[0212] PBMC的短期培養(yǎng)
[0213] 將來自每個(gè)受試者的一小瓶的PBMC(含IX107個(gè)細(xì)胞）解凍，并用Sc印ter?手 持自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器測定淋巴細(xì)胞數(shù)量。PBMC分別在2mL的培養(yǎng)基中（CM:補(bǔ)充有5%人AB 血清的RPMI-1640Glutamax)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中以1X106個(gè)細(xì)胞/mL的濃度培養(yǎng)共11 天。細(xì)胞用含144重疊的HBV衍生短肽的肽池（SEQIDN0:73至210和SEQIDN0:142至 147)，范圍為15-20個(gè)氨基酸長度且以10至13個(gè)氨基酸重疊，以0. 1yg/肽/mL的最終濃 度進(jìn)行刺激。在第4天，分別將IL-2和IL-15加入到培養(yǎng)物至10IU/mL和10ng/mL的最終 濃度。在第10天，將細(xì)胞在CM中洗滌兩次并用10IU/mL的IL-2培養(yǎng)額外的一天。在第11 天，將細(xì)胞在CM中洗滌兩次，計(jì)數(shù)，并且加入到人IFNyELISpot測定或細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染 色中。
[0214]人IFNYELISoot測宙
[0215] 96孔多屏PVDF過濾板（Millipore)在4°C下用100yL(l:80)的抗人IFNy捕獲 mAb(R&D系統(tǒng)）包被過夜。然后將板在4°C下用補(bǔ)充有1%的BSA和5%的蔗糖的PBS阻斷 2小時(shí)。細(xì)胞以5X104的PBMC/孔被鋪板在三份孔中。使用的最終抗原濃度為：23HBV衍生 的Densigen相關(guān)的短肽池（見下文）：5yg/肽/mL;CEF肽池陽性對照yg/肽/mL;PHA 陽性對照：1Ug/mL。ELISpot板在37°C下、5%C02濕潤的環(huán)境中孵育18小時(shí)。然后將板 洗滌并用100U1 (1:80)的生物素化的抗人IFNY檢測mAb(R&D系統(tǒng)）在室溫下孵育2小 時(shí)。洗滌后，根據(jù)制造商的說明（R&D系統(tǒng)），板用鏈霉親和共軛的堿性磷酸酶（1:80)孵育 1小時(shí)，隨后是底物（30分鐘）。顯影的（生長的）斑點(diǎn)使用自動板計(jì)數(shù)系統(tǒng)（CTLEurope) 計(jì)數(shù)。
[0216] 表3 :池24至46中的肽的識別
[0217]
[0218]
[0219]細(xì)朐內(nèi)細(xì)朐閔子染色（ICS)測宙
[0220] 細(xì)胞以5X105PBMC/孔鋪板在96孔圓底板中且用來自HBV衍生的肽池以5yg/肽 /mL的最終濃度進(jìn)行刺激。將板在5%C02孵育箱中在37°C下孵育20小時(shí)。在該測定的最 終3小時(shí)，將PMA/離子霉素加入到各孔中且將高爾基插頭加入到所有孔中。收獲細(xì)胞并用 PBS+0. 1 %BSA(洗滌緩沖液）洗滌并且用抗CD3,抗CD4和抗CD8(BDBiosciences)在4°C 下染色30分鐘。在另一次洗絳后，將細(xì)胞固定并用100yL的BDCytofix/Cytoperm溶液在 4°C下滲透20分鐘，接著用1XBDPerm/Wash溶液洗滌兩次。最后，將細(xì)胞用抗IL-2-FITC， 抗IFNy-PE和抗TNFaPerCP-Cy5. 5(BDBiosciences)在 4°C下染色 30 分鐘。在FACSCanto II流式細(xì)胞儀（BDBiosciences)上獲得樣本。門控是基于用于每個(gè)受試者的媒介刺激樣 本。
[0221] 感染HBV基閔塑的確宙
[0222] 在直接核苷酸排序之前的巢式PCR方法最初被用于HBV基因分型。然而，由于 來自大多數(shù)樣本的血漿中的低病毒載量，HBV基因型不能使用這種方法來確定。隨后使用 IMMUNIS?HBV基因型酶免疫測定（EIA)試劑盒。這種測定使用了在HBsAg的PreS2區(qū) 中的四種基因型依賴性表位，其中通過特定于所述表位中的每一個(gè)的四個(gè)EIA的陽性/陰 性組合而在血清學(xué)上確定基因型。
[0223] 結(jié)果
[0224] 在對HBV衍生的短肽池的應(yīng)答進(jìn)行篩選之后，對感興趣的35-40mer區(qū)域進(jìn)行識 另IJ。這些區(qū)域被進(jìn)一步評估，以便在疫苗中使用35-40mer肽。進(jìn)一步的評估涉及在短期培 養(yǎng)之后的先前用于再刺激的短肽池的重新設(shè)計(jì)。延伸超過感興趣35-40mer區(qū)域的終端短 肽從池中去除，以便更準(zhǔn)確地反映將在疫苗中使用的肽。在利用肽庫進(jìn)行短期培養(yǎng)之后，和 以前一樣，這些短肽池隨后被用于人IFNyELISpot和ICS測定中的再刺激。
[0225] 利用池24到46的再刺激表明對來自HBV蛋白質(zhì)組的終端聚合酶（池25和池26) 和核心（池38和39以及池41至43)區(qū)域的區(qū)域的主導(dǎo)HBV特異性T細(xì)胞應(yīng)答（圖5)。 在利用表面區(qū)域池45刺激之后也發(fā)現(xiàn)HBV特異性應(yīng)答。對應(yīng)于池28,池32,池33,池36和 池37的聚合酶區(qū)域也給出了顯著的T細(xì)胞應(yīng)答。
[0226] 對池24到46的IFNyELISpot應(yīng)答根據(jù)感染HBV基因型進(jìn)行分組（圖6)。池27， 28, 29, 32, 35, 36每一個(gè)給出了針對基因型C的占優(yōu)勢的應(yīng)答。池25和26給出了針對基因 型D的占優(yōu)勢的應(yīng)答。池30和31給出了針對基因型B的占優(yōu)勢的應(yīng)答。池38,42,43和 44給出了針對基因型A的占優(yōu)勢的應(yīng)答。一些池傾向于促進(jìn)針對多于一個(gè)的基因型的應(yīng) 答：對于池26, 32, 33, 36和43為兩種基因型，對于池37, 38,41和42為三種基因型，或者對 于池25為甚至四種基因型。
[0227] 對池24到46的IFNyELISpot應(yīng)答根據(jù)感染HBV基因型進(jìn)行分組（圖7)。池28， 29和30給出了東方/印度種族中占優(yōu)勢的應(yīng)答。池25, 33, 34, 35和37給出了高加索人中 占優(yōu)勢的應(yīng)答。池38, 39,41，42和43給出了非洲/阿拉伯種族中占優(yōu)勢的應(yīng)答。一些池 傾向于促進(jìn)在多于一個(gè)的族群中的應(yīng)答：對于池26, 39和43中的每一個(gè)為兩個(gè)族群或者對 于池25, 38和42中的每一個(gè)為三個(gè)族群。
[0228] 結(jié)果總結(jié)在下面的表4中。
[0229]
[0230] 表4 :來自針對在不同的HBV基因型（A，B，C和D)和不同種族（01 =東方/印度， C=高加索人，AA=非洲/阿拉伯人）的患者中HBV蛋白質(zhì)組的選定區(qū)域的肽的占優(yōu)勢應(yīng) 答的總結(jié)。在區(qū)域引發(fā)針對多種HBV基因型或多個(gè)種族的免疫應(yīng)答的情況下，占優(yōu)勢的應(yīng) 答是用粗體表示。
[0231] 八個(gè)池被選擇用于通過細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色來進(jìn)一步分析T細(xì)胞應(yīng)答。7至14 個(gè)受試者之間的PBMC(取決于在IFNyELISpot測定之后可用的細(xì)胞數(shù)）利用八個(gè)池中的 一個(gè)刺激過夜并且細(xì)胞被染色用于表面⑶3,CD4和⑶8表達(dá)，連同細(xì)胞內(nèi)IFNy，TNFa和 IL-2表達(dá)（圖8)。在⑶8和⑶4T細(xì)胞群中均發(fā)現(xiàn)IFNY表達(dá)，具有對評估的所述肽池的 5/8和8/8的應(yīng)答的相應(yīng)廣度。類似地，在⑶8和⑶4T細(xì)胞群中均發(fā)現(xiàn)TNFa表達(dá)，分別 具有3/8和6/8的肽池應(yīng)答的廣度。CD8T細(xì)胞在肽池刺激之后被發(fā)現(xiàn)沒有表達(dá)IL-2,但 ⑶4T細(xì)胞在利用8個(gè)池中的7個(gè)刺激后表達(dá)IL-2。
[0232]實(shí)施例3:碳氟化合物連接的HBV肽的組成
[0233] 通過FM0C(芴基甲氧基碳酰氯）固相合成來合成具有在SEQIDNOs:24,25,28， 33, 34, 36, 37和38和222中所示的氨基酸序列的肽。然后，碳氟化合物鏈（C8F17 (CH2) 2C00H) 被引入到每個(gè)肽的附加N-末端賴氨酸的e鏈上以導(dǎo)出碳氟化合物連接的肽。純化的碳氟 化合物連接的肽或未經(jīng)修飾的肽通過在三氟乙酸（TFA)的存在下切割并經(jīng)由反相高效液 相色譜（RP-HPLC)的最終純化得到。所有制劑具有90%或更高的純度。
[0234] FA-P113 ：K(FA)-VGPLTVNEKRRLKLIMPARFYPNVTKYLPLDKGIK-NH2(SEQ ID NO ：24)；
[0235] FA-P151 ：K(FA)-PEHVVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASF-NH2(SEQ ID NO ：25)；
[0236] FA-P376 ：K (FA)-KLHLYSHPIILGFRKIPMGVGLSPFLLAQFTSAISSVVRR-NH2 (SEQ ID NO ： 28)；
[0237] FA-753 (K) ：K (FA)-KKKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYRKKK-NH2 (SEQ ID NO： 36) ；
[0238] FA-P856(K) ：K(FA)-LTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTKKK-NH2(SEQ ID NO： 38)；
[0239] FA-P877 ：K (FA)-PPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRR-NH2 (SEQ ID NO ：33)；
[0240] FA-P277(K) ：K(FA)-RVSWPKFAVPNLQSLTNLLSSNLSWLSLDVSAAFYHKKK-NH2 (SEQ ID NO :34)，
[0241] FA-P797(K) ：K(FA)-SPHHTALRQAILSWGELMTLATWVGSNLEDPASRDKKK-NH2(SEQ ID NO： 37) ；
[0242] FA-P1266(K) ：K(FA)-KKKGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSff WTSLNFLKKK-NH2 (SEQ ID NO ：222)
[0243] NP113 ：VGPLTVNEKRRLKLIMPARFYPNVTKYLPLDKGIK(SEQ ID NO ：24)；
[0244] NP151：PEHVVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASF(SEQ ID NO ：25)；
[0245] NP376 ：KLHLYSHPIILGFRKIPMGVGLSPFLLAQFTSAISSVVRR(SEQ ID NO ：28)；
[0246] NP753(K) ：KKKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYRKKK(SEQ ID NO ：36)；
[0247] NP856(K) ：LTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTKKK(SEQ ID NO ：38)；
[0248] NP877 ：PPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRR(SEQ ID NO ：33)；
[0249] NP277(K) ：RVSWPKFAVPNLQSLTNLLSSNLSWLSLDVSAAFYHKKK(SEQ ID NO ：34),
[0250] NP797(K) ：SPHHTALRQAILSWGELMTLATWVGSNLEDPASRDKKK(SEQ ID NO ：37)；
[0251] NP1266(K) ：KKKGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLKKK(SEQ ID N0：222).
[0252]實(shí)施例4 :長HBV肽制劑
[0253] 如下所述，配制疫苗候選物，F(xiàn)P02. 1，其由如實(shí)施例3中所述制備的九種碳氟化合 物共軛的HBV衍生肽構(gòu)成。用于肽溶解的條件描述在表5中。簡要地說，九種碳氟化合物共 軛的肽中的每一種在5ml的玻璃小瓶中稱量。然后，每一種肽用2至12%的在水溶液中的 乙酸溶解，以達(dá)到l〇mg的肽濃度。肽溶液（對于每種肽為3. 9mL)在150mL的無菌容器中混 合，之后加入3. 9mL的在水中的10 %乙酸溶液。在用磁力攪拌器攪拌2分鐘后，加入39mL 的在水溶液中的9. 0%甘露醇。在用磁力攪拌器攪拌另外的2分鐘后，將溶液用0. 22ym的 33mm的Millex過濾器進(jìn)行過濾。1. 2mL的過濾溶液被分送到高壓滅菌的2mL玻璃小瓶中。 通過RP-HPLC測量的過濾回收率>95%。將小瓶在-80°C下冷凍1小時(shí)。然后將樣本冷凍 干燥36小時(shí)。在氮?dú)夥障逻M(jìn)行冷凍干燥通風(fēng)并且在400到600毫巴之間的壓力下進(jìn)行小 瓶加塞。肽的量為每小瓶600yg/肽；在用1. 2mL復(fù)原之后，最終濃度為500yg/肽/ml。
[0254]
[0256] 表5 :用于制備FP02. 1的溶解條件
[0257]實(shí)施例5 :優(yōu)詵的HBV肽和混合物在慢性HBV攜帶者中是免疫原性的，而與病情階 段、HBV病毒的基因型和受試者的種族無關(guān)。
[0258] 方法和材料
[0259]人群
[0260]臨床上定義為慢性HBV感染的40個(gè)受試者被納入了在倫敦的帝國保健NHS信托， 切爾西和威斯敏斯特醫(yī)院NHS信托基金會以及巴茲和倫敦NHS信托中的REC-批準(zhǔn)的協(xié)議。 在來自所有受試者的書面知情同意后，新鮮的靜脈血被采集并且PBMC和血漿被分離并且 在采血的18小時(shí)內(nèi)被凍存。這些受試者符合以下標(biāo)準(zhǔn)：良好的一般健康狀況，HBV特異性 治療：在臨床指征情況下抗病毒核苷（酸）類似物抑制劑和/或干擾素治療，臨床狀態(tài)（慢 性HBV感染，HBeAg陰性，以及ALT正常、持續(xù)或間歇性升高），HIV陰性，HCV陰性和HDV陰 性。
[0261]PBMC的短期培養(yǎng)
[0262] 來自每個(gè)受試者的一個(gè)小瓶的PBMC(含IX107個(gè)細(xì)胞）被解凍，并用Sc印ter?手 持自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器測定淋巴細(xì)胞數(shù)量。PBMC在2mL的培養(yǎng)基（CM:補(bǔ)充有5%人AB血清的 RPMI-1640Glutamax)中在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中以1X106個(gè)細(xì)胞/mL的濃度培養(yǎng)共11天。 細(xì)胞用實(shí)施例3中所描述的九種HBV衍生的長肽的混合物刺激。
[0263] 以0. 1yg/肽/mL的最終濃度使用每一種肽。在第4天，分別將IL-2和IL-15加 入到培養(yǎng)物中至10IU/mL和10ng/mL的最終濃度。在第10天，將細(xì)胞在CM中洗滌兩次并 用10IU/mL的IL-2培養(yǎng)額外的一天。在第11天，將細(xì)胞在CM中洗滌兩次，計(jì)數(shù)，并且加入 到人IFNy(干擾素y)ELISpot測定或細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色中。
[0264]人IFNyELISoot測宙
[0265] 96孔多屏PVDF過濾板（Millipore)在4°C下用100yL(l:80)的抗人IFNy捕獲 mAb(R&D系統(tǒng)）包被過夜。然后將板在4°C用補(bǔ)充有1%的BSA和5%的蔗糖的PBS阻斷 2小時(shí)。來自短期培養(yǎng)的細(xì)胞以5X104PBMC/孔被鋪板在三份孔中。使用的最終抗原濃度 為：對于每一單獨(dú)的肽為5yg/mL;PHA陽性對照：1yg/mL。ELISpot板在37°C、5% 0)2濕 潤的環(huán)境中孵育18小時(shí)。然后將板洗滌并用100y1(1:80)的生物素化的抗人IFNy檢測 mAb(R&D系統(tǒng)）在室溫選孵育2小時(shí)。洗滌后，根據(jù)制造商的說明（R&D系統(tǒng)），板用鏈霉親 和共軛的堿性磷酸酶（1:80)孵育1小時(shí)，隨后是底物（30分鐘）。顯影斑點(diǎn)使用自動板計(jì) 數(shù)系統(tǒng)（CTLEurope)計(jì)數(shù)。
[0266] 細(xì)朐內(nèi)細(xì)朐閔子染色（ICS)測宙
[0267] 來自短期培養(yǎng)的細(xì)胞以5X105PBMC/孔鋪板在96孔圓底板中且由9種HBV衍生的 長肽（NP113，NP151，NP277(K)，NP376，NP753(K)，NP797(K)，NP856(K)，NP877 和NP1266(K)) 以5yg/mL的最終濃度進(jìn)行刺激。將板在5%C02孵育箱中在37°C下孵育20小時(shí)。在該測 定的最終3小時(shí)，將PMA/離子霉素加入到各孔中且將高爾基插頭加入到所有孔中。收獲細(xì) 胞并用PBS+0. 1 %BSA(洗滌緩沖液）洗滌以及用抗CD3,抗CD4和抗CD8(BDBiosciences) 在4°C下染色30分鐘。在另一次洗絳后，將細(xì)胞固定并用100yL的BDCytofix/Cytoperm 溶液在4°C下滲透20分鐘，接著用1XBDPerm/Wash溶液洗滌兩次。最后，將細(xì)胞用抗 IL-2-FITC，抗IFNy-PE和抗TNFaPerCP-Cy5. 5(BDBiosciences)在 4°C下染色 30 分鐘。 在FACSCantoII流式細(xì)胞儀（BDBiosciences)上獲得樣本。門控是基于用于每個(gè)受試者 的媒介刺激樣本。
[0268] 感染HBV基閔塑的確宙
[0269] 在直接核苷酸排序之前的巢式PCR方法最初被用于HBV基因分型。然而，由于在 來自大多數(shù)樣本的血漿中的低病毒載量，HBV基因型不能使用這種方法來確定。隨后使用 IMMUNISEHBV基因型酶免疫測定（EIA)試劑盒。這種測定使用了在HBsAg的PreS2區(qū) 中的四種基因型依賴性表位，其中通過特異于所述表位中的每一個(gè)的四個(gè)EIA的陽性/陰 性組合來血清學(xué)上確定基因型。
[0270] 結(jié)果
[0271] 所有肽促進(jìn)了HBV攜帶者（HBeAg陰性無活動攜帶者或HBeAg陰性治療受試者） 中的可檢測的T細(xì)胞應(yīng)答（參見圖9和圖10)。在測試的不同肽中，NP113, NP151，NP376， NP753(K)，NP797(K)，NP856(K)和NP877促進(jìn)兩種患者群體和最高比例受試者中應(yīng)答的最 高水平。令人驚訝的是，與測試的兩種肽的任何其它組合相比，對NP113和NP151的累積 應(yīng)答在兩個(gè)群體中更高。此外，與測試的三種肽的任何其他組合相比，對NP113, NP151和 NP376的累積應(yīng)答在兩個(gè)群體中誘導(dǎo)了最高水平的應(yīng)答。如圖11中所示，所有測試的肽促 進(jìn)了所有四個(gè)HBV基因型的交叉反應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)答。與肽NP2777(K)和NP1226(K)相比， 肽NP113，NP151，NP376，NP753 (K)，NP797 (K)，NP856 (K)和NP877促進(jìn)了所有四個(gè)基因型A， B，C和D的最高應(yīng)答。令人驚訝地，與所有其他肽相比，P113促進(jìn)了所有四個(gè)基因型的最高 T細(xì)胞應(yīng)答。
[0272] 圖12示出了所有的肽促進(jìn)了測試的所有種族的T細(xì)胞應(yīng)答。