一種毛囊干細胞誘導分化為血管內(nèi)皮細胞的抑制方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)領域，尤其是涉及一種毛囊干細胞誘導分化為血管內(nèi)皮細胞的抑制方法。
【背景技術】
[0002]干細胞作為再生醫(yī)學第一要素，其生物學特性的深入研究對于再生醫(yī)學的發(fā)展具有指引作用，再生醫(yī)學中常用的干細胞分為胚胎干細胞及成體干細胞，由于胚胎干細胞的來源有限且涉及很嚴重的倫理道德爭議，所以成體干細胞似乎更適合在再生醫(yī)學中的應用。
[0003]研究表明，毛囊干細胞(Hair Follicle Stem Cells，HFSCs)是一類存在于毛囊外根鞘隆突部的干細胞，具有未分化性、自我更新和體外增殖能力強等特點(Cotsarelis G,et al.1990; Cotsarelis G.2006)。體外培養(yǎng)的HFSCs表現(xiàn)出高克隆形成能力，具有非常高的再生潛能(Rochat A，et al.1994)。它來源于皮膚、毛發(fā)，數(shù)量極其可觀，且沒有嚴重的并發(fā)癥，無免疫原性，可供自體移植，是最容易獲得的干細胞來源之一。研究毛囊干細胞的多方向分化潛能、誘導毛囊干細胞定向分化為血管內(nèi)皮細胞以及No tch通路對毛囊干細胞誘導分化為血管內(nèi)皮細胞效率的影響，為組織工程皮膚構(gòu)建、缺血性疾病的治療提供合適的種子細胞提供了新的途徑。
[0004]1997年，Asahara等(Asahara T, et al.1997)首次發(fā)現(xiàn)人體外周血中存在能分化為血管內(nèi)皮細胞(Endothelial Ce 11，ECs )的前體細胞，將其命名為內(nèi)皮祖細胞(Endothelial Progenitor Cells，EPCs) JPCs不僅參與胚胎期的血管發(fā)生，而且在成體的血管生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。但EPCs主要存在于骨髓和外周血中，其來源和數(shù)量非常有限，獲取的細胞純度較低、增殖能力較差，能夠成功分化成ECs的效率更低，而且多個部位穿刺取材對患者的損傷大(Gehling UM, et al.2000; Casamassimi A, et al.2007)。此外，ECs在血管的發(fā)生和形成過程中也演繹著非常重要的角色。然而，ECs自體取材來源有限，取材后極易引起橋血管的狹窄、閉塞，易加重對患者的損傷，且經(jīng)過原代分離培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞極易老化，細胞周期短，增殖能力非常局限。這些都限制了 ECs的直接獲取和應用。遂考慮利用干細胞誘導的方法。
[0005]近年來圍繞血管內(nèi)皮生長因子(VascularEndothelial Growth Factor，VEGF)為中心的血管再生性基因治療研究成為國內(nèi)外研究熱點。其中，VEGF是最重要的調(diào)控因子之一，其作為特異性的血管內(nèi)皮細胞有絲分裂原，在血管生成、組織缺血修復過程中起著重要作用，而VEGF165是血管內(nèi)皮細胞生長因子5種亞型之一，其活性最強，分布范圍最廣，是體內(nèi)發(fā)揮作用的主要形式(Neufeld G, et al.1999; Robinson CJ, et al.2001)。
[0006]γ—分泌酶主要參與了β-淀粉樣蛋白前體(APP)和Notch等重要跨膜蛋白的切割和水解過程，其抑制劑(DAPT)則是Notch信號通路的特異性阻斷劑，被較多的運用于Notch信號通路轉(zhuǎn)導機制的研究中(Li S，et al.2012 ；Mori M, et al.2012 ；Subramaniam D, et al.2012) Jotch信號通路是生物進化過程中的一條高度保守的通路，主要參與了細胞增殖、分化、凋亡、迀移、血管發(fā)生等多種演變過程，甚至也能介導細胞間的相互作用(Guo F，et al.2012；Liu ff, et al.2013；Al Ha j, et al.2009)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于，針對以上存在的問題，提供一種毛囊干細胞誘導分化為血管內(nèi)皮細胞的抑制方法。
[0008]為此，本發(fā)明提供如下解決方案:
一種毛囊干細胞誘導分化為血管內(nèi)皮細胞的抑制方法，所述抑制方法包括:
(1)大鼠毛囊干細胞的分離:
取新生I周齡SD大鼠，大鼠的體重為24±4 g，頸椎脫白法處死后，放入裝有75%乙醇的燒杯消毒后取出；在超凈臺中，用眼科剪剪短觸須并剪下觸須部皮膚，75%乙醇再漂洗I次，之后用PBS漂洗3次，然后用1% IV型膠原酶和1% Dispase酶混合液37°C消化90 min后，用PBS洗兩次，體視顯微鏡下用注射器針頭將毛囊脫鞘，切去兩端，留下隆突部，將毛囊隆突部接種到鋪預先包被的培養(yǎng)皿中，加入I ml完全培養(yǎng)基；
(2)大鼠毛囊干細胞的培養(yǎng):
在37°C、5% CO2培養(yǎng)條件下培養(yǎng)I h，再緩緩加入2 ml完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 h，待組織基本貼壁后繼續(xù)緩慢加入3 ml完全培養(yǎng)基，之后每2-3 d換液；
(3)大鼠毛囊干細胞的純化:
將100 yg/ml IV型膠原按照3 ml/100 mm dish的量包被在培養(yǎng)皿中，室溫靜置I h;將100 mm培養(yǎng)皿的原代細胞用TrypLE ? Select(IX)胰蛋白酶替代酶消化，離心收集細胞后，吹打成單細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中，20 min后，將未貼壁的細胞連同培養(yǎng)液一起吸出；貼壁的細胞用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3天換液；
(4)大鼠毛囊干細胞誘導分化為血管內(nèi)皮細胞的抑制:
收集純化后的第三代細胞用于該步實驗，將純化后的第三代細胞置于含有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，待貼壁細胞達到60%?70%生長融合后，將上述完全培養(yǎng)基換成抑制培養(yǎng)基在37°C、5% CO2培養(yǎng)條件下進行誘導抑制培養(yǎng)，且每兩天換一次抑制培養(yǎng)基。
[0009]優(yōu)選地，所述完全培養(yǎng)基包括如下組分:44 ml DMEM/F12培養(yǎng)液、5 ml KSR血清替代物、500 μ?青鏈霉素混合液、500 μ? L-谷氨酰胺、500 μ?非必需氨基酸、20 ng/ml重組人表皮細胞生長因子、10 ng/ml重組人堿性成纖維細胞生長因子、50 μ?羥基乙醇和10ng/ml氫化可的松。
[0010]優(yōu)選地，所述抑制培養(yǎng)基包括如下組分:88 ml DMEM/F12培養(yǎng)液、10 ml FBS胎牛血清、1000 μι青鏈霉素混合液、1000 μι L-谷氨酰胺、1000 μι非必需氨基酸、5-20 ng/ml血管內(nèi)皮細胞生長因子165、10-20 ng/ml重組人堿性成纖維細胞生長因子、0.5_1.0 μmol/L DAPT, 100 μ?羥基乙醇、10 ng/ml氫化可的松。
[0011]優(yōu)選地，所述抑制培養(yǎng)基包括如下組分:88 ml DMEM/F12培養(yǎng)液、10 ml FBS胎牛血清、1000 μι青鏈霉素混合液、1000 μι L-谷氨酰胺、1000 μι非必需氨基酸、10 ng/ml血管內(nèi)皮細胞生長因子165、10 ng/ml重組人堿性成纖維細胞生長因子、0.5 ymol/LDAPTaOO μ?羥基乙醇、10 ng/ml氫化可的松。
[0012]本發(fā)明中，完全培養(yǎng)基和抑制培養(yǎng)基中的各項成分均可以通過市購的方式獲得，例如:DMEM/F12培養(yǎng)液購自重組美國Gibco公司，商品號為12660-012 ；人堿性成纖維細胞生長因子購自美國R&D公司，商品號為233-FB-025。
[0013]本發(fā)明有如下優(yōu)點:
(1)作為干細胞，毛囊干細胞具有體外培養(yǎng)時能快速大量擴增，長期體外傳代培養(yǎng)，細胞功能旺盛等特點，并且具有很高的再生和分化能力，這將極大縮短體外培養(yǎng)擴增時間，提高臨床治療效率；
(2)所用的種子細胞一毛囊干細胞取自自體毛發(fā)，來源非常豐富，也非常容易獲得，且不會對患者造成任何損傷和痛苦，也極大地降低了免疫排斥反應和傳播疾病等概率；
(3)首次采用血管內(nèi)皮細胞生長因子165為誘導因子使大鼠毛囊干細胞向血管內(nèi)皮細胞高效定向分化；
(4)本發(fā)明所提供的毛囊細胞誘導分化為血管內(nèi)皮細胞的抑制方法，能夠調(diào)節(jié)毛囊干細胞誘導分化為血管內(nèi)皮細胞的形成與生長，促進傷口的有效愈合；
(5)本發(fā)明所提供的毛囊細胞誘導分化為血管內(nèi)皮細胞的抑制方法也可為組織工程化皮膚的血管化、細胞移植治療缺血性疾病等難題提供種子細胞來源。
【附圖說明】
[0014]圖1為本發(fā)明所提供的原代大鼠毛囊干細胞從毛囊隆突部爬出，呈鳥巢狀、上皮樣細胞，排列緊密100X ;
圖2為本發(fā)明所提供的IV型膠原篩選純化后的P3代大鼠毛囊干細胞，呈典型的鋪路石狀 100X ;
圖3為本發(fā)明所提供的P3代大鼠毛囊干細胞的流式細胞儀檢測，分別為整合素β?、整合素a6、角蛋白 15、P63、CD31、VE-cadherin的陽性率；
圖4為本發(fā)明所提供的P3代大鼠毛囊干細胞的透射電鏡下超微結(jié)構(gòu)；
圖5為本發(fā)明所提供的抑制前后血管內(nèi)皮細胞標記物⑶31、VE-cadherin的蛋白表達情況；
圖6為本發(fā)明所提供的抑制前后體外Dil-ac-LDL吞噬功能比較。
【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
[0016]1.大鼠毛囊干細胞的分離、培養(yǎng)、純化和鑒定 1.1大鼠毛囊干細胞的分離
取新生I周齡SD大鼠，頸椎脫白法處死后，放入裝有75%乙醇的燒杯消毒后取出。在超凈臺中，用眼科剪剪短觸須并剪下觸須部皮膚，75%乙醇再漂洗I次，之后用PBS漂洗3次。然后用1%IV型膠原酶和l%Dispase酶混合液37°C消化90min后，用PBS洗兩次。體視顯微鏡下用Iml注射器針頭將毛囊脫鞘，切去兩端，留下隆突部，將毛囊隆突部接種到鋪預先包被的培養(yǎng)皿中，加入I ml完全培養(yǎng)基。
[0017]所述完全培養(yǎng)基成分為:44 ml DMEM/F12培養(yǎng)液、5 ml KSR血清替代物、500 μ?青鏈霉素混合液、500 μι L-谷氨酰胺、500