用于保護(hù)免于白喉和/或破傷風(fēng)的綴合物的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 本申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/738, 958 (2012年12月18日提交）的權(quán)益，其完整 內(nèi)容出于所有目的由此通過(guò)引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明是在免疫領(lǐng)域中，特別是使用綴合物疫苗。
【背景技術(shù)】
[0003] 在單一劑量中含有來(lái)自多于一種病原生物體的抗原的疫苗被稱為"組合"疫苗。已 經(jīng)證明各種組合疫苗(包括用于保護(hù)免于白喉、破傷風(fēng)和百日咳的早期三價(jià)疫苗（"DTP"疫 苗））。當(dāng)前可用的最復(fù)雜的多病原體疫苗是6價(jià)的，并且包括白喉、破傷風(fēng)、百日咳、脊髓灰 質(zhì)炎、乙型肝炎和Hib的抗原（D-T-aP-IPV-HBV-Hib)。這些疫苗已經(jīng)是非常復(fù)雜的，并且獲 得具有進(jìn)一步抗原的疫苗的批準(zhǔn)不是簡(jiǎn)單的。
[0004] 6價(jià)疫苗包括綴合至破傷風(fēng)類毒素載體蛋白的Hib糖。針對(duì)其他病原體的已知綴 合物疫苗包括分別針對(duì)腦膜炎球菌和肺炎球菌的MENVEO ?和PREVNAR ?產(chǎn)品。接受綴合物 疫苗后，已知不僅針對(duì)糖、而且針對(duì)載體蛋白產(chǎn)生抗體。典型的載體蛋白包括白喉和破傷風(fēng) 類毒素。這些本身是保護(hù)性抗原，但參考文獻(xiàn)1報(bào)道，這些類毒素的綴合物"不足以誘導(dǎo)關(guān) 于載體的完全免疫"。為什么綴合去除類毒素的保護(hù)效力的可能解釋可以是糖的共價(jià)偶聯(lián) 破壞或掩蓋保護(hù)性表位（線性或構(gòu)象的），或者綴合降低載體蛋白的柔性。
[0005] 盡管綴合引起保護(hù)效力的這種總體損失，但參考文獻(xiàn)1報(bào)道，破傷風(fēng)或白喉類毒 素甚至在肺炎鏈球菌糖的綴合之后可以保留其保護(hù)作用。作者沒(méi)有將該發(fā)現(xiàn)外推至任何 其他糖類，但的確預(yù)期，可以用CRM197看到相同結(jié)果（參見(jiàn)參考文獻(xiàn)1中的[0041])，所述 CRM197是白喉毒素的無(wú)毒突變體。CRM197是疫苗糖綴合物中的另一種眾所周知的載體蛋 白，并且它與白喉毒素的不同在于單個(gè)氨基酸突變。
[0006] 參考文獻(xiàn)2報(bào)道了使用破傷風(fēng)類毒素的4價(jià)腦膜炎球菌綴合物疫苗（現(xiàn)批準(zhǔn)為 NMENRIX?產(chǎn)品）的研究。作者報(bào)道，100%的疫苗受體產(chǎn)生抗破傷風(fēng)抗體，但這些患者已經(jīng) 接受包括破傷風(fēng)類毒素的常規(guī)兒科疫苗，并且在接受4價(jià)腦膜炎球菌疫苗之前具有抗破傷 風(fēng)抗體的患者的比率已經(jīng)大于90%。因此，參考文獻(xiàn)2沒(méi)有給出任何關(guān)于綴合物疫苗是否 可以在未引發(fā)的幼稚的嬰兒（un-primed naive infants)中誘導(dǎo)顯著的抗破傷風(fēng)免疫應(yīng)答 的信息。此外，參考文獻(xiàn)2使用無(wú)法揭示那些抗體是否具有保護(hù)作用的ELISA測(cè)試檢測(cè)抗 破傷風(fēng)抗體。用于測(cè)量此類抗體的其他測(cè)試（例如，用于測(cè)定MENACTRA?產(chǎn)品引發(fā)的抗白 喉抗體的中和作用的CHO中和測(cè)定）也沒(méi)有揭示抗體是否在體內(nèi)具有保護(hù)作用。
[0007] 也已經(jīng)以這種方式研究CRM197。參考文獻(xiàn)3顯示CRM197在人中是免疫原性的， 但，再次，在先前已經(jīng)接受白喉類毒素疫苗，而不是在幼稚的（naive)患者中，測(cè)量到免疫 應(yīng)答，并且所述免疫應(yīng)答通過(guò)體外測(cè)定（ELISA)、而不是功能測(cè)定測(cè)定到。
[0008] 盡管白喉和破傷風(fēng)類毒素在綴合至細(xì)菌糖類后保留至少一些免疫原性，但因此不 清楚它們是否保留它們的保護(hù)效力。因此，疫苗諸如NMENRIX ?或MENACTRA ?是否可以在 免疫幼稚受試者中引發(fā)保護(hù)性抗破傷風(fēng)或抗白喉免疫是未知的。類似地，綴合的CRM197，如 MENVEO ?和PREVNAR ?產(chǎn)品中所使用，是否可以在這些受試者中引發(fā)保護(hù)性抗白喉免疫是不 清楚的。
[0009] 發(fā)明概述 本發(fā)明人已經(jīng)顯示使用白喉類毒素或破傷風(fēng)類毒素作為載體蛋白（諸如MenactratMp menitorix?產(chǎn)品）、但不含有類毒素作為單獨(dú)抗原的現(xiàn)有糖綴合物疫苗可以賦予針對(duì)白喉 毒素或破傷風(fēng)毒素的致死攻擊的保護(hù)。因此，除了保護(hù)免受其糖類已經(jīng)連接至載體的細(xì)菌 影響以外，此類綴合物疫苗也可以用于保護(hù)免于白喉和破傷風(fēng)。這意味著，當(dāng)前復(fù)雜組合疫 苗的白喉和破傷風(fēng)類毒素組分可以是多余的。因此，可以降低這些疫苗的抗原復(fù)雜性，而不 降低其保護(hù)寬度。此外，去除這些多余組分在疫苗中產(chǎn)生空間用于添加免疫原用于保護(hù)免 受進(jìn)一步病原體的影響。例如，現(xiàn)有的六價(jià)疫苗D-T-P-HBV-IPV-Hib可以（a)通過(guò)去除未 綴合的T組分和依賴于Hib綴合物中的T載體而簡(jiǎn)化，（b)通過(guò)用具有T載體的MenC綴合 物替代未綴合的T組分而擴(kuò)展，而不增加抗原復(fù)雜性，和/或（c)通過(guò)用MenACWY-D綴合物 替代未綴合的D組分和在Hib綴合物中的T載體代替未綴合的T而大大擴(kuò)展，而不相應(yīng)增 加抗原復(fù)雜性。
[0010] 因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了用于針對(duì)多種病原體免疫嬰兒的方法，其包括 用（a)含有未綴合的白喉類毒素、但不含有未綴合的破傷風(fēng)類毒素的疫苗；和（b)含有綴合 至破傷風(fēng)類毒素載體的糖的疫苗共同免疫嬰兒的步驟。
[0011] 本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了用于針對(duì)多種病原體免疫嬰兒的方法，其包括用（a) 含有未綴合的破傷風(fēng)類毒素、但不含有未綴合的白喉類毒素的疫苗；和（b)含有綴合至白 喉類毒素載體的糖的疫苗共同免疫嬰兒的步驟。
[0012] 本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了用于針對(duì)多種病原體免疫嬰兒的方法，其包括用（a) 不含未綴合的破傷風(fēng)類毒素且不含未綴合的白喉類毒素的疫苗；(b)含有綴合至白喉類毒 素載體的糖的疫苗；和（c)含有綴合至白喉類毒素載體的糖的疫苗共同免疫嬰兒的步驟。
[0013] 本發(fā)明的第四個(gè)方面提供了包含未綴合的白喉類毒素和綴合至破傷風(fēng)類毒素載 體的糖、但不含未綴合的破傷風(fēng)類毒素的組合疫苗。
[0014] 本發(fā)明的第五個(gè)方面提供了包含未綴合的破傷風(fēng)類毒素和綴合至白喉類毒素載 體的糖、但不含未綴合的白喉類毒素的組合疫苗。
[0015] 本發(fā)明的第六個(gè)方面提供了包含綴合至破傷風(fēng)類毒素載體的糖和綴合至白喉類 毒素載體的糖、但不含未綴合的破傷風(fēng)類毒素且不含未綴合的白喉類毒素的組合疫苗。
[0016] 本發(fā)明的第七個(gè)方面提供了包含至少兩種試劑盒組分的試劑盒，所述試劑盒組 分，當(dāng)混合時(shí)，導(dǎo)致第三至第六個(gè)方面的組合疫苗。
[0017] 本發(fā)明的第八個(gè)方面提供了用于針對(duì)腦膜炎球菌疾病和破傷風(fēng)免疫嬰兒的方法， 其包括施用含有綴合至破傷風(fēng)類毒素載體的腦膜炎球菌莢膜糖的疫苗而不施用未綴合的 破傷風(fēng)類毒素的步驟。
[0018] 本發(fā)明的第九個(gè)方面提供了用于針對(duì)腦膜炎球菌疾病和白喉免疫嬰兒的方法，其 包括施用含有綴合至白喉類毒素載體的腦膜炎球菌莢膜糖的疫苗而不施用未綴合的白喉 類毒素的步驟。
[0019] 盡管白喉和破傷風(fēng)綴合物可以賦予針對(duì)白喉毒素或破傷風(fēng)毒素的致死攻擊的保 護(hù)，但本發(fā)明人已經(jīng)顯示，用CRM197載體（其與白喉毒素的不同在于單個(gè)氨基酸突變）沒(méi) 有看到相同的效果。因此，基于CRM197的綴合物不能以上面討論的方式使用，但本發(fā)明人 的發(fā)現(xiàn)具有不同的影響。由于在綴合物疫苗的背景下CRM197是比Dt更弱的白喉免疫原， 所以當(dāng)綴合物疫苗與當(dāng)前嬰兒組合疫苗（其含有Dt和Tt)同時(shí)給予時(shí)，它作為載體是更有 吸引力的，因?yàn)閷?duì)于載體蛋白誘導(dǎo)的負(fù)面干擾，它們可以提供更低的潛能。因此，本發(fā)明的 第十個(gè)方面提供了用于針對(duì)多種病原體免疫嬰兒的方法，其包括用（a)含有白喉類毒素和 破傷風(fēng)類毒素的疫苗；和（bl)含有綴合至CRM197載體的腦膜炎球菌莢膜糖的疫苗；(b2) 含有綴合至CRM197載體的肺炎球菌莢膜糖的疫苗；(b3)含有綴合至CRM197載體的腦膜炎 球菌莢膜糖的第一疫苗和含有綴合至CRM197載體的肺炎球菌莢膜糖的第二疫苗；或（b4) 含有各自綴合至CRM197載體的肺炎球菌和腦膜炎球菌莢膜糖的疫苗中的一種共同免疫嬰 兒的步驟。
[0020] 嬰兒 本發(fā)明用于免疫嬰兒，即從出生直至12個(gè)月齡，例如0-9個(gè)月或0-6個(gè)月的人。因此， 例如，嬰兒可以是2個(gè)月齡、3個(gè)月齡、4個(gè)月齡、5個(gè)月齡或6個(gè)月齡。
[0021] 本發(fā)明聯(lián)合嬰兒的針對(duì)白喉和破傷風(fēng)的初次免疫（這通常發(fā)生在2個(gè)月齡）是特 別有用的。因此，嬰兒在免疫時(shí)對(duì)于破傷風(fēng)類毒素（Tt)和/或白喉類毒素（Dt)是理想地 免疫上幼稚的（immunologically naive)。
[0022] 共同免疫 當(dāng)本發(fā)明是指共同免疫時(shí)，枚舉列表中的不同疫苗可以單獨(dú)或作為組合施用。
[0023] 其中單獨(dú)施用疫苗時(shí)，它們通常將在不同部位施用，例如一次疫苗施用于左上臂， 且第二次疫苗施用于右上臂。因此，兩次疫苗可以對(duì)側(cè)（例如雙臂或雙腿或?qū)?cè)臂和腿） 或同側(cè)（例如身體的同側(cè)的臂和腿）施用。雖然分開(kāi)施用疫苗，但它們?cè)诨旧贤瑫r(shí)（例 如，相同的醫(yī)療咨詢或訪問(wèn)健康護(hù)理專業(yè)人員或接種中心過(guò)程中），諸如在彼此的1小時(shí)內(nèi) 施用。
[0024] 不是分開(kāi)共同免疫，然而，優(yōu)選作為組合施用。因此，優(yōu)選的共同免疫使用組合疫 苗，即，其中混合不同的免疫原的單一組合物。組合疫苗為患者提供接受減少注射次數(shù)的優(yōu) 點(diǎn)，從而可以導(dǎo)致順應(yīng)性提高（例如參見(jiàn)參考文獻(xiàn)4的第29章）的臨床優(yōu)點(diǎn)，特別是在兒 科患者中。在本發(fā)明的第一個(gè)方面，例如，嬰兒優(yōu)選接受單一組合物，其包括未綴合的Dt和 綴合至Tt載體的糖。
[0025] 綴合和未綴合的類毒素載體 當(dāng)類毒素是綴合的類毒素時(shí)，其共價(jià)連接（直接或經(jīng)由接頭）至另一部分，其通常將是 糖抗原（例如，細(xì)菌莢膜糖）。
[0026] 本發(fā)明的第一至第九個(gè)方面是指包括或施用（或不包括/施用）"未綴合的"Dt 和/或Tt的疫苗。該術(shù)語(yǔ)意指類毒素沒(méi)有綴合至另一個(gè)抗原，例如綴合至糖抗原。因此，例 如，"未綴合的"Tt將排除綴合的PRP-T或N頂ENRIX ?產(chǎn)品中存在的Tt，并且"未綴合的"Dt 將排除綴合的PRP-D或MENACTRA ?產(chǎn)品中存在的Dt。
[0027] 當(dāng)疫苗被定義為含有特定未綴合的類毒素時(shí)，它也可以（除非明確指明）包括綴 合形式的相同類毒素，例如包括未綴合的Tt的疫苗可以包括Tt和PRP-T兩者。相反，當(dāng)疫 苗被定義為不含（或被定義為不含有）特定未綴合的類毒素時(shí)，它可以（并且通常將）包 括綴合形式的類毒素，例如不含未綴合的Tt的疫苗可以仍然包括Hib-τ。
[0028] 關(guān)于類毒素的術(shù)語(yǔ)"未綴合的"不是指用于制備綴合物、但無(wú)論什么原因已經(jīng)保持 作為未反應(yīng)的殘余類毒素或已經(jīng)變得去綴合的類毒素。因此，例如，是涉及類毒素的綴合反 應(yīng)，并且糖是不完全的，然后可以保留小殘余量的未反應(yīng)的類毒素（甚至純化之后），并且 如果綴合物然后與其他組分混合，這將被完成為組合物。類似地，如果綴合物被儲(chǔ)存長(zhǎng)時(shí)間 段或儲(chǔ)存在惡劣條件下，可以發(fā)生分解，使得發(fā)生去綴合。當(dāng)組合物據(jù)稱不含未綴合的類毒 素時(shí)，它仍然可以包括綴合后殘余類毒素或去綴合類毒素（如果這存在于當(dāng)制備組合物時(shí) 使用的綴合的類毒素組分中）。技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到有目的存在的未綴合的類毒素和相反 作為殘余污染物或作為分解產(chǎn)物存在的類毒素之間的差異，當(dāng)組合物確實(shí)不含未綴合的毒 素時(shí)，這將是容易理解的。例如，本發(fā)明涉及人疫苗，其是通過(guò)良好定義的方法制備的緊密 調(diào)節(jié)的產(chǎn)品，并且制備含有綴合的類毒素、但不含未綴合形式的該類毒素的組合物的技術(shù) 人員將不使用其中該類毒素從未經(jīng)受綴合反應(yīng)的組分；相反，制備含有未綴合的類毒素的 組合物的技術(shù)人員將不使用先前經(jīng)歷綴合反應(yīng)的類毒素。因此，當(dāng)疫苗被定義為不含有未 綴合的類毒素時(shí)，該類毒素的任何綴合后殘余形式或去綴合形式將占疫苗中該類毒素的總 量的〈10重量％(例如，〈5%、〈2%或〈1%)。
[0029] 當(dāng)疫苗意欲保護(hù)免于破傷風(fēng)時(shí)，它將包括足夠的免疫原性破傷風(fēng)類毒素以滿足歐 洲藥典對(duì)于破傷風(fēng)接種的要求（保護(hù)小鼠免于破傷風(fēng)毒素的致死攻擊）。類似地，當(dāng)疫苗意 欲保護(hù)免于白喉時(shí)，它將包括足夠的免疫原性白喉類毒素以滿足歐洲藥典對(duì)于白喉接種的 要求（保護(hù)豚鼠免于白喉毒素的致死攻擊）。
[0030] 具有未綴合的白喉類毒素、但沒(méi)有未綴合的破傷風(fēng)類毒素的疫苗 本發(fā)明的第一個(gè)方面用（a)含有未綴合的Dt、但不含有未綴合的Tt的疫苗；和（b)含 有綴合至Tt載體的糖的疫苗共同免疫。當(dāng)用（a)和（b)的共同免疫作為組合疫苗發(fā)生時(shí)， 這得到本發(fā)明的第四個(gè)方面。
[0031] 因此，這些疫苗不使用未綴合的Tt制備，并且為了保護(hù)免于破傷風(fēng)，它們反而 包括綴合至Tt載體的糖。此類與Tt載體綴合的糖包括但不限于：腦膜炎球菌糖，諸如 NEISVAC-C ?、MENHIBRIX ?、MENITORIX ?或N頂ENRIX ?產(chǎn)品中任一種中存在的綴合物；肺 炎球菌糖，諸如SYNFL0RIX?產(chǎn)品中存在的血清型18C綴合物；流感嗜血桿菌B型糖，諸如 HIBTITER ?、MENHIBRIX ?、MENITORIX ?或 HIBERIX ?產(chǎn)品中任一種中存在的綴合物。
[0032] 因此，本發(fā)明可以使用以下糖類中的一種或多種，其綴合至Tt載體：腦膜炎球菌 血清群A莢膜糖；腦膜炎球菌血清群C莢膜糖；腦膜炎球菌血清群Wl35莢膜糖；腦膜炎球 菌血清群X莢膜糖；腦膜炎球菌血清群Y莢膜糖；肺炎球菌血清型18C莢膜糖；腸道沙門氏 菌eflterica)血清變型Typhi (51 Typhi)毒力莢膜多糖（'Vi'）；和/或流 感嗜血桿菌B型莢膜糖。
[0033] 此外，疫苗可包括進(jìn)一步的糖，其綴合至非Tt載體，例如SYNFLORIX?產(chǎn)品中存在 的其他10種綴合物中的任一種。如果疫苗不包括來(lái)自腦膜炎球菌血清群A、C、W135和Y 的Tt-綴合的莢膜糖，它可包括這些作為如MENVE0?產(chǎn)品中的CRM197-綴合的糖類，或作為 如MENACTRA ?產(chǎn)品中的Dt-綴合的糖類。如果疫苗不包括來(lái)自肺炎球菌的Tt-綴合的莢 膜糖類，它可包括這些作為來(lái)自PREVNAR ?或PREVNAR13 ?產(chǎn)品中的CRM197-綴合的糖類。 如果疫苗不包括來(lái)自5： Typhi的Tt-綴合的Vi莢膜糖類，它可包括這作為Dt-綴合的或 CRM197-綴合的糖[5，6]。
[0034] 可用于在本發(fā)明的第一個(gè)方面內(nèi)共同免疫嬰兒和本發(fā)明的第四個(gè)方面的組合疫 苗的疫苗（a)和（b)的具體實(shí)例包括但不限于：

[0035] 第四個(gè)方面的六種特別優(yōu)選的組合疫苗是：（a) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt ; (b) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt、MenC-Tt ; (c) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt、MenC-CRM197 ; (d) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt、MenACWY-CRM197 ;(e) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt、MenACWY-Dt ; (f) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt、MenACWY-Tt ; (g) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt、MenX-Tt ;和 (h) Dt、aP、HBsAg、IPV、Hib-Tt、MenX-CRM197〇
[0036] 本發(fā)明的第八個(gè)方面提供了用于針對(duì)腦膜炎球菌疾病和破傷風(fēng)免疫嬰兒的方法， 其包括施用含有綴合至破傷風(fēng)類毒素載體的腦膜炎球菌莢膜糖的疫苗而不施用未綴合形 式的破傷風(fēng)類毒素的步驟。因此，所述綴合物用于針對(duì)腦膜炎球菌和破傷風(fēng)兩者的免疫，而 無(wú)需分別需要類毒素作為未綴合的免疫原。除了綴合物以外，與第八個(gè)方面使用的疫苗可 包括如此處詳述的進(jìn)一步抗原用于本發(fā)明的第一個(gè)方面。因此，疫苗可以保護(hù)免于不僅僅 腦膜炎球菌和破傷風(fēng)。
[0037] 具有未綴合的破傷風(fēng)類毒素、但沒(méi)有未綴合的白喉類毒素的疫苗 本發(fā)明的第二個(gè)方面用（a)含有未綴合的Tt、但不含有未綴合的Dt的疫苗；和（b)含 有綴合至Dt載體的糖的疫苗共同免疫。當(dāng)用（a)和（b)的共同免疫作為組合疫苗發(fā)生時(shí)， 這得到本發(fā)明的第五個(gè)方面。
[0038] 因此，這些疫苗不使用未綴合的Dt制備，并且為了保護(hù)免于白喉，它們反而包 括綴合至Dt載體的糖。此類與Dt載體綴合的糖包括但不限于：腦膜炎球菌糖，諸如 MENACTRA?產(chǎn)品中存在的綴合物；肺炎球菌糖，諸如SYNFLORIX?產(chǎn)品中存在的血清型19F 綴合物；流感嗜血桿菌B型糖，諸如PROHIBIT ?產(chǎn)品中存在的