基于谷氨酸合酶的工程菌及其實現(xiàn)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】的谷氨酸合酶的工程菌及其實現(xiàn)方法，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有酶切位點的引物進行PCR擴增依次得到編碼谷氨酸合酶小亞基及大亞基的核苷酸序列；然后將擴增得到的基因序列依次連接到共表達載體pETDuet‐1，最終獲得重組共表達載體pETDuet‐GG‐GF；之后將該谷氨酸合酶表達載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達菌株。本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的由于谷氨酸合酶在生物體內(nèi)多為胞內(nèi)酶且表達量較低導致的應用范圍和效果嚴重受限等不足，應用基因工程手段實現(xiàn)其體外的大量表達合成，此外本發(fā)明通過在重組蛋白添加聚組氨酸標簽的方法，方便了后期蛋白的純化。
【專利說明】基于谷氨酸合酶的工程菌及其實現(xiàn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及的是一種生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】的基因及其工程菌株，具體是一種灰 略紅鏈霉菌的基于谷氨酸合酶的工程菌及其實現(xiàn)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 氮是植物生長發(fā)育過程中最重要的營養(yǎng)元素之一。目前，維持或提高作物產(chǎn)量的 主要方法是大量施肥，然而氮肥的大量施用，不僅增加了農(nóng)民的生產(chǎn)成本，而且會加劇水體 的富營養(yǎng)化及溫室氣體的排放。
[0003] 對作物而言，能夠吸收同化N〇r、NH4+及氨態(tài)N等不同氮素形態(tài)，但是一般以 Ν0Γ為主要氮源。植物以Ν0Γ為氮源時，氮同化可以分為3個階段：（1)氮的無機同化 (Ν〇Γ-Ν02-ΝΗ 4+) ;(2)氨的同化，即NH4+經(jīng)過谷氨酰胺合成酶（GS)合成谷氨酰胺，再由谷 氨酰胺經(jīng)谷氨酸合酶（G0GAT)合成谷氨酸；（3)氨的有機同化，即由谷氨酰胺和谷氨酸合成 其它氨基酸，進而合成蛋白質(zhì)和其他物質(zhì)。由此可見，谷氨酸合酶在氮同化通路中起著十分 關(guān)鍵的作用。
[0004] 谷氨酸合酶，又稱谷氨酰胺-2 -氧代（α酮）戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶，縮寫為G0GAT。 此酶可催化谷氨酰胺的胺基在NAD(P)H或還原型鐵氧還蛋白的存在下，還原轉(zhuǎn)移于α -酮 戊二酸，生成2分子谷氨酸。在自然界，谷氨酸合酶主要分為兩類，第一類是以NAD (Ρ) Η為 電子供體的NADH-G0GAT型，多定位于非綠色組織的前質(zhì)體中；另一類是以鐵氧還蛋白（Fd) 為電子供體的Fd -G0GAT型，多定位于葉綠體中。在原核生物、酵母菌及高等植物的非綠色 組織中，多以NADPH型谷氨酸合酶存在。當細胞周圍氨的濃度過高時，谷氨酸合酶的活性會 受到抑制，此外谷氨酸合酶在細胞內(nèi)內(nèi)多為胞內(nèi)酶表達且表達量較低。NH4+生成氨基酸的 活體合成主要是通過谷氨酸來實現(xiàn)的，因此谷氨酸合酶在生物體內(nèi)的氮代謝途徑中發(fā)揮至 關(guān)重要的作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的由于谷氨酸合酶在生物體內(nèi)多為胞內(nèi)酶且表達量較 低導致的應用范圍和效果嚴重受限等不足，提出一種基于谷氨酸合酶的工程菌及其實現(xiàn)方 法，能夠應用基因工程手段實現(xiàn)其體外的大量表達合成，此外本發(fā)明通過在重組蛋白添加 聚組氨酸標簽的方法，方便了后期蛋白的純化，可為谷氨酸合酶的規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)提供一 種新的途徑。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0007] 本發(fā)明涉及一種谷氨酸合酶的工程菌，該工程菌為外源表達谷氨酸合酶的大腸桿 菌。
[0008] 所述的胞內(nèi)谷氨酸合酶具體為灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD -1谷氨酸合酶編碼基因，由谷氨酸合酶大亞基和小亞基構(gòu)成，其中：谷氨酸合酶大亞基 SG - GF的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，谷氨酸合酶小亞基SG - GG的核苷酸如SEQ ID No. 2所示，分別編碼1503和496個氨基酸。
[0009] 所述的谷氨酸合酶編碼基因通過全基因組測序和PCR擴增的方式克隆獲得。
[0010] 所述的灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1，現(xiàn)保藏于中國普通 微生物菌種保藏管理中心（CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 5706,保藏日期為2012年1月9 日，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所郵編100101。 [0011] 本發(fā)明涉及上述工程菌的實現(xiàn)方法，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有 酶切位點的引物進行PCR擴增依次得到編碼谷氨酸合酶小亞基及大亞基的核苷酸序列； 然后將擴增得到的基因序列依次連接到共表達載體pETDuet - 1，最終重組共表達載體 pETDuet - GG - GF ;之后將該谷氨酸合酶表達載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達菌株內(nèi)，獲得谷氨酸 合酶過表達重組菌株。
[0012] 所述的含有酶切位點的引物包括：
[0013] GF - Nde I - F:GTACATATGTACGACCCCCGCAACGAGCACGAC
[0014] GF - EcoR V - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGGCCATTGATCGCCGCCT
[0015] GG - Nco I - F:ACCATGGCAGATCCCAAGGGTTTCCTCACCAC
[0016] GG _ EcoR I _ R:CGATATCTCAATGATGATGATGATGATGGACGGTCATGGGCCGGT
[0017] 所述的PCR擴增的條件為：98°C預變性3min ;98°C變性10s，55°C退火15s，68°C延 伸2min ;30個循環(huán)后68°C終延伸5min。
[0018] 所述的大腸桿菌表達菌株為Transetta(DE3)大腸桿菌。
[0019] 本發(fā)明涉及一種谷氨酸合酶的工程菌的應用，將其用于谷氨酸合酶的體外高效表 達，并最終實現(xiàn)谷氨酸的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)。 技術(shù)效果
[0020] 現(xiàn)有谷氨酸合酶在灰略紅鏈霉菌內(nèi)為胞內(nèi)酶且表達量很低，因此嚴重限制了其使 用范圍和效果；與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種全新的谷氨酸合酶基因序列；在特殊 條件下（如高溫以及堿性）具有更穩(wěn)定的生物學活性；本發(fā)明通過構(gòu)建外源表達載體，實現(xiàn) 了谷氨酸合酶的體外過表達，并通過在表達重組蛋白C端添加聚組氨酸標簽的方法，維持 蛋白活性的同時也最大程度的保證了蛋白純度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為基于KEGG的灰略紅鏈霉菌硝酸鹽代謝通路預測圖；
[0022] 圖2為不同濃度硝酸鹽培養(yǎng)下谷氨酸合酶表達量變化圖；
[0023] 圖3為谷氨酸合酶大亞基（F)及小亞基（G)信號肽預測圖。

【具體實施方式】
[0024] 下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施 例。 實施例1
[0025] 本實施例包括以下步驟：
[0026] 1)灰略紅鏈霉菌的分離及培養(yǎng)
[0027] 灰略紅鏈霉菌分離自上海市浦江鎮(zhèn)收集的腐爛秸桿，保藏編號為CGMCC No. 5706。 將該菌種接種于LB液體培養(yǎng)基，32 °C培養(yǎng)48h。
[0028] 上述LB液體培養(yǎng)基組分為：蛋白胨10. Og/L，酵母提取物5. Og/L，NaCl 10. Og/L， pH6. 8 - 7. 2。在液體培養(yǎng)基中加入15. 0 - 20. Og/L瓊脂即得LB固體培養(yǎng)基。
[0029] 2)基因組DNA提取
[0030] 收集2. OmL菌液，12000rpm離心2min。棄上清，收集菌體沉淀，加入180μ L溶菌酶 (20mg/mL)和 20yL EDTA 溶液（0.5M，pH 8.0)，37°C 處理 45min，加入 4yL RNase A(100mg/ mL)，震蕩混勻15s，室溫放置5min，隨后按照細菌DNA提取試劑盒（TIANGEN)操作說明完成 剩余操作，得到高純度基因組DNA。通過0. 8%瓊脂糖凝膠電泳確定基因組DNA質(zhì)量，確保 無明顯RNA條帶，基因組條帶清洗、完整、無降解、無污染。
[0031] 3)基因組測序
[0032] 確定全基因組鳥槍法（WGS)策略，采用第二代測序技術(shù)，構(gòu)建不同插入片段長度 的文庫，采用Illumina Miseq(2X250bp)平臺進行測序。收集測序的原始數(shù)據(jù)，對帶接頭、 低質(zhì)量的數(shù)據(jù)進行過濾，隨后采用Newbler v2. 8對去除接頭的測序數(shù)據(jù)進行從頭拼接，構(gòu) 建contig及scaffold,最后使用GapCloser程序進行缺口填補得到鏈霉菌基因組草圖。
[0033] 4)蛋白編碼基因功能預測
[0034] 采用Glimmer 3. 0軟件對全基因組序列進行基因預測。基因預測模型選取自我訓 練基因預測模型，即提取拼裝序列中最長的序列，以該序列作為基因預測模型訓練的序列。 然后以該序列構(gòu)建的基因預測模型，對所有序列進行基因預測，設(shè)定開放閱讀框的長度為 ll〇bp，其余參數(shù)為Glimmer 3. 0的默認設(shè)置。
[0035] KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)，是基因組破譯方面的數(shù)據(jù) 庫。KEGG注釋的主要目的包括兩個：K0(KEGG Ortholog)注釋，即將分子網(wǎng)絡的相關(guān)信息進 行跨物種注釋；KEGG Pathway注釋，即代謝通路注釋，獲得物種內(nèi)分子間相互作用和反應的 網(wǎng)絡。
[0036] 蛋白編碼基因的K0及Pathway注釋主要采用KEGG的KAAS自動化注釋系統(tǒng)完 成，其中基因集選擇"For Prokaryote"，基因 K0的傳遞規(guī)則選取bi - directional best hit (BBH)。K0注釋完成后，將K0映射到相應的KEGG Pathway通路上，得到硝酸鹽KEGG代 謝通路（圖1)。
[0037] 5)總RNA的提取
[0038] 將鏈霉菌接種于以KN03S唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基，32°C、150rpm條件下培養(yǎng) 72h。每ia取樣，離心收集菌體沉淀，并按細菌總RNA提取試劑盒要求（TIANGEN)提取高 純度的鏈霉菌總RNA。
[0039] 上述無機鹽培養(yǎng)基組分為：葡萄糖20g/L，ΚΗ2Ρ041· 0g/L，NaCl 0.5g/L,MgS040.25g/L,CaCl2* 2H20 0. lg/L,FeS04* 7H20 0. 0 1 g/L 及 KN03(10mM, 30mM, 50mM, lOOmM)〇
[0040] 6)谷氨酸合酶表達水平測定
[0041] 根據(jù)谷氨酸合酶小亞基基因序列，通過DNAMAN 6. 0軟件設(shè)計特異性PCR引物，弓丨 物序列如下：
[0042] GF - F:CGGTGTGCCGTTCTGTCA
[0043] GF - R:AAGTTGTTCGTGGCGTGC
[0044] 同樣的，根據(jù)16S rRNA的特異性序列設(shè)計引物，并作為內(nèi)參基因，引物序列如下：
[0045] 16S rRNA - F:CGTATTCACCGCAGCAATGC
[0046] 16S rRNA - R:GCGAGGTGGAGCGAATCTCA
[0047] 以鏈霉菌總RNA模板進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA文庫，并按照熒光定量PCR試劑盒 (TaKaRa)要求進行相關(guān)操作。設(shè)置三個重復，待實驗完成收集處理數(shù)據(jù)，分析在不同濃度 ΚΝ03作用下，谷氨酸合酶的表達量（如圖2)。結(jié)果表明，隨著時間的延長和ΚΝ03濃度的升 高，該谷氨酸合酶的表達量顯著上調(diào)，證明該基因參與硝酸鹽的代謝過程。
[0048] 上述的熒光定量PCR的反應條件為：95°C預變性30s ;95°C變性10s，60°C退火 30s，72°C延伸15s，共40個循環(huán)。
[0049] 7)谷氨酸合酶膜定位預測
[0050] 采用SignalP 4. 1分別對谷氨酸合酶大亞基及小亞基序列進行信號肽模擬預測， 如圖3所示。結(jié)果表明谷氨酸合酶大亞基及小亞基均不存在明顯的信號肽序列，推測該酶 為胞內(nèi)酶。 實施例2
[0051] 谷氨酸合酶表達載體構(gòu)建
[0052] 1)根據(jù)谷氨酸合酶大亞基及小亞基序列，設(shè)計含有酶切位點的引物，序列如下：
[0053] GF - Nde I - F:GTACATATGTACGACCCCCGCAACGAGCACGAC
[0054] GF - EcoR V - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGGCCATTGATCGCCGCCT
[0055] GG - Nco I - F:ACCATGGCAGATCCCAAGGGTTTCCTCACCAC
[0056] GG _ EcoR I _ R:CGATATCTCAATGATGATGATGATGATGGACGGTCATGGGCCGGT
[0057] 2)以灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)基因組DNA為模板，用含有 Nco I和EcoR I酶切位點引物進行PCR擴增獲得谷氨酸合酶小亞基基因序列，使用DNA A-Tailing Kit 加 A后連接到 T-Vector PMD? 19-T (TaKaRa)，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5a 大腸桿菌內(nèi)。在氨芐（50yg/mL)抗性平板上挑選陽性克隆，搖菌提取質(zhì)粒測序。隨后Nco I和EcoR I進行雙酶切（37°C)，回收谷氨酸合酶小亞基DNA片段GG。用相同內(nèi)切酶酶切共 表達載體pETDuet-Ι并回收載體DNA片段。將GG與載體片段混合，T4DNA Ligase(TaKaRa) 過夜連接（16°C)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5a大腸桿菌感受態(tài)細胞內(nèi)，通過抗性平板及菌落PCR 篩選含有質(zhì)粒pETDuet-GG的陽性克隆。挑取陽性克隆接種于含有氨芐青霉素（SOyg/mL) 的LB液體培養(yǎng)基中，180rpm、37°C培養(yǎng)16小時后提取質(zhì)粒。
[0058] 以含有Nde I和EcoR V酶切位點引物進行PCR擴增獲得谷氨酸合酶大亞基基因 序列，使用DNA A-Tailing Kit加 A后連接到T-Vector PMDTM 19-T，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入 DH5a大腸桿菌內(nèi)。挑選陽性克隆搖菌并回收質(zhì)粒測序驗證。隨后Nde I和EcoR V雙酶切 該質(zhì)粒，回收谷氨酸合酶大亞基DNA片段GF。用相同內(nèi)切酶處理重組表達載體pETDuet -GG 并回收載體DNA片段。將GF與pETDuet - GG載體片段混合，T4DNA Ligase過夜連接，將連 接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細胞內(nèi)，通過抗性平板和菌落PCR篩選含有重組共表達 載體pETDuet - GG - GF的陽性克隆。挑取陽性克隆，搖菌并提取其質(zhì)粒。
[0059] 測序結(jié)果證實插入片段與基因組測序結(jié)果完全吻合，即為本發(fā)明序列表中的SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2。
[0060] 所述的PCR擴增的條件為：98°C預變性3min ;98°C變性10s，55°C退火15s，68°C延 伸2min ;30個循環(huán)后68°C終延伸5min。
[0061] 所述的 PCR 反應使用的 DNA 聚合酶均為 PrimeSTAR? GXL Polymerase (TaKaRa)。
[0062] 3)谷氨酸合酶過表達轉(zhuǎn)基因菌株的構(gòu)建：將上述重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 Transetta(DE3)大腸桿菌，并在含有氨節(jié)青霉素（50μ g/mL)和氯霉素（34μ g/mL)的LB固 體培養(yǎng)基上篩選，獲得谷氨酸合酶過表達菌株。
[0063] 上述的Transetta(DE3)具有以下特征：該菌株具有氯霉素（Camr)，且含有大腸桿 菌缺乏的6種稀有密碼子（AGA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA)對應的tRNA，可有效提高外源基因， 尤其是真核生物及鏈霉菌等高GC含量生物基因在原核系統(tǒng)中的表達水平。
[0001] _序列表_ <110>上海交通大學 <120>基于谷氨酸合酶的工程菌及其實現(xiàn)方法 <130>10 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 4S12 <212> DNA \i\{Streptomycesgriseorubens) SG-GF <400> 1 atgtacgacc cccgcaacga gcacgacgcc tgcggcgtcg gcttcgtcgc caccctcacc 60 ggcgaggcgt cccacgccct g g t c g a c c a g gccctcaccg t c c t g c g c a a cctcgagcac 12 0 cgcggcgcca ccggctccga gccggactcc ggcgacggcg cgggcatcct ctcccagatc 180 ccggacgcct tcttccgcga ggtggccgga 11cgagctgc ccgcggcggg cggctacgcc 2 40 gtcggcatcg ccttcctccc cgaggagggc accgacgagg ccgt:cgcccg ca 1:cgaggag 3 0 0 atcgccgccg ccgaggggct caccgtcctc ggctggcgcg aggtgccggt cgcgccccag 360 ctgctcggcg ccaccgcccg ctcgaccatg ccggtcttcc gtcagctctt cgtcaccgac 420 gggaccagca cgggcatcgc actggaccgc aaggcgttcg tggtgcgcaa gcgcgccgag 480 cgcgaggcgg gcgtctactt cccgtcgctg tccgcgcgga ccatcgtcta caagggcatg 540 ctgaccaccg gccagctcga gcccttcttc ccggacctct ccgaccgccg cttcggctcc 6 0 0 gcgatcgcgc tggtccactc ccggttctcc a cga aca cct tcccgtcgtg gccgctcgcc 6 60 cacccgtacc gcttcgtcgc g c a c a a c g g t g a g a t c a a c a c c g t c a a g g g c a a c c g c a a c 720 tgg^tgcgcg cc cgtga gtr c cagctgatg trggacctgt trggra cggg ca a ggcctg 7 8 0 gagcggatct tcccggtctg cacgcccgac gcgtccgact ccgcgtcctt cgacgaggtg 840 ctggagctgc tgcacctggg cggccgttcg c tgccccact cggtgctgat gatga fcccg 9 0 0 gaggcgtggg a g a a c c a c g a ctccatggac ccggcccggc gcgccttcta c c a g t a c c a c 960 tccacgatga tggagccctg ggacggcccg gcctgcgtca ccttcaccga cggcacccag 1020 gtcggcgccg tgctcgaccg caacggcctg cgccccggcc gctactgggt caccgacgac 1080 ggcctggtcg tcctcggctc cgaggtcggc gtcctggaca tcgacccggc gaaggtcgtc 114 0 cgcaagggcc gcctccagcc cggccgcatg ttcctcgtgg acaccgcgga gcaccgcatc 1200 ?tcgaggacg a c g a g a t c a a gtcgcagctc gccgccgagc acccctacga ggagtggctc 1260 gaggccggcg agatcgagct gtccgacctg cccgagcgcg agcacatcgt gcacacgcac 13 2 0 gcctcggtca cccgccgcca gcagaccttc ggctacaccg aggaggagct gcgcgtcctc 13 8 0 ctcgcgccga tggccciagac cggcgcggag cccafcggct ccatgggcac cgactccccg 1440 atcgccgcgc tcagcgagcg cccgcggctg ctg11cgact ac11caccca gctg11cgcg 15 0 0 caggtcacra acccgccgct ggacgcgatc cgcgaggagc tggtgacctc crtgcgctcc 1 S60 tccc11：ggcc cgcagggcna cc：tg￠:tggag ccgacggccg ccgcgtgc：eg cagcgtcacg 16 2 0 c. L g t： c i： t: t c; c c g g L g a t; c g ^ c d a c g i t (.： gag c t g g c c d i t g c t c.： a t c c a c a t: t: a a c; g c c g h c.： 1680 ggcgacatgc ccggcttcaa ggccgcgacc ctctccggcc tgtaccgggt ggccggcggc 1740 ggcgaggccc tcgccgcccg c；31cgaggac atctgcgccg aggccgacgc cgccatcgag 180 0 ?acggcgccc ggctgatcgt cctgtccgac cggcactccg acgccgagca cgcgccgatc 18 6 0 ccgtcgctgc tgctcaccgc ggccgtcca c caccacctca tccgcaccaa gcagcgca cc 19 2 0 caggtgggtc tgctggtcga ggccggcgac gteegegagg tccaccacgt cgccctgctc 1980 ateggetaeg gcgccgccgc ggtcaacccg tacctggcca tggagtccgt cgaggacctg 2 040 gtccgcgcgg gcaccttcct gccgggcgcc gagcccgagc aggccatccg ca a cctca tc 210 0
[0002] cacgccctgg gcaagggcgt cctgaaggtg atgtccaaga tgggcatctc caccgtcgcc 2160 tcctaccgcg gcgcgcaggt cttcgaggcc gtcggcctgg aggagtcctt cgtcgagaag 2220 tacttcaacg gcaccaccag caagatcggc ggcgtcggca tcgacgtgat cgccaaggag 2280 gtcgccgccc gccacgccaa ggcgtacccc gcctccggca tcgccccggc gcaccgcgcg 2340 ctggacatcg gcggcgagta ccagtggcgc cgtgagggcg agccgcacct gttcgacccg 2400 g a g a c g g t c t tccgcctgca g c a c t c c a c g cgcgccggcc g c t a c g a c a t c 11 c a a g a a g 246 0 tacacggagc gcgtgaacga gcagtccgag cggctgatga cgctgcgcgg tctgttcggc 2520 ttcaagccgg gccgcaagcc catcccggtc gaggaggtcg agccggtctc cgagatcgtc 2580 aagcggttct ccaccggcgc catgtcgtac ggctccatct cgcaggaggc gcacgagacc 2640 ctcgccatcg ccatgaacca gctgggcggc aagtccaaca ccggtgaggg cggcgaggac 2700 ccggagcgcc tgtacgaccc ggcccgccgg tcgtccatca agcaggtcgc ctccggccgc 2760 ttcggcgtga c g t c c g a g t a cctggtcaac tccgacgaca t c c a g a t c a a gatggcccag 2820 ggcgccaagc ccggcgaggg cggccagctg cccggccaca aggtctaccc gtgggtcgcc 2880 aagacgcgtc actcgacgcc gggcgtgggg ctcatctccc cgccgccgca ccacgacatc 2940 tactccatcg aggacctcgc ccagctgatc cacgacctga a g a a c g c c a a cccccaggcg 3 0 0 0 cgcattcacg teaagctggt ctccgaggtc ggcgtcggca ccgtcgccgc gggcgtctcc 3 0 6 0 aaggcccacg eggacgtcgt gctgatctcc ggccacgacg gcggcaccgg cgcctccceg 312 0 ctga egtege t g a a g c a c g c c g g c g g c c c c tgggaactcg gcctcgccga g a c g c a g c a g 318 0 accctgctgc tcaacggcct gcgcgaccgc atcgtcgtcc agaccgacgg ccagctgaag 3240 accggccgtg aegtegteat cgccgcgctg ctcggcgccg aggagttegg ettegegacc 3 3 0 0 gcgccgctgg tcgtctccgg ctgcgtcatg atgegegtet gtcacctgga cacctgcccg 3360 gteggeateg ccacccagaa cccggtgctg cgcgaccgct a c t c c g g c a a ggccgagtac 3 4 2 0 gtcgtgaact tcttccggtt catcgccgag gaggtccgcg agctcctcgc cgagctgggc 3480 ttccgctcca tegaegagge cgtcggccac gccgaggtgc tegaegtgae ccgcgcggtg 3S40 a a c c a c t g g a a g g c g c a g g g c c t g g a g c c c gageege cgt tccacgtgcc cgagcrgccc 3 6 0 0 gagggcgccg cccgccacca ggtggtcggc caggaccacg ggctggagaa ggcgctcgnc 3 6 6 0 a acgagctga tcaagctcgc cgccgacgcg ctctccgtct ccggggccga ggacgcccag 3 7 2 0 ccggtgcgcg cccaegtege c a t c c g c a a c atcaaccgca cg^tcggcac catgctcggc 3780 cacgaggtga c g a a g a a g 11 cggcggcgcg ggcctgcccg a c g a c a c c a t c g a cate a c c 3840 ttcaccggct ccgccggcca gtcgttcggc gccttcgtgc cgcgcggtgt cacgctccgc 39-- ctggagggcg acgccaacga ctacgtcggc aagggcctgt ccggcggccg gategtegte 3960 cgcccggacc grggrgrcgn cracctcgrr ggt;icngcg triitcgcggg caaciirgctx 4020 gcctacggcg ccaccggcgg cgagatgttc ctgcgcggca aggtcggtga gcggttctgc 4080 gtccgcaact ccggcgcgct ggtcgtctcc gagggcgtgg gcgaccacgg ctgcgagtac 4140 atRacgggcg gtcacgcggt cgtcctcggc gagaccgggc gcaacttcgc ggccggcatg 4200 tccggcggca tegegtaegt catcgacctg g a c c g g a a c a a c g t c a a c g c cggcaacgtc 42 60 gcctccgtcg aggcgctgga cgacgccgac aagcagtggc tgcacgacgt ggtccgccgg 4320 caccaggagg agacgggctc caccgtcgcc gagaagetgc tcgccgactg ggacaccgcg 4380 gtgCrigrgct t r a g c a g a t c t c c c c a g r a c g r c a a g g cagtgctcgc c g r r a g g a c 4440 gccgccgagc gageeggtet gtccgagacc gagatcaccg agaagatgat ggaggcggcg 4500 atcaatggct ga 4512 <210> 2 <211> 1491 <212> DNA <213>灰略紅跡心:|?|SG-GG <400> 2 atggcagatc ccaagggttt cctcaccacg ccccgccagg aatggccgcg ccggccggtg 60 gaggaaeggg cccgcgactg ggacgaggtg tacgtccccg ggggactgct gccgatcatc 12 0 3gcgagcagg ccgaccggtg catggactgc ggtgtgccgt tct:gt;cacga ggeetgtccg 180 ctgggcaatc tcatcccgga gtggaacgac ctggtctccc gggaggactg gegggegget 240 geggagegge tgcacgccac gaacaacttc cccgagttca cggggaggct gtgcccggcg 300
[0003] ccctgcgagg ccggctgtgt gctcgccatc a a c c a g c c g g cggtgaccat caagaacgtc 3 6 0 gagtgcgccg tcgccgacaa ggcgtgggag gaggggttcg ccgtaccggc cccgcccgac 420 cggctgtccg ggcggacggt cgcggrcatc ggttcgggcc ccacgggact ggccgccgcc 480 cagcagcrga cgcgggccgg gcacacggtc gccgtgtacg agcgggacga ccggatcggc 540 ggactcatgc ggtacgggat ccccgcttrc a a g a t g g a g a agcaccatct ggagcggcgc 6 0 0 gtggagcaga tgcgggccga ggggacgagg ttccgcacgt cgaccacggt cgggcgggac 660 gtggacgcgg cggagctgcg gagccgctac gacgcggtgg tgatcgccac gggggcgacg 720 gcgtggcggg agctgccggt gccggggcgt gacctcgcgg gcatccacca ggcgatggag 780 tacctgccgc tggccaaccg ggtgtgcgag ggcgacctgg agaggtcgcc cctgtcggcg 840 gaggggcggc acgtggtcat cgtcgggggc ggtgacacgg gcgcggactg cctggggacg 900 gcggtgcggg agcgggccgc gtcggtcacc cagctggaca tctaccggaa gccgggcagc 960 gagcgcgacg aggagaacga gccctggccg acgtatccga agctgtaccg gctgtcggcg 10 2 0 Scgcacgagg agRcgggcgc gctgcgRacg gcgccigcgg cacgtgccga cgcRcggttg 1080 ttcgccgcgt cgacgctgcg tttcgagggg gacgaggaag ggcgggtgcg cgggctgcgc 1140 rtggtrgagg tggargrgga g(：gr；9ggf：cg gfgccgggga rggagcggar gcfgcrrgcr 120(1 gacctggtgc tgctcgcgct cggcttctcc gggccggacc agggcgacgg gatcatcggg 12 6 0 cagetcggt.c tcgggctgg-? gccgcgcggc acgaLcgcgc gcgggccgga cttcgccaeg 1320 aacgtgccgg gcgtcttcgc ggcgggcgac gccggccggg ggeagteget gatcgtgtgg 1380 gccatcgcgg aggggcgggc ggtggcggcg tccgtcgacc gcttcctgac gggcggcacg 1440 agccgtctgc ccgcgccgat cggcccgtac gaccggccca tgaccgtctg a 1491 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列 <400> 3 cggtgtgccg ttctgtca 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列 <400> 4 aagttgttcg tggcgtgc 18 <210> 5 <211>18 <212> DNA [0004] <213>人工序列 <400 5 aagttgttcg tggcgtgc 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213>人丁序列 <400> 6 gcgaggtgga gcgaatctca 20 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213>人工序列 <400> 7 gtacatatgt acgacccccg caacgagcac gac 33 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213>人工序列 <400> 8 ggaattctca atgatgatga tgatgatggc cattgatcgc cgcct 45 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213>人工序列 [0005] <400> 9 accatggcag atcccaaggg tttcctcacc ac 32 <210> 10 <211> 45 <212> DNA <213>人工序列 <400> 10 cgatatctca atgatgatga tgatgatgga cggtcatggg ccggt 4 5
【權(quán)利要求】
1. 一種谷氨酸合酶的工程菌，其特征在于，該工程菌為外源表達谷氨酸合酶的大腸桿 菌； 所述的胞內(nèi)谷氨酸合酶具體為灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)JSD-l谷 氨酸合酶編碼基因，由谷氨酸合酶大亞基和小亞基構(gòu)成，其中：谷氨酸合酶大亞基SG -GF的 核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，谷氨酸合酶小亞基SG-GG的核苷酸如SEQ ID No. 2所示， 分別編碼1503和496個氨基酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)JSD - 1，現(xiàn)保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC)，保藏編號為 CGMCC No. 5706,保藏日期為2012年1月9日。
3. -種根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的工程菌的實現(xiàn)方法，其特征在于，以灰略紅鏈霉菌 基因組DNA為模板，與含有酶切位點的引物進行PCR擴增依次得到編碼谷氨酸合酶小亞基 及大亞基的核苷酸序列；然后將擴增得到的基因序列依次連接到共表達載體pETDuet - 1， 最終獲得重組共表達載體pETDuet - GG - GF ;之后將該谷氨酸合酶表達載體轉(zhuǎn)化到大腸桿 菌表達菌株內(nèi)，獲得谷氨酸合酶過表達重組菌株。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位點的引物包括： GF - Nde I - F:GTACATATGTACGACCCCCGCAACGAGCACGAC GF - EcoR V - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGGCCATTGATCGCCGCCT GG - Nco I - F:ACCATGGCAGATCCCAAGGGTTTCCTCACCAC GG - EcoR I - R:CGATATCTCAATGATGATGATGATGATGGACGGTCATGGGCCGGT。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR擴增的條件為：98°C預變性 3min ;98°C變性 10s，55°C退火 15s，68°C延伸 2min ;30 個循環(huán)后 68°C終延伸 5min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是，所述的大腸桿菌表達菌株為 Transetta(DE3)大腸桿菌。
7. -種根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的谷氨酸合酶的工程菌的應用，其特征在于，將其 用于谷氨酸合酶的體外高效表達，并最終實現(xiàn)谷氨酸的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)。
【文檔編號】C12N1/21GK104120103SQ201410373726
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】周培, 馮?，|, 孫玉靜, 支月娥, 毛亮, 唐冬, 衛(wèi)星, 羅艷青 申請人:上海交通大學