自組裝間充質(zhì)干細胞團塊的制備、誘導分化及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于干細胞技術領域，具體涉及一種自組裝間充質(zhì)干細胞團塊的制備方法，向軟骨細胞分化的方法，及其在關節(jié)軟骨缺損修復中的應用。
【背景技術】
[0002]自體軟骨細胞移植(AutologousChondrocytes Implantat1n，ACI)是目前治療較大面積軟骨缺損最先進的方法，是將患者自體軟骨細胞在體外進行擴增，再與支架材料復合后進行三維培養(yǎng)，最后將“細胞一材料”復合物移植到軟骨缺損部位。然而，軟骨細胞是一種數(shù)量很少的終末分化細胞，傳代培養(yǎng)困難且容易失去軟骨表型。軟骨細胞數(shù)量少、難增殖、去分化的缺點限制了自體軟骨細胞移植技術在臨床的應用。
[0003]間充質(zhì)干細胞是一種來源于發(fā)育早期中胚層和外胚層的多潛能干細胞，存在于脂肪、骨髓、滑膜、臍帶血等多種組織中。間充質(zhì)干細胞具有在體外培養(yǎng)條件下快速增殖的能力，并且能在特定的條件下向軟骨細胞分化。因此，間充質(zhì)干細胞是關節(jié)軟骨缺損修復中極具前景的細胞來源。
[0004]研宄發(fā)現(xiàn)，適當?shù)纳L因子組合和高密度三維動態(tài)培養(yǎng)是間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化的關鍵因素。專利公布號為103223194A的中國專利公開了一種用于軟骨損傷修復的軟骨移植物及其制備方法，將脂肪間充質(zhì)干細胞和軟骨細胞植入I型膠原的三維基材中進行共培養(yǎng)，使脂肪間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化以彌補軟骨細胞的不足。專利公布號為103966161A的中國專利公開了一種模擬體內(nèi)微環(huán)境的干細胞培養(yǎng)體系，用瓊脂糖構建三維支架材料，模擬體內(nèi)微環(huán)境動態(tài)培養(yǎng)干細胞，使干細胞維持自我更新、增殖和定向分化。專利公布號為102858381A的專利公開了一種細胞三維構建體及制備方法，以及用于組織修復，該發(fā)明使用生物相容性良好的天然或非天然聚合物包裹干細胞，形成細胞三維構建體。
[0005]上述專利將間充質(zhì)干細胞包裹在支架材料中進行三維培養(yǎng)，支架材料的組織相容性和降解產(chǎn)物會對細胞活性產(chǎn)生影響。同時，支架材料的孔徑和孔隙率應當與細胞相匹配，否則會影響細胞的生長和外界營養(yǎng)物質(zhì)交換。在使用培養(yǎng)后的間充質(zhì)干細胞時，若直接以三維構建體進行移植，支架材料降解后形成的空隙則難以填補；若將間充質(zhì)干細胞從支架材料中釋放，則會對間充質(zhì)細胞造成損傷。
[0006]專利號為ZL201210410047.6的中國專利公開了一種誘導間充質(zhì)干細胞成為無支架軟骨的制備方法，將間充質(zhì)干細胞高密度接種在15 ml離心管中，離心后靜置培養(yǎng)形成細胞團塊。但是，離心形成的細胞團塊，其中心部位的細胞結(jié)合緊密，不利于營養(yǎng)交換，細胞容易發(fā)生壞死。此外，成軟骨細胞誘導液的刺激方法單一，造成間充質(zhì)干細胞的分化能力弱，形成的軟骨細胞表型不穩(wěn)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明針對間充質(zhì)干細胞包裹支架材料進行三維培養(yǎng)，三維構建體移植以及向軟骨細胞分化效果不理想的技術問題，提供了一種自組裝間充質(zhì)干細胞團塊的制備方法以及誘導間充質(zhì)干細胞團塊向軟骨細胞分化的方法。本發(fā)明還給出了其在關節(jié)軟骨缺損修復中的應用。本發(fā)明無需使用支架材料以實現(xiàn)間充質(zhì)干細胞的高密度三維動態(tài)培養(yǎng)。
[0008]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下的技術方案:
一種自組裝間充質(zhì)干細胞團塊，可通過下述方法制備:
步驟一，多孔培養(yǎng)板的包被
在無菌條件下，使用水凝膠包被多孔培養(yǎng)板；
步驟二，間充質(zhì)干細胞的擴增培養(yǎng)
將間充質(zhì)干細胞接種在包被后的培養(yǎng)板中，將間充質(zhì)干細胞擴增培養(yǎng)至第三代；
步驟三，自組裝間充質(zhì)干細胞團塊的形成
取步驟二培養(yǎng)的第三代間充質(zhì)干細胞，用團塊形成誘導液配制成間充質(zhì)干細胞懸液，向步驟一包被的多孔培養(yǎng)板的每一孔中加入100?250 μ I間充質(zhì)干細胞懸液，使每一孔中細胞數(shù)量為I X 15?I X 10 6個，每天換團塊形成誘導液一次，將多孔培養(yǎng)板置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4?7天后，形成直徑為500?600 μπι的間充質(zhì)干細胞團塊。
[0009]優(yōu)選地，上述步驟一包被多孔培養(yǎng)板的方法為:在無菌條件下，向孔直徑為6?7mm、孔深度為10?12mm、底部為U型的多孔培養(yǎng)板的每一孔中加入30?60 μ I水凝膠，待凝膠凝固后，形成包被的多孔培養(yǎng)板。
[0010]所述水凝膠可以選用瓊脂糖凝膠、海藻酸鈉凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、PLGA凝膠中的任一種。PLGA凝膠即聚乳酸-輕基乙酸共聚物(poly (lactic-co-glycolic acid)，PLGA)。為避免水凝膠在包被前凝固，應該根據(jù)所選水凝膠凝固特征的不同，選擇適宜的操作時機。本發(fā)明最優(yōu)選的水凝膠是瓊脂糖凝膠，使用濃度為1%?2% (W/V)。
[0011]上述步驟三所使用的團塊形成誘導液由高糖DMEM、胎牛血清、維生素C和TGF- β 3組成，其中，胎牛血清的的體積分數(shù)為10%?15%，維生素C的濃度為10?100 mg/ml, TGF-β 3的濃度為10?50 ng/ml。TGF-β 3是一種轉(zhuǎn)化生長因子，屬于調(diào)節(jié)細胞生長和分化的TGF-β超家族。
[0012]上述步驟二所述間充質(zhì)干細胞包括各種來源的間充質(zhì)干細胞，可以選自骨髓間充質(zhì)干細胞、脂肪間充質(zhì)干細胞、滑膜間充質(zhì)干細胞、臍帶血間充質(zhì)干細胞中的任一種。間充質(zhì)干細胞的擴增的培養(yǎng)以及使用的培養(yǎng)基可以參考已有技術。優(yōu)選地，所使用的間充質(zhì)干細胞優(yōu)選為骨髓間充質(zhì)干細胞。
[0013]另一方面，本發(fā)明還給出了誘導所述自組裝間充質(zhì)干細胞團塊向軟骨細胞的分化方法。
[0014]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施例，誘導分化自組裝間充質(zhì)干細胞團塊的方法為:將間充質(zhì)干細胞團塊置于50 ml離心管中，加入成軟骨細胞誘導液10?25 ml，密封離心管管口并橫置于恒溫氣浴搖床中以75 r/min震蕩培養(yǎng)，每天換成軟骨細胞誘導液一次，連續(xù)誘導15天后收集細胞團塊。
[0015]為了確認間充質(zhì)干細胞團塊分化為軟骨細胞，可以使用免疫組織化學染色、蛋白含量檢測、分子生物學檢測等已有方法確定。
[0016]優(yōu)選地，誘導間充質(zhì)干細胞團塊分化所使用的成軟骨細胞誘導液由高糖DMEMJS牛血清、胰島素、TGF-β 3、地塞米松、維生素C、IL-1 β、轉(zhuǎn)鐵蛋白和ΒΜΡ-6組成。其中，胎牛血清的的體積分數(shù)為10%?15%，胰島素的濃度為I?10 μ g/ml，TGF-β 3的濃度為10?50 ng/ml，地塞米松的濃度為10?150 nmol/L，維生素C的濃度為20?70 mg/ml, IL-1 β的濃度為I?6ng/ml，轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為4?8 mg/ml,BMP-6的濃度為300?500 ng/ml。IL-1 β是一種白細胞介素類細胞因子。ΒΜΡ-6是一種股形態(tài)發(fā)生蛋白。
[0017]還有，本發(fā)明還給出了自組裝間充質(zhì)干細胞團塊在關節(jié)軟骨缺損修復中的應用。
[0018]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果或優(yōu)點:
(I)通過誘導，使間充質(zhì)干細胞自組裝形成三維細胞團塊，無需使用支架材料，增加了細胞間的通訊和相互作用，有利于間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化。
[0019](2)自組裝形成的間充質(zhì)干細胞團塊緊密程度適中，處于中心部位的細胞可以順利的與外界進行營養(yǎng)交換，不易發(fā)生凋亡和壞死，團塊各個位置的間充質(zhì)干細胞的分化程度更加均一。
[0020](3)恒溫震蕩培養(yǎng)實現(xiàn)了對間充質(zhì)干細胞的力學刺激和低氧分壓環(huán)境誘導，增加了間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化的能力和表型維持能力。
[0021](4)所形成的間充質(zhì)干細胞團塊可以直接用于軟骨缺損的移植，操作簡單，間充質(zhì)干細胞團塊間可以在修復過程中通過持續(xù)分泌細胞外基質(zhì)形成連接，填補團塊間的縫隙，形成完整的修復組織。
【附圖說明】
[0022]圖1，實施例1擴增培養(yǎng)中的骨髓間充質(zhì)干細胞。
[0023]圖2，實施例1自組裝形成的骨髓間充質(zhì)干細胞團塊。其中，圖2Α所示為骨髓間充質(zhì)干細胞在多孔培養(yǎng)板中自組裝形成的細胞團塊；圖2Β所示為顯微鏡下骨髓間充質(zhì)干細胞團塊，其直徑約為500?600 μ m。
[0024]圖3，成軟骨細胞誘導后的細胞團塊。其中，圖3A所示為成軟骨細胞誘導后的細胞團塊，可見團塊被持續(xù)向外分泌的細胞外基質(zhì)包圍；圖3B所示為成軟骨細胞誘導后的細胞團塊甲苯胺藍染色結(jié)果，可見細胞團塊中骨髓間充質(zhì)干細胞分化均勻，團塊中心沒有壞死發(fā)生。
[0025]圖4，實施例3成軟骨細胞誘導后的細胞團塊修復兔關節(jié)軟骨缺損。其中，圖4A所示為兔關節(jié)軟骨缺損修復后大體圖，結(jié)果顯示，修復后缺損部位與周圍軟骨組織整合良好；圖4B顯示兔關節(jié)軟骨缺損修復后HE染色結(jié)果，結(jié)果顯示關節(jié)軟骨缺損區(qū)域平整、光滑，團塊間無空隙存在。
[0026]圖5，實施例4成軟骨細胞誘導后的細胞團塊修復羊關節(jié)軟骨缺損。其中，圖5A所示為羊關節(jié)軟骨缺損修復后效果，可見修復組織表面平整、光滑，與周圍組織整合良好；圖5B所示為羊關節(jié)缺損修復后HE染色結(jié)果，顯示修復區(qū)域有新生軟骨形成。
【具體實施方式】
[0027]實施例1，誘導骨髓間充質(zhì)干細胞分化成軟骨細胞步驟一、多孔細胞培養(yǎng)板的包被
稱取瓊脂糖粉末2 g，置于三角瓶中，向其中加入100 ml無菌去離子水，充分攪拌形成濃度為2 % (W/V)的瓊脂糖溶液。將該三角瓶放置于微波爐中加熱至沸騰，取出后于無菌條件下靜置，待冷卻至45°C時向孔徑6.35 mm，深度10.03 mm的多孔培養(yǎng)板的每一孔中加Λ 50 μ I瓊脂糖凝膠，靜置待瓊脂糖凝固后備用。
[0028]步驟二、骨髓間充質(zhì)干細胞的分離和培養(yǎng)
取4?5月齡新西蘭白兔，用1%戊巴比妥鈉以3.5ml/Kg的計量耳緣靜脈注射麻醉，于兔股骨處備皮。沿兔股骨上方表皮切開Icm切口，暴露股骨表面。取20ml注射器一只，吸取Iml肝素鈉注射液，從股骨表面穿刺至骨髓腔中，不斷變換角度吸取骨髓血10?15ml。
[0029]在一無菌50ml離心管中，加入4ml Ficoll人淋巴細胞分離液，將骨髓血沿離心管管壁緩慢加入上部分離液，于2000 r/min離心20 min后取出，緩慢吸取從上數(shù)第二層液體，置于一新50ml離心管中；加入PBS混勾后于800 r/min離心5 min，重復離心兩次，棄掉上清液后加含體積分數(shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基3?4 ml，吹勻細胞，接種于培養(yǎng)瓶中，37°C恒溫5% C02孵箱培養(yǎng)。
[0030]待細胞生長至底面積80%以上時，將細胞用0.25%胰蛋白酶進行消化，分散成單細胞，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，首次傳代。規(guī)律換液，4?6天傳代一次，培養(yǎng)至第三代。擴增培養(yǎng)中的骨髓間充質(zhì)干細胞見圖1。
[0031]步驟三、骨髓間充質(zhì)干細胞團塊的形成
使用胰蛋白酶消化獲得上述第三代骨髓間充質(zhì)干細胞