脂酰肌醇，這在天然HBV病毒體中不存在。該顆粒還 可包括無(wú)毒量的LPS，以便刺激免疫系統(tǒng)[49]。所述顆粒可以保留非離子表面活性劑（例 如聚山梨醇酯20)，如果這是在酵母的破壞過(guò)程中使用[50]。
[0159] 在細(xì)胞破壞后，HBsAg純化的優(yōu)選方法涉及：超濾；大小排阻層析；陰離子交換層 析；超速離心；脫鹽；和過(guò)濾除菌。細(xì)胞破壞（例如，使用聚乙二醇）后，可沉淀裂解物，將 HBsAg留在溶液中，準(zhǔn)備進(jìn)行超濾。
[0160] 純化后，HBsAg可經(jīng)受透析（例如用半胱氨酸），其可用于去除可能在HBsAg制備 過(guò)程中已經(jīng)使用的任何汞防腐劑諸如硫柳汞[51]。優(yōu)選不含硫柳汞的制劑。
[0161] HBsAg 優(yōu)選來(lái)自 HBV 亞型 adw2。
[0162] HBsAg的量通常以微克表示。如果本發(fā)明的疫苗包括HBsAg，則每單位劑量的正常 量是 5-25Pg，例如 IOPg 或 2〇Pg。
[0163] 如果組合物包括鋁鹽佐劑，則HBsAg可吸附至其上（優(yōu)選吸附至磷酸鋁佐劑上）。
[0164] Hib綴合物 流感嗜血桿菌b型（'Hib'）引起細(xì)菌性腦膜炎。Hib疫苗通?；?PRP'莢膜糖抗 原（例如，參考文獻(xiàn)4的第14章），其制備是充分記載的（例如參考文獻(xiàn)52-61)。將Hib糖 綴合至載體蛋白以增強(qiáng)其免疫原性，特別是在兒童中。典型的載體蛋白是破傷風(fēng)類毒素、白 喉類毒素、白喉類毒素的CRM197衍生物、或來(lái)自血清群B腦膜炎球菌的外膜蛋白復(fù)合物。 破傷風(fēng)類毒素是有用的載體，如通常被稱為'PRP-T'或'Hib-T'的產(chǎn)品中所使用，即共價(jià)結(jié) 合至破傷風(fēng)蛋白的純化的Hib磷酸多核糖基核糖醇莢膜多糖。PRP-T可通過(guò)以下制備：使 用溴化氰活化Hib莢膜多糖，將活化的糖偶聯(lián)至己二酸接頭（諸如（1-乙基-3-(3-二甲基 氨基丙基）碳二亞胺），通常為鹽酸鹽），然后使接頭-糖實(shí)體與破傷風(fēng)類毒素載體蛋白反 應(yīng)。CRM197是用于本發(fā)明的組合物中的Hib綴合物的另一種有用的載體（例如，如'HbOC' 和'Vaxem-Hib'產(chǎn)品中所見(jiàn)）。
[0165] 綴合物的糖部分可包含從Hib細(xì)菌制備的全長(zhǎng)磷酸多核糖基核糖醇（PRP)，和/或 全長(zhǎng)PRP的片段?？墒褂镁哂? : 5(即過(guò)量蛋白）至5 : 1(即過(guò)量糖）的糖：蛋白比率 (w/w)的綴合物，例如，比例在1 : 2至5 : 1的比率和1 : 1.25至1 : 2. 5的比率。然 而，在優(yōu)選的疫苗中，糖與載體蛋白的重量比為1 : 2.5至1 : 3.5。在破傷風(fēng)類毒素作為 抗原和作為載體蛋白兩者存在的疫苗中，綴合物中糖與載體蛋白的重量比可為1 : 0.3至 I : 2[62]。Hib綴合物的施用優(yōu)選導(dǎo)致20. 15Pg/ml、且更優(yōu)選2lKg/ml的抗PRP抗體濃度， 并且這些是標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)閾值。
[0166] Hib抗原的量通常以糖的微克數(shù)表示。如果本發(fā)明的組合物包括Hib抗原，則每單 位劑量的正常量是5_15Pg，例如IOPg或12Pg。
[0167] 如上所述，綴合物中的莢膜糖與載體蛋白的比率可以變化，使得所述綴合物可以 提供足夠的類毒素以滿足對(duì)于保護(hù)的最低功效要求，和足夠的糖以提供所需劑量。該比率 將根據(jù)類毒素的特定功效而變化。因此，Hib綴合物中的糖：類毒素質(zhì)量比可以變化，具有 過(guò)量糖（以質(zhì)量計(jì)），等量的兩者（例如，IOKg Hib糖綴合至IOPg類毒素），或者過(guò)量載體 (以質(zhì)量計(jì)）。過(guò)量載體蛋白是典型的。
[0168] 如果疫苗包括鋁鹽佐劑，則Hib抗原可吸附至其上，或可以是未吸附的。
[0169] 腦膜炎球菌莢膜糖綴合物 當(dāng)組合物包括腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖綴合物時(shí)，可以存在一種或多于一種此類綴 合物。包括血清群A、C、W135和Y中的2種、3種或4種是典型的，例如A+C、A+W135、A+Y、 C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、A+W135+Y、A+C+W135+Y 等。包括來(lái)自所有四種血清 群A、C、W135和Y的糖的組分是有用的，如在MENVEO ?、MENACTRA ?和N頂ENRIX ?產(chǎn)品中。 也可能包括血清群X腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜糖的綴合物。
[0170] 當(dāng)包括來(lái)自多于一種血清群的綴合物時(shí)，這些優(yōu)選分開制備、分開綴合、然后組 合。它們可以以基本上相等的質(zhì)量存在，例如每種血清群的糖的質(zhì)量在彼此的土 10%之內(nèi)。 每種血清群的典型量為IKg至2〇μ8,例如每種血清群2至10 μ8,或約4μ8或約5 μ g或約 10 μ g。作為基本上相等比率的替代方案，可以使用雙倍質(zhì)量的血清群A糖（如在MENVE0? 產(chǎn)品中）。
[0171] 綴合物的施用優(yōu)選導(dǎo)致針對(duì)相關(guān)血清群的血清殺菌測(cè)定（SBA)滴度增加至少4 倍，優(yōu)選至少8倍。SBA滴度可使用幼兔補(bǔ)體或人補(bǔ)體測(cè)量[63]。
[0172] 血清群A腦膜炎球菌的莢膜糖（'MenA'）是（a 1 - 6)-連接的A乙?；?D-甘 露糖胺-1-磷酸酯（其在C3和C4位置具有部分0-乙?；┑木畚?。C-3位置的乙酰 化可以是70-95%。用于純化糖的條件可導(dǎo)致去-0-乙?；ɡ缭趬A性條件下），但保留 該C-3位置的OAc是有用的。在一些實(shí)施方案中，血清群A糖中的至少50% (例如，至少 60 %、70 %、80 %、90 %、95 %或更多）甘露糖胺殘基在C-3位置被0-乙?；Ｒ阴；梢杂?封閉基團(tuán)取代，以防止水解[64]，并且此類修飾的糖仍然是本發(fā)明的含義內(nèi)的血清群A糖。
[0173] 血清群C ( 'MenC'）莢膜糖是（α 2 -9)-連接的唾液酸乙酰基神經(jīng)氨酸， 或'NeuNAc'）的均聚物。該糖結(jié)構(gòu)被寫作一9)-Neu NAc 7/8 OAc-(α 2-。大多數(shù)血 清群C菌株在唾液酸殘基的C-7和/或C-8具有0-乙?；?，但約15 %的臨床分離株缺乏 這些0-乙?；鵞65，66]。OAc基團(tuán)的存在或不存在生成獨(dú)特表位，且抗體結(jié)合糖的特異性 可影響其針對(duì)〇-乙?；∣Ac-)和去-0-乙?；∣Ac+)菌株的殺菌活性[67-69]。用于 本發(fā)明的血清群C糖類可從OAc+或OAc-菌株制備。批準(zhǔn)的MenC綴合物疫苗包括OAc -(NEISVAC-Ctm)和 OAc+ (MENJUGATE? & MENINGITEC?)糖類兩者。在一些實(shí)施方案中，用 于產(chǎn)生血清群C綴合物的菌株是OAc+菌株，例如血清型16的菌株，血清亞型PL 7a，1等。 因此，可以使用C:16:P1. 7a，I OAc+菌株。血清亞型PL 1的OAc+菌株也是有用的，諸如 Cll菌株。優(yōu)選的MenC糖取自O(shè)Ac+菌株，諸如菌株Cll。
[0174] 血清群W135( 'MenW'）莢膜糖是唾液酸-半乳糖二糖單元的聚合物。如血清群C 糖，它具有不同的0-乙?；?和9位置的唾液酸[70]。其結(jié)構(gòu)可寫作：一4) -D-Neup 5Ac (7/90Ac) - α - (2 - 6) -D-Gal- a - (1 -。
[0175] 血清群X ( 'MenX'）莢膜糖是α I - 4-連接的N-乙?；咸前?-磷酸酯的聚 合物。血清群X結(jié)構(gòu)被寫作：一4) - a -D-GIc/jNAc- (1 - 0P03-。
[0176] 血清群Y( 'MenY'）糖類似于血清群W135糖，除了二糖重復(fù)單元包含葡萄糖而非 半乳糖。如血清群W135,它在7和9位置的唾液酸具有不同的0-乙酰化[70]。血清群Y 結(jié)構(gòu)可寫作：一4)-D-Neu/?5Ac(7/90Ac)-a - (2 - 6)-D-Glc_a - (1 -。
[0177] 根據(jù)本發(fā)明使用的糖可以如上所述被0-乙?；ɡ纾哂信c天然莢膜糖中所見(jiàn) 相同的0-乙?；Ｊ剑?，或者它們可以在糖環(huán)的一個(gè)或多個(gè)位置被部分或完全去-〇-乙酰 化，或者它們可以相對(duì)于天然莢膜糖被高（hyp er)-〇-乙酰化。例如，參考文獻(xiàn)71報(bào)道了使 用超過(guò)80%被去-0-乙?；难迦篩糖。
[0178] 腦膜炎球菌綴合物中的糖部分可包含制備自腦膜炎球菌的全長(zhǎng)糖類，和/或可包 含全長(zhǎng)糖類的片段，即糖類可短于在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的天然莢膜糖。因此，將糖類解聚，其中解 聚在糖純化過(guò)程中或之后、但在綴合之前發(fā)生。解聚降低了糖類的鏈長(zhǎng)。一種解聚方法涉及 使用過(guò)氧化氫[72]。將過(guò)氧化氫添加至糖（例如得到1 %的最終H2O2濃度），然后孵育（例 如在約55°C )混合物，直到已經(jīng)實(shí)現(xiàn)期望的鏈長(zhǎng)降低。另一種解聚方法涉及酸水解[73]， 并且其他方法包括微流化或超聲處理[74]。其他解聚方法是本領(lǐng)域已知的。用來(lái)制備用 于本發(fā)明的綴合物的糖類可通過(guò)這些解聚方法中的任一種獲得?？梢允褂媒饩蹃?lái)提供免 疫原性的最佳鏈長(zhǎng)和/或針對(duì)糖類的物理可操作性降低鏈長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，糖類具 有以下范圍的平均聚合度（Dp) :A=10-20;C=12-22;W135=15-25;Y=15-25。對(duì)于所有血清 群，在分子量而非 Dp 方面，有用范圍為：〈100kDa ;5kDa-75kDa ;7kDa-50kDa ;8kDa-35kDa ; 12kDa-25kDa;15kDa-22kDa。在其他實(shí)施方案中，來(lái)自腦膜炎球菌血清群A、C、W135和Y 中每種的糖的平均分子量可以是大于50kDa，例如275kDa、21〇〇kDa、211〇kDa、2120kDa、 2130kDa等[74]，甚至至多達(dá)1500kDa，特別是通過(guò)MALLS測(cè)定。例如：MenA糖的范圍可以 是50-500kDa，例如60-80kDa ;MenC糖的范圍可以是100-210kDa ;MenW135糖的范圍可以是 60-190kDa，例如 120-140kDa ;和 / 或 MenY 糖的范圍可以是 60-190kDa，例如 150-160kDa。
[0179] 如果組分或組合物包括Hib和腦膜炎球菌綴合物兩者，則在一些實(shí)施方案中，Hib 糖的質(zhì)量可以與特定腦膜炎球菌血清群糖的質(zhì)量基本上相同。在一些實(shí)施方案中，Hib糖的 質(zhì)量將大于（例如，至少1.5x)特定腦膜炎球菌血清群糖的質(zhì)量。在一些實(shí)施方案中，Hib 糖的質(zhì)量將小于（例如，小至少1.5x)特定腦膜炎球菌血清群糖的質(zhì)量。
[0180] 當(dāng)組合物包括來(lái)自多于一種腦膜炎球菌血清群的糖，存在每種血清群的平均糖質(zhì) 量。如果使用每種血清群的基本上相等的質(zhì)量，則平均質(zhì)量與每種單獨(dú)質(zhì)量將是相同的；當(dāng) 使用不相等質(zhì)量，則平均值將是不同的，例如，對(duì)于MenACWY混合物具有10:5:5:5 μ g量， 平均質(zhì)量是6. 25 μ g/血清群。在一些實(shí)施方案中，Hib糖的質(zhì)量將與腦膜炎球菌糖的平均 質(zhì)量/血清群是基本上相同的。在一些實(shí)施方案中，Hib糖的質(zhì)量將大于（例如，至少I. 5x) 腦膜炎球菌糖的平均質(zhì)量/血清群。在一些實(shí)施方案中，Hib糖的質(zhì)量將小于（例如，至少 I. 5x)腦膜炎球菌糖的平均質(zhì)量/血清群[75]。
[0181] 如上所述，綴合物中的莢膜糖與載體蛋白的比率可以變化，使得所述綴合物可以 提供足夠的類毒素以滿足對(duì)于保護(hù)的最低功效要求，和足夠的糖以提供所需劑量。該比率 將根據(jù)類毒素的特定功效而變化。因此，腦膜炎球菌綴合物中的糖：類毒素質(zhì)量比可以變 化，具有過(guò)量糖（以質(zhì)量計(jì)），等量的兩者（例如，1〇呢腦膜炎球菌糖綴合至1〇呢類毒素）， 或者過(guò)量載體（以質(zhì)量計(jì)）。過(guò)量載體蛋白是典型的。例如，MENACTRA?產(chǎn)品具有16 μ g糖 (4 μ g/血清群）和48 μ g白喉類毒素，而NMENRIXtm產(chǎn)品具有20 μ g糖（5 μ g/血清群）和 44 μ g破傷風(fēng)類毒素。
[0182] 當(dāng)疫苗組合物包括來(lái)自多于一種血清群的莢膜糖時(shí)，優(yōu)選的是，每種單獨(dú)綴合物 使用相同的載體蛋白。因此，用于腦膜炎球菌糖的載體蛋白可以是CRM197 (如MENVEO ?產(chǎn) 品中），Dt (如MENACTRA ?產(chǎn)品中），或Tt (如在NMENRIX ?產(chǎn)品中）。然而，在一些實(shí)施方 案中，不同的血清群可以使用不同的載體，例如綴合至CRM197的至少一種血清群，且綴合 至Tt的至少一種血清群。
[0183] 肺炎球菌莢膜糖綴合物 肺炎鏈球菌引起細(xì)菌性腦膜炎，并且現(xiàn)有的疫苗基于莢膜糖類。因此，本發(fā)明的疫苗組 合物可包括至少一種綴合至載體蛋白的肺炎球菌莢膜糖。
[0184] 本發(fā)明可包括來(lái)自一種或多種不同肺炎球菌血清型的莢膜糖。當(dāng)組合物包括來(lái)自 多于一種血清型的糖抗原時(shí)，這些優(yōu)選地單獨(dú)制備，單獨(dú)綴合，然后組合。用于純化肺炎球 菌莢膜多糖的方法是本領(lǐng)域已知的（例如參見(jiàn)參考文獻(xiàn)76)，并且多年已知基于來(lái)自23種 不同血清型的純化糖的疫苗。已經(jīng)描述了這些方法的改進(jìn)，例如，對(duì)于血清型3,如參考文獻(xiàn) 77中所述，或者對(duì)于血清型1、4、5、6六、68、7?和19六，如參考文獻(xiàn)78中所述。
[0185] 肺炎球菌莢膜糖將通常選自以下血清型：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、 11八、12?、14、158、17?、18(：、19厶、19?、20、22?、23?和/或33?。因此，總共，組合物可以包括 來(lái)自 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或更多種不同 的血清型的莢膜糖。包括至少血清型6B糖的組合物是有用的。
[0186] 有用的血清型組合是7價(jià)組合，例如包括來(lái)自4、6B、9V、14、18C、19F和23F各血 清型的莢膜糖。另一種有用組合是9價(jià)組合，例如包括來(lái)自1、4、5、68、利、14、18(：、19?和 23F各血清型的莢膜糖。另一種有用組合是10價(jià)組合，例如包括來(lái)自1、4、5、6B、7F、9V、 14、18C、19F和23F各血清型的莢膜糖。11價(jià)組合可進(jìn)一步包括來(lái)自血清型3的糖。可以 將12價(jià)組合添加至10價(jià)混合物：血清型6A和19A ;6A和22F ;19A和22F ;6A和15B ;19A 和15B ;或22F和15B。可以將13價(jià)組合添加至11價(jià)混合物：血清型19A和22F ;8和12F ; 8 和 15B ;8 和 19A ;8 和 22F ;12F 和 15B ;12F 和 19A ;12F 和 22F ;15B 和 19A ;15B 和 22F ;6A 和19A等。
[0187] 因此，有用的13價(jià)組合包括來(lái)自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19 (或 19A)、19F和23F的莢膜糖，例如如參考文獻(xiàn)79-82中所公開制備。一種此類組合包括約 8 μ g/ml的血清型6B糖和濃度各約4 μ g/ml的其他12種糖。另一種此類組合包括各約 8 μ g/ml的血清型6A和6B糖和各約4 μ g/ml的其他11種糖。
[0188] 用于肺炎球菌綴合物疫苗的特別有用的載體蛋白是CRM197、破傷風(fēng)類毒素、白喉 類毒素和流感嗜血桿菌蛋白D。CRM197用于PREVNAR?中。13價(jià)混合物可使用CRM197作 為13種綴合物中每種的載體蛋白，并且CRM197可以約55-60 μ g/ml存在。
[0189] 當(dāng)組合物包括來(lái)自多于1種肺炎球菌血清型的綴合物時(shí)，對(duì)于各單獨(dú)綴合物可使 用相同的載體蛋白或使用不同的載體蛋白。盡管在兩種情況下，不同綴合物的混合物將通 常通過(guò)單獨(dú)制備各血清型綴合物，然后將其混合以形成單獨(dú)綴合物的混合物而形成。參 考文獻(xiàn)83描述了當(dāng)在多價(jià)肺炎球菌綴合物疫苗中使用不同載體蛋白時(shí)的潛在優(yōu)勢(shì)，但從 PREVNAR ?產(chǎn)品已知相同的載體可用于多種不同的血清型。
[0190] 肺炎球菌糖可包含制備自肺炎球菌的全長(zhǎng)完整糖，和/或可包含全長(zhǎng)糖的片段， 即所述糖可比細(xì)菌中所見(jiàn)的天然莢膜糖更短。因此，多糖可以解聚，其中解聚在糖純化過(guò)程 中或者之后、但在綴合之前發(fā)生。解聚降低糖的鏈長(zhǎng)。可使用解聚以提供對(duì)于免疫原性的 最佳鏈長(zhǎng)和/或針對(duì)糖的物理可操作性而降低鏈長(zhǎng)。當(dāng)使用多于一種肺炎球菌血清型時(shí)， 則可使用各血清型的完整糖、各血清型的片段，或使用一些血清型的完整糖和其他血清型 的片段。
[0191] 當(dāng)組合物包括來(lái)自血清型4、68、利、14、19?和23?中任一種的糖時(shí)，這些糖優(yōu)選是 完整的。相反，當(dāng)組合物包含來(lái)自血清型18C的糖時(shí)，