異補骨脂素的二氫二醇代謝產(chǎn)物的獲取，利用串聯(lián)質(zhì)譜，以多反應(yīng)監(jiān)測法檢測所述代謝產(chǎn)物。本發(fā)明還提供所述方法在監(jiān)測補骨脂素、異補骨脂素、含有補骨脂素和/或異補骨脂素的組合物致肝毒性中的應(yīng)用，為安全用藥和藥物毒性的早期預(yù)警提供依據(jù)。
【專利說明】一種檢測與補骨脂肝毒性有關(guān)的代謝產(chǎn)物的方法及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物代謝和毒性研究領(lǐng)域，具體涉及補骨脂產(chǎn)生肝毒性的代謝產(chǎn)物的 檢測方法及其用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 肝臟作為最重要的藥物代謝器官，同時也是最主要的藥物毒性靶器官。在藥物使 用過程中，因藥物本身或其代謝產(chǎn)物、或由于特殊體質(zhì)對藥物的超敏感性所導(dǎo)致的肝臟損 傷稱為藥物性肝損傷（Drug-induced Liver Injury, DILI),據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，DILI已 上升為全球死亡原因的第五位。越來越多的報道顯示許多常用中藥，甚至一些傳統(tǒng)補益藥 具有肝毒性，如補骨脂、吳茱萸、何首烏等。中藥所致肝損傷最初多以臨床病例發(fā)現(xiàn)為主，其 肝毒性發(fā)現(xiàn)晚，一旦發(fā)現(xiàn)，通常已經(jīng)給患者造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷。但是，迄今仍然缺乏早期 發(fā)現(xiàn)藥物的肝毒性的技術(shù)及評價指標(biāo)。
[0003] 研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)藥物在肝臟經(jīng)CYP450酶代謝產(chǎn)生親電性活性代謝產(chǎn)物（Reactive Metabolites，RMs)后，由于其電子密度低，親核性強(qiáng)，能與肝細(xì)胞內(nèi)大分子(如CYP450酶)、 細(xì)胞器膜(如線粒體膜）等相結(jié)合，造成細(xì)胞應(yīng)激、細(xì)胞器膜功能損害，最終導(dǎo)致肝毒性發(fā) 生。Lammert et al.對207種常用口服藥物的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，能生成RMs的藥物中約62-69%具 有肝毒性。可見活性代謝產(chǎn)物在DILI發(fā)生過程中起著重要作用，監(jiān)測RMs的產(chǎn)生對藥物肝 毒性的早期發(fā)現(xiàn)具有重要意義。
[0004] 補骨脂為豆科植物補骨脂的干燥成熟果實，主要有溫腎助陽，納氣，止瀉之功效。 補骨脂本身以及含有補骨脂的中成藥如壯骨關(guān)節(jié)丸均有肝毒性報道。譚沛等研究顯示 2. lg/kg補骨脂能使得鼠肝重肝系數(shù)顯著升高，同時大鼠血清中AST、ALT、ALP的值與對照 組比較亦有升高趨勢（《補骨脂灌胃30天對大鼠肝毒性的實驗研究》;譚沛，趙超，周昆，屈彩 芹，胡利民；《新疆中醫(yī)藥》，2010年第28卷第2期：11-13)。而在國家食品藥品監(jiān)督管理局 公布的第16期藥品不良反應(yīng)信息通報中，也警惕了壯骨關(guān)節(jié)丸引起的肝損害。
[0005] 在已經(jīng)分離、鑒定的補骨脂化學(xué)成分中，由于補骨脂素和異補骨脂素(結(jié)構(gòu)式分別 如I和II所示）具有呋喃環(huán)這一活性官能團(tuán)，有可能在體內(nèi)經(jīng)肝臟代謝后產(chǎn)生活性代謝產(chǎn) 物（RMs)。
[0006]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測與補骨脂肝毒性有關(guān)的代謝產(chǎn)物的方法，其特征在于：所述代謝產(chǎn)物為補 骨脂素和/或異補骨脂素的二氫二醇代謝產(chǎn)物；所述方法包括補骨脂素和/或異補骨脂素 的二氫二醇代謝產(chǎn)物的獲取，利用串聯(lián)質(zhì)譜檢測所述代謝產(chǎn)物；具體包括如下步驟： 1) 血漿樣品中加入甲醇和乙腈組成的沉淀劑，所述血漿樣品和沉淀劑的體積比為 1:2-4,離心，得到上清液；或 將補骨脂素和/異補骨脂素，肝微粒體，還原型輔酶II混合，得到反應(yīng)溶液；在所述反 應(yīng)溶液中，使各物質(zhì)的濃度滿足以下條件： 補骨脂素和/或異補骨脂素為20-50 μ M, 肝微粒體為l-2mg/ml， 補骨脂素和/或異補骨脂素：還原型輔酶11=50:1 ; 37°C孵育60-120min后加入終止液終止反應(yīng)，渦旋，離心，得到上清液； 2) 取步驟1得到的上清液，氮氣吹干，甲醇-水溶液復(fù)溶； 3) 步驟2得到復(fù)溶溶液離心，取上清液注射入液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀，以多反應(yīng)監(jiān)測法 進(jìn)行監(jiān)測，[M+H]+母離子峰m/z221，碎片離子峰出現(xiàn)m/z203和m/zl75的，即是所述的代謝 產(chǎn)物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟2中，液相色譜條件為： 色譜柱：C18柱，規(guī)格2. 1_X 100mm，粒徑1. 7 μ m ; 流動相：A液0. 1%CH3C00H和B液100%ACN，梯度洗脫：0-12min，洗脫溶劑中B液的體積 百分比由5%增加到80%，余量為A液；12-15min，洗脫溶劑中B液的體積百分比為5%，余量 為A液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步驟2中，質(zhì)譜條件為： 全掃描質(zhì)譜條件：離子模式：ES+;毛細(xì)管電壓：3. 20kV;錐孔電壓：20.0V;源溫度： ll〇°C ;去溶劑溫度：350°C ;碰撞能量：2 ;蠕動泵流速：40μ L/min ;碰撞氣流速：0. 17mL/ Min; [M+H]+m/z221的子離子掃描質(zhì)譜條件：離子模式：ES+ ;毛細(xì)管電壓：3. 20kV ;錐孔電 壓：20. 0V ;源溫度：11(TC ;去溶劑溫度：350°C ;碰撞能量：20 ;蠕動泵流速：40μ L/min ;碰 撞氣流速：〇. 17mL/Min; [M+H]+m/z221的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜條件：離子模式：ES+ ;監(jiān)測離子對：221. 00>174. 90 ; 錐孔電壓：30. 0 ;碰撞能量：20. 0。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其特征在于：所述步驟1中，所述反應(yīng)溶 液中，補骨脂素和/或異補骨脂素的濃度為12. 5 μ M。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項2所述的方法，其特征在于：所述步驟1中，終止液選 自冰甲醇或冰乙腈；終止液的體積為所述反應(yīng)溶液的兩倍。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其特征在于：所述步驟1中，所述反應(yīng)溶 液的渦旋時間為l〇s。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其特征在于：所述步驟1中，所述血漿樣 品或所述反應(yīng)溶液的離心條件為14000r/min，10-15min。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其特征在于：所述步驟3中，復(fù)溶用溶液 中甲醇和水體積比為1:1。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其特征在于：所述步驟3中，離心條件為 14000r/min,5min〇
10. 權(quán)利要求1至9中任一項所述的方法在檢測藥物與肝毒性有關(guān)的代謝產(chǎn)物中的應(yīng) 用，所述藥物含有補骨脂、補骨脂素或異補骨脂素中的一種或幾種。
【文檔編號】G01N30/06GK104251890SQ201310264955
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月27日
【發(fā)明者】何新, 俸珊, 馬葉濤, 顏晶晶, 翟毅然 申請人:天津中醫(yī)藥大學(xué)