專利名稱：一種egfr與her2聯(lián)合多肽表位疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體說(shuō)，涉及一種利用基因工程技術(shù)制備EGFR與 HER2聯(lián)合多肽表位疫苗。
背景技術(shù)：
HER家族是一類表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)家族，其家族成員有EGFR(HER1或 ErbBl)，HER2 (neu 或 ErbB2)，HER3 (ErbB3)和 HER4 (ErbB4)。HER 家族普遍表達(dá)于人體的表皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，能夠調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的增殖和分化，而其不正常的激酶活性的活化能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和增值，血管發(fā)生和轉(zhuǎn)移等，因此，在乳腺癌，非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌等上皮源性腫瘤細(xì)胞中，可以檢測(cè)到該家族及其突變體的過(guò)表達(dá)。鑒于此， 眾多研究者將HER家族作為治療腫瘤的靶分子。HER家族是一類巨大的I型跨膜糖蛋白，都有一個(gè)同源性很高的胞外配體結(jié)合區(qū)， 一個(gè)跨膜螺旋區(qū)以及一個(gè)結(jié)構(gòu)保守但功能不一的胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。其中，只有EGFR 和ErbB4在配體結(jié)合與激酶活性上是功能完全的。ErbB3沒(méi)有激酶活性，活化需要依賴其異二聚體配偶體活性；ErbB2不能與已知的任何一個(gè)ErbB配體結(jié)合，但能在形成異二聚體后發(fā)揮其潛在的激酶活性，并且在有絲分裂信號(hào)中ErbB2和ErbB3是最有效的異二聚體。 HER家族配體可根據(jù)其與受體是否直接結(jié)合而劃分，與EGFR結(jié)合的配體有表皮生長(zhǎng)因子 (EGF)，肝素結(jié)合EGF樣生長(zhǎng)因子(HBEGF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α (TGF α )，雙向調(diào)節(jié)蛋白(AR， amPhiregulin)，表皮調(diào)節(jié)素(EpR)，β-細(xì)胞素(BTC, betacellulin)等，與 ErbB3，ErbB4 結(jié)合的配體是 neuregulin (NRG)。在過(guò)去的十幾年里，大部分研究均集中在EGFR和HER2激酶活性的失調(diào)引起的腫瘤發(fā)生，近年來(lái)，HER3的作用受到了越來(lái)越多的重視，由于HER3缺乏酪氨酸激酶活性，以及依賴于HER3的PI3K/AKT途徑的持續(xù)活化，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃脫凋亡和生長(zhǎng)抑制，且大量證據(jù)表明，HER2的直接信號(hào)配偶體HER3在HER2介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要作用?？笻ER家族的藥物如單克隆抗體，小分子抑制劑等，鑒于上述，由于可變ErbB信號(hào)通路的活化，長(zhǎng)期使用這些小分子抑制劑會(huì)產(chǎn)生抗藥性。而且使用單克隆抗體進(jìn)行治療， 費(fèi)用昂貴，而且要達(dá)到有效的滴度，被動(dòng)抗體治療必須長(zhǎng)時(shí)間重復(fù)施藥。因此，尋求更加有效的抗HER家族藥物成為國(guó)內(nèi)外研究者一直不斷探索的目標(biāo)。國(guó)內(nèi)外對(duì)HER家族的研究主要集中于以下幾個(gè)方面1)制備各種針對(duì)HER家族的單克隆抗體如EGFR的單克隆抗體cetuximab(IMC-225) ；HER2的單克隆抗體 Trastuzumab (Herceptin)。這些單克隆抗體雖然已被FDA批準(zhǔn)用于某些癌癥的治療，但由于其價(jià)格昂貴，且被動(dòng)抗體治療必須長(zhǎng)時(shí)間重復(fù)施藥，很難在市面推廣。2)尋找有效靶位點(diǎn)制備各種小分子抑制劑Gefitinib (ZD1839，Ierssa)，是最早進(jìn)人臨床研究的EGFR酪氨酸激酶抑制劑。由于長(zhǎng)期使用這類小分子抑制劑，導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生。
3)利用siRNA技術(shù)阻斷HER家族受體的表達(dá)Gunamani Sithanandam 等人用 HER3siRNA 處理 A549 細(xì)胞(該細(xì)胞中 HER3 對(duì)其分裂，存活和遷移等起主要作用)，48h后，細(xì)胞數(shù)量下降，并且成劑量依賴性，這是因?yàn)閟iRNA 阻斷了細(xì)胞周期，引起細(xì)胞的編程性死亡和壞死。4)制備各種針對(duì)HER家族的疫苗關(guān)于HER家族的疫苗，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有諸多報(bào)道。Angelika B. Riemer等用噬菌體展示技術(shù)從循環(huán)的十倍體多肽庫(kù)中篩選出多肽，該肽模擬了能被cetuximab識(shí)別的表位， 從而制備出針對(duì)EGFR的表位疫苗，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其產(chǎn)生的抗體與cetuximab生物學(xué)特性相似。但這些疫苗都是單一的，只針對(duì)HER家族某一成員作用，對(duì)其他HER家族成員的作用則各有局限。 表位疫苗(印itope vaccine)是用抗原表位制備的疫苗。表位(epitope)是抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，又稱抗原決定簇(antigenic determinant)，它是 T細(xì)胞抗原受體(T cell receptor,TCR)和B細(xì)胞抗原受體(B cell receptor,BCR)及抗體特異結(jié)合的基本單位。在免疫應(yīng)答中，TCR和BCR所識(shí)別的抗原表位不同，分別稱為T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位。表位是抗原引起免疫應(yīng)答的關(guān)鍵部分，表位疫苗正是基于這一理論基礎(chǔ)提出來(lái)的。根據(jù)表位的不同，表位疫苗分為B表位疫苗、T表位疫苗和兼具兩種表位的多表位疫苗。表位疫苗具備不少傳統(tǒng)疫苗技術(shù)所不具備的優(yōu)勢(shì)，相對(duì)滅活減毒疫苗而言，它容易生產(chǎn)，擺脫了體外培養(yǎng)的限制；相對(duì)基因工程亞單位疫苗而言，它不包含任何病原生物的完整組分，徹底擺脫了潛在的威脅。且表位疫苗能通過(guò)隨機(jī)肽模擬糖分子表位，這是基因工程亞單位疫苗所無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。因而，表位疫苗是目前研制感染性疾病和惡性腫瘤疫苗的方向。由于缺乏天然蛋白的三維結(jié)構(gòu)，表位疫苗的分子小，免疫原性差，半衰期短，使機(jī)體無(wú)法產(chǎn)生免疫反應(yīng)，還可能引起免疫耐受，因此選擇乙肝病毒抗原(HBcAg)作為表位疫苗的載體可以解決這一問(wèn)題，而且該載體由于其優(yōu)越性越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外研究者的歡迎。HBcAg是由乙型肝炎病毒基因組的C區(qū)基因編碼一個(gè)氨基酸多肽。HBcAg全長(zhǎng)由 183個(gè)氨基酸組成，但只有N端的149個(gè)氨基酸是其在細(xì)菌中自組裝成病毒顆粒是必須的。 HBcAg N端第78-83位，第127-133位氨基酸殘基位于顆粒表面，并且前者是刺突尖部的組成部分。HBcAg作為一種顆粒性抗原，易被抗原呈遞細(xì)胞(APCs)攝取、加工、處理及呈遞，能激發(fā)機(jī)體較強(qiáng)體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有直接激活細(xì)胞應(yīng)答的作用，又具有激活細(xì)胞的表位，還可以自身凝聚成顆粒，故被認(rèn)為是理想的免疫載體。研究證實(shí)，在HBcAg的第73-94位兩保守甘氨酸間插入目的肽段的免疫原性最為理想，因?yàn)樵搮^(qū)域位于顆粒表面，去除該區(qū)域的某些特定氨基酸后，可以廢除本身的免疫原性，同時(shí)增強(qiáng)插人片斷的免疫原性，而且， 該區(qū)域可以插人肽段的長(zhǎng)度多達(dá)120個(gè)氨基酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種EGFR與HER2聯(lián)合多肽表位疫苗，以突破現(xiàn)有單一表位疫苗的局限，使聯(lián)合表位疫苗具有更廣泛的抗腫瘤活性。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的思路是選擇1個(gè)EGFR，2個(gè)HER2三個(gè)B細(xì)胞表位模擬多肽，并以乙肝核心抗原(HBcAg)為載體，制備HER家族聯(lián)合多肽表位疫苗。
具體的技術(shù)方案如下 一種EGFR與HER2聯(lián)合多肽表位疫苗，將HER家族HE R2的兩個(gè)B細(xì)胞表位模擬多肽I和II、HER家族EGFR的一個(gè)B細(xì)胞表位模擬多肽以串聯(lián)的形式插入到乙肝核心抗原 HBcAg的第78位氨基酸與第79位氨基酸之間，構(gòu)成的融合蛋白即為聯(lián)合多肽表位疫苗；其中，所述的HER家族HER2的B細(xì)胞表位模擬多肽I，其氨基酸序列如SEQ ID No 2所示，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No 1所示；所述的HER家族HER2的B細(xì)胞表位模擬多肽II，其氨基酸序列如SEQ ID No :4所示，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No 3所示；所述的HER家族EGFR的一個(gè)B細(xì)胞表位模擬多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No 6 所示，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示；所述的乙肝核心抗原HBcAg，其氨基酸序列如SEQ ID No :8所示，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No 7所示；所述的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No 10所示，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No 9所示。上述EGFR與HER2聯(lián)合多肽表位疫苗的制備方法，包括如下步驟(1)使用重疊PCR技術(shù)構(gòu)建融合蛋白基因；(2)將步驟(1)得到的融合蛋白基因經(jīng)雙酶切基因后與經(jīng)過(guò)雙酶切消化的表達(dá)載體pET28a連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體(3)將步驟(2)得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建重組菌表達(dá)融合蛋白；(4)將步驟(3)得到的表達(dá)后的重組菌經(jīng)細(xì)胞破碎，釋放出包涵體形式的融合蛋白，洗滌后，用尿素變性，再經(jīng)透析復(fù)性，獲得可溶性的融合蛋白即為EGFR與HER2聯(lián)合多肽表位疫苗。步驟(1)中，所述的融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No 9所示，即如SEQID No =USEQ ID No 3和SEQ ID No 5所示的核苷酸序列順序連接插入如SEQ ID =No 7所示的核苷酸序列的第234和第235個(gè)堿基之間；且在第一個(gè)氨基酸密碼子之前加上了起始密碼子ATG和限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，在最后一個(gè)氨基酸密碼子之后加上終止密碼子TAA 和限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。本發(fā)明中，加在合成基因首、末兩端的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)可以是任意的II類限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。步驟⑴中，使用重疊PCR技術(shù)構(gòu)建融合蛋白基因的具體方法如下利用引物Pl 和P2互為模板擴(kuò)增出片段FI ；以FI為模板，P5和P6為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增出片段FII ；以 PHBc為模板，P3和P4、P7和P8為引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增出片段FIII和FIV ；以FII、FIII 為模板，P3和P6為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出片段FV ；以FIV和FV為模板，P3和P8為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出融合蛋白基因。有益效果本研究利用分子克隆技術(shù)將EGFR和HER2的三個(gè)模擬表位插入HBcAg 的78-79位之間，并去除150-183位非必需序列，成功地構(gòu)建并表達(dá)了以HBcAg為載體的含 HER家族的蛋白疫苗。顆粒形式的蛋白疫苗能有效地呈現(xiàn)出抗原表位，刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組免疫小鼠血清中IgG的特異性和滴度均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其余三組；ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HBHE誘導(dǎo)的抗HBcAg的抗體效價(jià)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于抗HBHE的效價(jià)，說(shuō)明該融合蛋白在保持核心樣顆粒結(jié)構(gòu)的同時(shí)，其插入的抗原表位得以暴露，從而產(chǎn)生高效價(jià)的抗 HBHE特異性抗體，并且由于插入的抗原表位代替了乙肝核心抗原的免疫顯性區(qū)，使HBcAg 的免疫原性顯著下降。這樣便極大的減低了載體蛋白本身的免疫原性，大大增加了其今后臨床應(yīng)用的安全性。


圖IA為PCR合成HBcAg- Δ η融合基因流程；B為pET28a/HBcAg- Δ η酶切鑒定， M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1 重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，2 未酶切質(zhì)粒。圖2為HBcAg-Δη融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)分析，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1 超聲裂解上清，2 超聲裂解后沉淀，3 誘導(dǎo)全菌，4 未誘導(dǎo)全菌。圖3為HBcAg- Δ η純化分析。

圖4為免疫小鼠后抗血清滴度分析。圖5為間接ELISA法分析抗原特異性結(jié)果圖6為western blotting鑒定抗體特異性，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1 正常組，2 :PBS組， 3 對(duì)照組，4 實(shí)驗(yàn)組。圖7為western blot檢測(cè)免疫小鼠體內(nèi)多表位的產(chǎn)生，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1 非小細(xì)胞肺癌(A549), 2 卵巢癌(SK0V3)。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。本發(fā)明中，HER家族HER2的B細(xì)胞表位模擬多肽I，用厶表示，其氨基酸序列如SEQ ID No 2所示，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。HER家族HER2的B細(xì)胞表位模擬多肽II，用A2表示，其氨基酸序列如SEQ ID No: 4所示，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。HER家族EGFR的一個(gè)B細(xì)胞表位模擬多肽，用Δ3表示，其氨基酸序列如SEQ IDNo 6所示，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID Νο:5所示。乙肝核心抗原HBcAg，其氨基酸序列如SEQ ID No 8所示，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No 7所示。融合蛋白，用HBcAg-Δ 表示，其氨基酸序列如SEQ ID No 10所示，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No 9所示。融合蛋白基因經(jīng)雙酶切基因后與經(jīng)過(guò)雙酶切消化的表達(dá)載體pET28a連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體用pET28a/HBcAg- Δ η表示。化學(xué)試劑裂解細(xì)胞的裂解液配方如下100mM NaCl, 50mM Tris pH 8. 0,2mMEDTA, 1% Triton-XlOO，溶劑為水。溶解HBcAg-Δ η融合蛋白包涵體的試劑配方如下100mM NaCl, 50mM Tris pH8. 0,2mM EDTA, IOmM DTT，8M 尿素，溶劑為水。復(fù)性緩沖液配方如下IOOmMNaCl, 50mM Tris pH 8. 0,2mM EDTA, ImM DTT，2M 尿透析緩沖液是0. OlM PBS。實(shí)施例1 使用重疊PCR技術(shù)構(gòu)建融合蛋白基因。編碼HBcAg- Δ η蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO. 9)，在第一個(gè)氨基酸密碼子之前加上了起始密碼子ATG和限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，在最后一個(gè)氨基酸密碼子之后加上終止密碼子TAA和限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。利用引物Pl和P2互為模板擴(kuò)增出含三個(gè)B表位的片段FI (99bp)。PCR反應(yīng)試劑
和條件如下
IOxPCR buffer5 μ
SUMO2 μ1(10 ng)
Pl (IOmM)2 μ
Ρ2 (IOmM)2 μ
dNTP4 μ
Tag 酶0.5μ1(2.5υ)
Mg離子3 μ 補(bǔ)H2O至50 μ 1反應(yīng)條件如下
94 °C 3 min 94°C 30 sec
55°C 30 sec/30 Cycles
72°C 30 sec 72 °C 7 min冷卻至4°C，反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行1. 0% Agarose電泳鑒定并割膠回收目的條帶。以FI為模板，P5和P6為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增出片段FII (116bp)。PCR反應(yīng)試劑和
條件如下
權(quán)利要求
1.一種EGFR與HER2聯(lián)合多肽表位疫苗，其特征在于，將HER家族HER2的兩個(gè)B細(xì)胞表位模擬多肽I和II、HER家族EGFR的一個(gè)B細(xì)胞表位模擬多肽以串聯(lián)的形式插入到乙肝核心抗原HBcAg的第78位氨基酸與第79位氨基酸之間，構(gòu)成的融合蛋白即為聯(lián)合多肽表位疫苗；其中，所述的HER家族HER2的B細(xì)胞表位模擬多肽I，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No 1所示；所述的HER家族HER2的B細(xì)胞表位模擬多肽II，其氨基酸序列如SEQ ID No 4所示， 編碼該氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No 3所示；所述的HER家族EGFR的一個(gè)B細(xì)胞表位模擬多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No :6所示，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No 5所示；所述的乙肝核心抗原HBcAg，其氨基酸序列如SEQ ID No :8所示，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No 7所示；所述的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No :10所示，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID No 9所示。
2.權(quán)利要求1所述的EGFR與HER2聯(lián)合多肽表位疫苗的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)使用重疊PCR技術(shù)構(gòu)建融合蛋白基因；(2)將步驟(1)得到的融合蛋白基因經(jīng)雙酶切基因后與經(jīng)過(guò)雙酶切消化的表達(dá)載體 pET28a連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體(3)將步驟(2)得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建重組菌表達(dá)融合蛋白；(4)將步驟(3)得到的表達(dá)后的重組菌經(jīng)細(xì)胞破碎，釋放出包涵體形式的融合蛋白，洗滌后，用尿素變性，再經(jīng)透析復(fù)性，獲得可溶性的融合蛋白即為EGFR與HER2聯(lián)合多肽表位疫苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的EGFR與HER2聯(lián)合多肽表位疫苗的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No :9所示，即如SEQ ID No =USEQ ID No 3和SEQ ID No 5所示的核苷酸序列順序連接插入如SEQID =No 7所示的核苷酸序列的第234和第235個(gè)堿基之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的EGFR與HER2聯(lián)合多肽表位疫苗的制備方法，其特征在于， 步驟(1)中，使用重疊PCR技術(shù)構(gòu)建融合蛋白基因的具體方法如下利用引物Pl和P2互為模板擴(kuò)增出片段FI ；以FI為模板，P5和P6為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增出片段FII ；以pHBc為模板，P3和P4、P7和P8為引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增出片段FIII和FIV ；以FII、FIII為模板， P3和P6為引物進(jìn)行PCR,擴(kuò)增出片段FV ；以FIV和FV為模板，P3和P8為引物進(jìn)行PCR,擴(kuò)增出融合蛋白基因。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種EGFR與HER2聯(lián)合多肽表位疫苗，將HER家族HER2的兩個(gè)B細(xì)胞表位模擬多肽I和II、HER家族EGFR的一個(gè)B細(xì)胞表位模擬多肽以串聯(lián)的形式插入到乙肝核心抗原HBcAg的第78位氨基酸與第79位氨基酸之間，構(gòu)成的融合蛋白即為聯(lián)合多肽表位疫苗。本發(fā)明的EGFR與HER2聯(lián)合多肽表位疫苗，突破了現(xiàn)有單一表位疫苗的局限，使聯(lián)合表位疫苗具有更廣泛的抗腫瘤活性。
文檔編號(hào)C12N15/62GK102357246SQ201110340799
公開(kāi)日2012年2月22日 申請(qǐng)日期2011年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月2日
發(fā)明者盧悟廣, 季夏蕓, 曹鵬, 王志剛, 胡云龍, 胡春萍, 蔡雪婷 申請(qǐng)人:江蘇省中醫(yī)藥研究院