眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子誘導干細胞成軟骨分化的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子將骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化成軟骨細胞的方法，它包括：從眼鏡蛇毒中分離純化NGF；從SD乳鼠的四肢骨髓中分離出間充質(zhì)干細胞；將一定數(shù)目的干細胞懸液加入到含有NGF的培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)，誘導7、14、21天后，通過免疫組化、糖胺多糖定量檢測以及聚合酶鏈式反應等技術手段研究自提取的蛇毒NGF對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的軟骨誘導作用。實驗結果表明眼鏡蛇毒NGF能促進該細胞向軟骨方向分化，說明眼鏡蛇毒NGF是一種有潛力的治療軟骨缺損的生長因子，經(jīng)本發(fā)明方法的誘導，所產(chǎn)生的軟骨細胞可用于大規(guī)模的體內(nèi)移植治療軟骨缺損，有利于軟骨組織工程的臨床推廣和應用。
【專利說明】眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子誘導干細胞成軟骨分化的方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學和生物醫(yī)學工程領域，更具體地涉及眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子的制備和應用，及其誘導干細胞向軟骨分化的方法和用途。

【背景技術】
[0002]關節(jié)軟骨缺損一直是骨科臨床的治療難題，主要是因為關節(jié)軟骨沒有血供，且軟骨細胞埋于稠厚的細胞外基質(zhì)中，無法移動到損傷部位參與修復，這樣就使得即使是極小的軟骨缺損也無法自然修復。當關節(jié)軟骨小面積的全層損傷后，軟骨下骨髓可產(chǎn)生纖維軟骨樣修復。但這種修復產(chǎn)生的軟骨細胞無論是形態(tài)還是功能特性與正常軟骨相差甚遠。事實上，損傷的關節(jié)會加速關節(jié)的骨化，細胞外基質(zhì)降解的速率大于新基質(zhì)的合成，從而導致關節(jié)炎。傳統(tǒng)的治療方法包括:關節(jié)內(nèi)清理和灌洗術、關節(jié)削軟骨磨成形術、軟骨下骨鉆孔術、關節(jié)面鉆孔和微骨折法、截骨術等。此類方法可以部分減輕疼痛，有一定短期療效，但都是以纖維軟骨修復軟骨組織為主，缺少正常透明軟骨的力學性能及耐用性，通常不能長期維持關節(jié)功能，而且還經(jīng)常加速受損區(qū)域組織的進一步退行性變，難以獲得滿意的臨床效果O
[0003]組織工程技術通過分離及培養(yǎng)所需的種子細胞、選擇適合的支架材料、最后構建組織工程化軟骨植入到缺損部位而完成治療目的，一度成為軟骨損傷修復研究的熱門。組織工程研究涉及到種子細胞、支架材料和包括多種生長因子在內(nèi)的生長環(huán)境3種基本要素。種子細胞主要包括軟骨細胞和干細胞等。由于自體、異體或異種軟骨細胞作為組織工程細胞存在來源以及免疫排斥等眾多難以克服的限制性因素，因此，近年來，大量研究開始將注意力集中到干細胞研究領域。所謂干細胞，是指一類具有自我復制能力的多潛能細胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞。來源于骨髓、肌肉、脂肪、骨膜及軟骨膜等的干細胞，經(jīng)一定條件的培養(yǎng)，均能夠轉化為軟骨細胞。其中骨髓來源的間充質(zhì)干細胞，即骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)具有較強的增殖能力，易從骨髓中分離和體外擴增純化，便于自體移植，目前己經(jīng)成為關節(jié)軟骨組織工程研究的最重要的種子細胞來源之一。
[0004]現(xiàn)行的已得到普遍認可的BMSCs體外軟骨定向誘導方案主要采用外加生長因子，在體外培養(yǎng)中添加轉化生長因子(TGF-β )、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)等生長因子或活性大分子可誘導干細胞向軟骨方向分化。生長因子在軟骨組織工程中被廣泛采用，可用于誘導間充質(zhì)干細胞向軟骨方向分化，在軟骨損傷修復中發(fā)揮著重要的作用，促進軟骨細胞的增殖、遷移、向軟骨細胞分化和基因的表達。但是目前常用的生長因子存在提取工藝復雜、價格昂貴、容易降解等諸多弊端，不利于廣泛的臨床應用。因此，急需開發(fā)和尋找更易提取，成本低廉，同時具有軟骨誘導活性的生長因子用于軟骨缺損修復。
[0005]神經(jīng)生長因子(NGF)是一類神經(jīng)營養(yǎng)因子，價格低廉且提取工藝簡便，如果能有效誘導干細胞成軟骨分化，必將為關節(jié)患者帶來福音。眼鏡蛇毒資源豐富，且隨著人工飼養(yǎng)技術的逐漸成熟，蛇毒的獲取更為便利，為降低成本提供了空間。蛇毒中蘊藏著大量極具價值的活性物質(zhì)，其中包括NGF。NGF是能夠促進神經(jīng)細胞生長的生物活性復合蛋白，也是迄今為止研究得最清楚的一個神經(jīng)營養(yǎng)因子。它具有十分廣泛的作用，NGF在軸突的生長、神經(jīng)元的發(fā)育、遞質(zhì)的合成及細胞的凋亡等階段均起著重要作用，能夠促進發(fā)育中的感覺神經(jīng)元及交感神經(jīng)元的存活及分化，營養(yǎng)成熟的神經(jīng)元，維持其正常的生物學功能，并參與神經(jīng)元的損傷修復等，NGF的非神經(jīng)作用也日益引起人們的關注。已有研究表明，NGF對BMSCs有成骨誘導的作用，對骨缺損修復有積極的促進作用。
[0006]目前尚無報道有NGF對BMSCs有軟骨誘導作用，且NGF應用軟骨修復領域的報道也極少。但種種跡象表明NGF可能會對軟骨修復有促進作用。有研究表明，NGF可能會在對抗關節(jié)炎中起作用，這在關節(jié)炎軟骨中觀測到有NGF表達。NGF還有可能與促血管因子生成相關，從而與骨關節(jié)炎有一定關系。進而有研究發(fā)現(xiàn)，NGF及其兩個受體在透明軟骨、纖維軟骨和彈性軟骨中均有表達，說明NGF及其受體可能參與軟骨代謝過程。其他類似的研究表明，與NGF相近的神經(jīng)蛋白分子也能促進軟骨細胞增殖及軟骨特異基質(zhì)的分泌，可作為間接證據(jù)證明NGF會對軟骨再生與代謝產(chǎn)生作用。
[0007]因此，為解決本領域面臨的難題，使組織工程化軟骨擺脫生長因子難以提取、價格昂貴、不易推廣應用的限制，急需開發(fā)和尋找更易提取，成本低廉，同時具有軟骨誘導活性的生長因子用于軟骨缺損修復。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種能誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分化成軟骨細胞的價格低廉、功能較強的誘導因子。
[0009]為完成本發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術方案:
(1)從眼鏡蛇毒中分離并純化神經(jīng)生長因子NGF;
(2)采用PC12神經(jīng)細胞株進行NGF的活性鑒定；
(3)用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行NGF的純度鑒定；
(4)無菌條件下，從SD乳鼠的四肢骨頭的骨髓中分離出大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，放入含有15%FBS、1%青鏈霉素的a -MEM培養(yǎng)基中；
(5)體外培養(yǎng)rBMSCs并擴增至所需的數(shù)目；
(6)選用細胞狀態(tài)良好的第三代rBMSCs，消化收集細胞并計數(shù)，接種細胞于24孔板中，濃度為每孔2 X 14個細胞，待細胞貼壁后，加入含有誘導液的高糖DMEM培養(yǎng)基進行誘導培養(yǎng)，誘導液含有:分別加入三種濃度，即3μ g/ml,6 μ g/ml, 12 μ g/ml的NGF、50mg/mL胰島素/轉鐵蛋白/硒混合物、100nmol/L地塞米松、50 μ g/ml抗壞血酸、1%青鏈霉素、10%胎牛血清，每隔24小時更換上述培養(yǎng)基一次，分別誘導7天14天和21天；陽性對照組采用的誘導液為:10ng/ml轉化生長因子β l、50mg/mL胰島素/轉鐵蛋白/硒混合物、100nmol/L地塞米松、50 μ g/ml抗壞血酸、1%青鏈霉素、10%胎牛血清；陰性對照組采用高糖DMEM培養(yǎng)基加1%青鏈霉素、10% FBS ；
(7)誘導7、14、21天后，通過免疫組化檢測II型膠原的表達情況，蘇木精-伊紅染色觀察各組細胞形態(tài)，DNA檢測考察細胞增殖情況，利用二甲基亞甲基藍檢測細胞分泌的糖胺多糖含量，通過實時聚合酶鏈式反應檢測軟骨特異蛋白的表達量，從而鑒定自提取的蛇毒神經(jīng)生長因子凍干粉對rBMSCs的軟骨誘導作用。
[0010]具體方法步驟如下: 步驟1、稱量眼鏡蛇毒2g，在4°C環(huán)境下完全溶于1ml 1%乙酸，12000轉/分鐘，4°C，離心10分鐘，收集上清液。將收集的上清液緩慢通過準備好的葡聚糖凝膠G-75凝膠柱中，層析儀設置流速Iml/分鐘，每管10分鐘，用1%HAC溶液進行洗脫，收集具有NGF活性的各峰段洗脫液，得到55ml ;將得到的洗脫液透析過夜，期間換3-4次蒸餾水；將透析后液體通過準備好的 CM Sepharose CL-6B 離子膠，lmol/L NaCl 和 0.025mol/L、pH 為 5.8 的 NaAC-HAC混合液進行線性洗脫，收集得到各峰洗脫液，再分別進行透析除鹽和凍干。
[0011]步驟2、將各峰凍干品配成2.0μ8/πι1并作用于PC12細胞。24小時后，可見第三個峰樣品組細胞長出多個神經(jīng)纖維樣突觸，有長有短，突觸數(shù)目不等，有部分甚至交織成網(wǎng)狀，其他各峰樣品組PC12細胞體積縮小，呈球形，無突起；表明第三峰為目的蛋白。
[0012]步驟2的結果顯示所提蛋白呈單一條帶，說明所提的神經(jīng)生長因子純度較高。
[0013]步驟3是將出生3-7天的SD乳鼠，無菌條件下取下乳鼠脛骨和股骨，在無菌培養(yǎng)皿中切除兩端干骺端，顯露骨髓腔；然后用Iml無菌注射器吸取含15%FBS、1%青鏈霉素的a -MEM基礎培養(yǎng)基，將骨中的骨髓沖出，直至骨頭發(fā)白。然后將含骨髓的培養(yǎng)基吹打均勻，分到培養(yǎng)瓶中。
[0014]步驟4是將細胞培養(yǎng)瓶放入37°C、5% 0)2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天換液一次；細胞長至80%左右融合度，采用胰蛋白酶進行消化傳代。
[0015]步驟5:誘導液可按分組進行配置，分組:空白組；陽性對照組，用含TGF-β I的軟骨誘導液培養(yǎng)；NGF濃度組包括:N1組，NGF終濃度3 μ g/ml ； N2組，NGF終濃度6 μ g/ml和N3組，NGF終濃度12 μ g/ml。N1、N2、N3組中的NGF都配制成各自濃度的誘導液，除TGF-β I夕卜，其他成分和軟骨誘導液相同；每隔三天換液一次，7、14、21天后分別收集細胞。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點:
本發(fā)明首次對眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子成軟骨誘導作用進行了研究，實驗表明，眼鏡蛇毒NGF對rBMSCs無增殖活性，但它能促進rBMSCs成軟骨分化，具有與TGF- β I的作用效果相當?shù)能浌钦T導作用。眼鏡蛇毒NGF以其提取工藝簡單，成本較低，成軟骨誘導效果良好的特點，有望作為TGF-β I的替代生長因子用于軟骨缺損修復。本發(fā)明提供了一種誘導成體間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化的方法，采用的誘導劑價格低廉，且誘導效果良好，經(jīng)本發(fā)明方法的誘導，所產(chǎn)生的軟骨細胞可用于大規(guī)模的體內(nèi)移植治療軟骨缺損，有利于軟骨組織工程的臨床推廣和應用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1蛇毒NGF的Sephadex G-75凝膠過濾
圖2眼鏡蛇毒NGF的CM Sepharose CL-6B離子交換分離
圖3 PC12細胞檢測NGF活性(分別采用NGF濃度a: 2 μ g/ml，b: 4 μ g/ml，c: 6 μ g/ml，d:8 μ g/ml對PC12細胞進行活性檢測)
圖4 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測NGF凍干品的純度圖5 HE染色圖片圖6 II型膠原免疫組化圖片圖7 DNA檢測結果圖8 GAG檢測結果圖 9 Real-time PCR 結果。

【具體實施方式】
[0018]一、眼鏡蛇毒NGF的分離純化和鑒定:
(O從眼鏡蛇毒中分離并純化神經(jīng)生長因子NGF:通過葡聚糖凝膠G-75 (sephadexG-75)凝膠柱和CM Sepharose CL-6B離子膠兩步法，收集得到各峰洗脫液，再分別進行透析除鹽和凍干。
[0019](2)采用PC12神經(jīng)細胞株進行NGF的活性鑒定:將各峰凍干品作用于神經(jīng)細胞株PC12細胞，檢驗目的蛋白活性。結果表明第三峰為目的蛋白所在。
[0020](3)用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行NGF的純度鑒定:結果顯示所提蛋白的呈單一條帶，說明所提的神經(jīng)生長因子純度較高。
[0021]二、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(rBMSCs)的培養(yǎng)
(DrBMSCs的提取:無菌條件下，從SD乳鼠的四肢骨頭的骨髓中分離出大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(rBMSCs)，放入含有15%胎牛血清(FBS)、1%青鏈霉素的a-MEM培養(yǎng)基中。即無菌條件下取下SD乳鼠脛骨和股骨，用Iml無菌注射器吸取含15% FBS、1%青鏈霉素的a -MEM基礎培養(yǎng)基，將骨中的骨髓沖出，直至骨頭發(fā)白。然后將含骨髓的培養(yǎng)基吹打均勻，分到培養(yǎng)瓶中；
(2)rBMSCs的培養(yǎng)及擴增:體外培養(yǎng)rBMSCs并擴增至所需的數(shù)目；將細胞培養(yǎng)瓶放入37°C、5% 0)2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天換液一次；細胞長至80%左右融合度，采用胰蛋白酶進行消化傳代。
[0022]三、NGF誘導rBMSCs分化成為軟骨細胞:
(I)選用細胞狀態(tài)良好的第三代rBMSCs，消化收集細胞并計數(shù)，接種細胞于24孔板中，濃度為每孔2 X 14個細胞，待細胞貼壁后，加入含有誘導液的高糖DMEM培養(yǎng)基進行誘導培養(yǎng)，誘導液含有:分別加入三種濃度(3 μ g/ml, 6 μ g/ml, 12 μ g/ml)NGF、50mg/mL胰島素/轉鐵蛋白/硒混合物(ITS)、10nmo 1/L地塞米松、50 μ g/ml抗壞血酸、1%青鏈霉素、10%胎牛血清(FBS)，每隔24小時更換上述培養(yǎng)基一次，分別誘導7天14天和21天。陽性對照組采用的誘導液為:10ng/ml轉化生長因子β I (TGF-β I)、50mg/mL胰島素/轉鐵蛋白/硒混合物ITS、10nmoI/L地塞米松、50 μ g/ml抗壞血酸、1%青鏈霉素、10% FBS ；陰性對照組采用高糖DMEM培養(yǎng)基加1%青鏈霉素、10% FBS。
[0023](2)誘導7、14、21天后，通過免疫組化檢測II型膠原的表達情況，蘇木精_伊紅(HE)染色觀察各組細胞形態(tài)，DNA檢測考察細胞增殖情況，利用二甲基亞甲基藍(DMMB)檢測細胞分泌的糖胺多糖(GAG)含量，通過實時聚合酶鏈式反應(Real time PCR)方法檢測各組軟骨特異蛋白的表達量，從而鑒定自提取的蛇毒神經(jīng)生長因子凍干粉對rBMSCs的軟骨誘導作用。
[0024]本發(fā)明是一種將大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化為軟骨細胞的新方法，包括:
a)稱量眼鏡蛇毒2g，在4°C環(huán)境下完全溶于1ml 1%乙酸(HAC)，4°C離心10分鐘，收集上清液。將收集的上清液緩慢通過準備好的s^hadex G-75凝膠柱中，層析儀設置流速Iml/分鐘，每管10分鐘，用1%HAC溶液進行洗脫，收集具有NGF活性的各峰段洗脫液，得到55ml。將得到的洗脫液透析過夜，期間換3-4次蒸餾水；將透析后液體通過準備好的CMSepharose CL-6B 離子膠，lmol/L NaCl 和 0.025mol/L NaAC-HAC (ΡΗ5.8)混合液進行線性洗脫，收集得到各峰洗脫液，再分別進行透析除鹽和凍干。經(jīng)sephadex G_75凝膠柱分離后，目的蛋白在第II峰,見圖1。經(jīng)CM Sepharose CL-6B離子膠分離，目的蛋白在第III峰，見圖2。
[0025]b)通過PC12細胞鑒定NGF活性試驗:將各峰凍干品配成2.(^g/ml并作用于神經(jīng)細胞株PC12細胞。24小時后，可見第三個峰樣品組細胞長出多個神經(jīng)纖維樣突觸，有長有短，突觸數(shù)目不等，有部分甚至交織成網(wǎng)狀，其他各峰樣品組PC12細胞體積縮小，呈球形，無突起。表明第三峰為目的蛋白。隨NGF濃度增加，可見PC12細胞突觸增多、變長，甚至成網(wǎng)狀，說明效果提升。見圖3。
[0026]c)NGF純度鑒定及分子量的測定:所分離得到的具有生物學活性的NGF是在第III峰，在還原條件下，經(jīng)過濃度12.5% SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)此峰只有一條帶，為電泳純，見圖4。以標準蛋白的遷移率為橫坐標，相應分子質(zhì)量的對數(shù)值為縱坐標制作標準曲線，所得公式為Y=L 7913X+2.3365，R=0.0306。目的蛋白NGF換算后測定其分子量為14.5KD。
[0027]d)將出生3-7天的SD乳鼠，無菌條件下取下乳鼠脛骨和股骨，在無菌培養(yǎng)皿中切除兩端干骺端，顯露骨髓腔。
[0028]e)用Iml無菌注射器吸取含15%FBS、1%青鏈霉素的a -MEM基礎培養(yǎng)基，將骨中的骨髓沖出，直至骨頭發(fā)白。然后將含骨髓的培養(yǎng)基吹打均勻，分到培養(yǎng)瓶中，放入37°C、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0029]f)選用細胞狀態(tài)良好的第三代rBMSCs，消化收集細胞并計數(shù)，接種細胞于24孔板中，濃度為每孔2 X 14個細胞，待細胞貼壁后，加入含有誘導液的高糖DMEM培養(yǎng)基進行誘導培養(yǎng)，誘導液含有:分別加入三種濃度NGF(分為三組:N1組，NGF終濃度3 μ g/ml ； N2組，NGF 終濃度 6 μ g/ml 和 N3 組，NGF 終濃度 12 μ g/ml )、50mg/mL ITS、10nmo 1/L 地塞米松、50 μ g/ml抗壞血酸、1%青鏈霉素、10% FBS,每隔24小時更換上述培養(yǎng)基一次，分別誘導7天，14天和21天。陽性對照組(T組)采用的誘導液為:10ng/ml TGF-β l、50mg/mL ITS、10nmo 1/L地塞米松、50 μ g/ml抗壞血酸、1%青鏈霉素、10% FBS ；陰性對照組(K組)采用高糖DMEM培養(yǎng)基加1%青鏈霉素、10% FBS。
[0030]g)HE染色:將細胞爬片取出，0.01mol/L PBS洗2次，I分鐘/次；95%酒精固定20分鐘，PBS洗2次，I分鐘/次；蘇木素染色2~3分鐘，自來水洗兩次；加自來水返藍；若細胞核染色太深，可用1%鹽酸酒精分色數(shù)秒，然后用水洗兩次；伊紅染色I分鐘，水洗兩次；脫水(80%酒精2~3分鐘；95%酒精5分鐘；無水乙醇5分鐘)；二甲苯透明10分鐘；吹干或自然晾干后，中性樹膠封片。未添加NGF組絕大多數(shù)細胞為梭形，沒有形成軟骨陷窩樣結構。誘導組中，TGF- β組及Ν2濃度組，誘導7天后，就能看到許多細胞呈圓形或者橢圓形，與軟骨細胞形態(tài)特征相似，還出現(xiàn)明顯軟骨陷窩樣結構；誘導14天、21天后，軟骨樣細胞增多，軟骨陷窩也增多。而NI和Ν3組相似，大多細胞呈梭型。7天時，有少量軟骨樣細胞呈現(xiàn)，無軟骨陷窩樣結構；14天時，軟骨樣細胞無明顯增多，軟骨陷窩也不明顯；21天軟骨樣細胞增多，呈現(xiàn)軟骨陷窩樣結構。見圖5。
[0031]h)細胞爬片免疫組化染色:將細胞爬片取出，0.0lmol/L PBS洗3次，3分鐘/次；95%酒精固定30分鐘，PBS洗3次，3分鐘/次；3% H2O2處理15分鐘，PBS洗3次，3分鐘/次；用山羊血清封閉15分鐘；去掉血清(不要洗)后，滴加II型膠原一抗，置于濕盒37°C，2-3小時；去掉一抗，PBS洗3次，3分鐘/次；滴加二抗，室溫孵育30分鐘，PBS洗3次，3分鐘/次；滴加現(xiàn)配的3，3’-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)溶液，顯微鏡下觀察顯色3~5分鐘；蒸餾水洗3次，3分鐘/次，蘇木素復染15秒，自來水返藍，干燥，最后用中性樹膠封片。檢測各組II型膠原的表達情況。誘導7天的各組，均未見II型膠原陽性表達。而誘導14天，空K組II型膠原免疫組化為陰性，表明未表達II型膠原；TGF- β I組及各NGF處理組，均有II型膠原陽性表達，其中TGF-β I組及Ν2濃度組表達較為顯著。誘導21天后，空白組II型膠原表達較低，而TGF- β I組及各NGF處理組，均有II型膠原陽性表達，其中TGF- β I組及Ν2濃度組表達較為顯著。見圖6。
[0032]i)DNA檢測:吸掉24孔板中培養(yǎng)基，PBS洗一次，胰蛋白酶消化，離心收集細胞。棄去上清液后，加ImlPBS重懸細胞。然后加入5μ1 20mg/ml蛋白酶K，58°C水浴過夜。采用Hoechst33528法，采用分光熒光計365nm: 440 nm測定OD值，計算各組細胞DNA總量，以牛胸腺DNA為參照。7天、14天、21天可見添加NGF組較空白組均有顯著性差異，表明NGF對細胞具有增殖活性。見圖7。
[0033]j)GAG檢測:①硫酸軟骨素(CS)標準曲線繪制:分別取CS工作液20μ 1、40μ 1、60μ 1、80μ 1、100μ I再分別加入2.5ml DMMB，混勻后，吸入96孔板中，每個濃度3個復孔。525nm檢測光密度(OD)值，對應濃度，繪出標準曲線。②樣品GAG檢測:吸掉24孔板中培養(yǎng)基，PBS洗一次，胰蛋白酶消化，離心收集細胞。棄去上清液后，加ImlPBS重懸細胞。然后加Λ5μ I 20mg/ml蛋白酶K，58°C水浴過夜。取100 μ I樣品，加2.5ml DMMB，混合均勻后，加入96孔板中，每組做4個復孔，525nm檢測0D。結合CS標準曲線，計算出各組GAG的含量。每組測定5個樣品的DNA和GAG總量，計算出單位DNA的GAG含量，用SPSS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)結果分析，P值小于0.01為特別顯著差異(用**表示)，小于0.05為顯著差異(用*表示)。誘導7天、14天、21天，相比空白組，NGF各濃度組和TGF-β I組細胞分泌的GAG含量均有所提高(Ρ〈0.01)，其中TGF-β I組變化最為顯著，Ν2-7組其次。見圖8。
[0034]按照總RNA小量制備試劑盒(AxygenJ^H )的方法提取總RNA,再采用反轉錄反應試劑盒(Fermentas公司，美國)進行逆轉錄。具體方法參照試劑盒說明。樣本相對表達量的測定:按摸索好的條件和體系，分別測定蛋白多糖(Acan)、II型膠原(COL II)、I型膠原(C0L I)、X型膠原(COL X)、S0X9五個基因不同樣品的Ct值，計算基因表達的差異。用SPSS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)結果分析，P值小于0.01為特別顯著差異(用**表示)，小于
0.05為顯著差異(用*表示)。誘導7天后，各組中均檢測不到COL II,COL X，而Acan、S0X9和COL I均有表達，T組最高，N2組其次。誘導14天后，各組仍然未檢測到COL X的表達；除K組外，其他各組均檢測到COL II的表達，N2組與T組表達最高;Acan、S0X9和COL I的表達，T組最高，N2組其次。誘導21天后，各組仍然未檢測到COL X的表達；K組COL II的表達極低，T組最高，Ν2組其次；Acan、S0X9和COL I的表達，T組最高，N2組其次。見圖9。
【權利要求】
1.一種眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子誘導干細胞成軟骨分化的方法，其特征是: (1)從眼鏡蛇毒中分離并純化神經(jīng)生長因子NGF； (2)采用PC12神經(jīng)細胞株進行NGF的活性鑒定； (3)用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行NGF的純度鑒定； (4)無菌條件下，從SD乳鼠的四肢骨頭的骨髓中分離出大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，放入含有15%FBS、1%青鏈霉素的α -MEM培養(yǎng)基中； (5)體外培養(yǎng)rBMSCs并擴增至所需的數(shù)目； (6)選用細胞狀態(tài)良好的第三代rBMSCs，消化收集細胞并計數(shù)，接種細胞于24孔板中，濃度為每孔2 X 104個細胞，待細胞貼壁后，加入含有誘導液的高糖DMEM培養(yǎng)基進行誘導培養(yǎng)，誘導液含有:分別加入三種濃度，即3μ g/ml,6 μ g/ml, 12 μ g/ml的NGF、50mg/mL胰島素/轉鐵蛋白/硒混合物、100nmol/L地塞米松、50 μ g/ml抗壞血酸、1%青鏈霉素、10%胎牛血清，每隔24小時更換上述培養(yǎng)基一次，分別誘導7天14天和21天；陽性對照組采用的誘導液為:10ng/ml轉化生長因子β l、50mg/mL胰島素/轉鐵蛋白/硒混合物、100nmol/L地塞米松、50 μ g/ml抗壞血酸、1%青鏈霉素、10%胎牛血清；陰性對照組采用高糖DMEM培養(yǎng)基加1%青鏈霉素、10% FBS ； (7)誘導7、14、21天后，通過免疫組化檢測II型膠原的表達情況，蘇木精-伊紅染色觀察各組細胞形態(tài)，DNA檢測考察細胞增殖情況，利用二甲基亞甲基藍檢測細胞分泌的糖胺多糖含量，通過實時聚合酶鏈式反應檢測軟骨特異蛋白的表達量，從而鑒定自提取的蛇毒神經(jīng)生長因子凍干粉對rBMSCs的軟骨誘導作用。
2.如權利要求1所述的采用眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子誘導干細胞成軟骨分化的方法，其特征在于: 所述步驟(1)是稱量眼鏡蛇毒2g，在4°C環(huán)境下完全溶于10ml 1%乙酸，12000轉/分鐘，4°C，離心10分鐘，收集上清液；將收集的上清液緩慢通過準備好的葡聚糖凝膠G-75凝膠柱中，層析儀設置流速1ml/分鐘，每管10分鐘，用1%HAC溶液進行洗脫，收集具有NGF活性的各峰段洗脫液，得到55ml ;將得到的洗脫液透析過夜，期間換3-4次蒸餾水；將透析后液體通過準備好的 CM Sepharose CL-6B 離子膠，lmol/L NaCl 和 0.025mol/L、pH 為 5.8的NaAC-HAC混合液進行線性洗脫，收集得到各峰洗脫液，再分別進行透析除鹽和凍干。
3.如權利要求1所述的采用眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子誘導干細胞成軟骨分化的方法，其特征在于: 所述步驟(2)是將各峰凍干品配成2.0μδ/πι1并作用于PC12細胞；24小時后，可見第三個峰樣品組細胞長出多個神經(jīng)纖維樣突觸，有長有短，突觸數(shù)目不等，有部分甚至交織成網(wǎng)狀，其他各峰樣品組PC12細胞體積縮小，呈球形，無突起；表明第三峰為目的蛋白； 步驟(2)的結果顯示所提蛋白呈單一條帶，說明所提的神經(jīng)生長因子純度較高。
4.如權利要求1所述的采用眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子誘導干細胞成軟骨分化的方法，其特征在于: 所述步驟(3)是將出生3-7天的SD乳鼠，無菌條件下取下乳鼠脛骨和股骨，在無菌培養(yǎng)皿中切除兩端干骺端，顯露骨髓腔；然后用1ml無菌注射器吸取含15%FBS、1%青鏈霉素的α-MEM基礎培養(yǎng)基，將骨中的骨髓沖出，直至骨頭發(fā)白； 然后將含骨髓的培養(yǎng)基吹打均勻，分到培養(yǎng)瓶中。
5.如權利要求1所述的采用眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子誘導干細胞成軟骨分化的方法，其特征在于: 所述步驟(4)是將細胞培養(yǎng)瓶放入37°C、5% 0)2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2~3天換液一次；細胞長至80%左右融合度，采用胰蛋白酶進行消化傳代。
6.如權利要求1所述的采用眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子誘導干細胞成軟骨分化的方法，其特征在于: 所述步驟(5)誘導液可按分組進行配置，分組:空白組；陽性對照組，用含TGF-β 1的軟骨誘導液培養(yǎng)；NGF濃度組包括:N1組，NGF終濃度3 μ g/ml ； N2組，NGF終濃度6 μ g/ml和N3 組，NGF 終濃度 12 μ g/ml ； Nl、N2、N3組中的NGF都配制成各自濃度的誘導液，除TGF-β 1外，其他成分和軟骨誘導液相同；每隔三天換液一次，7、14、21天后分別收集細胞。
【文檔編號】C12N5/077GK104480064SQ201410373621
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年8月1日 優(yōu)先權日:2014年8月1日
【發(fā)明者】鄭立, 雷丹青, 陸真慧, 盧海慶, 劉琴, 趙勁民 申請人:廣西醫(yī)科大學