。使用團(tuán)塊形成誘導(dǎo)液，重懸骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為I X 16個(gè)/ml ;吸取細(xì)胞懸液加入步驟一制備的多孔培養(yǎng)板中，每孔100 μ 1，置于37°C恒溫5% C02孵箱培養(yǎng)，每天換團(tuán)塊形成誘導(dǎo)液一次。培養(yǎng)至第7天時(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形成直徑為550 μπι球形團(tuán)塊，見圖2。
[0032]本步驟三所使用的團(tuán)塊形成誘導(dǎo)液由高糖DMEM、胎牛血清、維生素C和TGF-β 3組成，其中，胎牛血清的的體積分?jǐn)?shù)為10%，維生素C的濃度為70mg/ml，TGF-β 3的濃度為10ng/mlο
[0033]步驟四、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)
收集步驟三培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊于50ml離心管中，加入成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液25ml，抒緊離心管蓋，水平放置于恒溫氣浴搖床中，于37°C，75r/min震蕩培養(yǎng)，每天換成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液一次。15天后收集細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，如圖3B所示，紫色部分為軟骨細(xì)胞。
[0034]誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊分化所使用的成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液由高糖DMEM、胎牛血清、胰島素、TGF-β 3、地塞米松、維生素C、IL-1 β、轉(zhuǎn)鐵蛋白和ΒΜΡ-6組成。其中，胎牛血清的體積分?jǐn)?shù)為10%，胰島素的濃度為5 μ g/ml, TGF-β 3的濃度為50ng/ml，地塞米松的濃度為10nmol/L，維生素C的濃度為50mg/ml，IL-1 β的濃度為4ng/ml，轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為4mg/ml，ΒΜΡ-6 的濃度為 300ng/ml。
[0035]實(shí)施例2，誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞步驟一、多孔細(xì)胞培養(yǎng)板的包被
取無菌去離子水5.4 ml，濃度為30 % (W/V)的丙烯酰胺-雙丙烯酰胺混合物2.0 ml，ρΗ8.8 的 1.5Μ Tris 溶液 2.5 ml，10% (W/V)過硫酸銨 0.lml，TEMED 8 μ I 充分混勻；制成1ml丙烯酰胺濃度為6% (W/V)的溶液后，迅速向孔徑6.35mm，深度10.03mm的多孔培養(yǎng)板的每一孔中加入60 μ I上述溶液，靜置待聚丙烯酰胺凝膠凝固后備用。
[0036]步驟二、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
從動(dòng)物皮下獲取脂肪組織，去除粘附的膜和血漬，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后用剪刀將脂肪組織分散，置于無菌50ml離心管內(nèi)。將PBS配制的濃度為0.2%(W/V)的I型膠原酶溶液加入上述50ml離心管內(nèi)，I型膠原酶溶液加入量為脂肪組織體積的5倍，于37°C消化1.5h，期間晃動(dòng)離心管數(shù)次使脂肪組織充分消化。消化完成后將離心管于lOOOr/min離心5min，棄去上清液。向50ml離心管中加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基3?4ml，重懸細(xì)胞團(tuán)塊接種于培養(yǎng)瓶中，37°C恒溫5% C02孵箱培養(yǎng)。
[0037]原代細(xì)胞培養(yǎng)4?5天，待細(xì)胞生長(zhǎng)至底面積80%以上時(shí)，將細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，分散成單細(xì)胞，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，首次傳代。規(guī)律換液，4?6天傳代一次，培養(yǎng)至第三代。
[0038]步驟三、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊的形成
使用胰蛋白酶消化獲得上述第三代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。使用團(tuán)塊形成誘導(dǎo)液，重懸脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為I X 16個(gè)/ml ;吸取細(xì)胞懸液加入步驟一制備的多孔培養(yǎng)板中，每孔100 μ 1，置于37°C恒溫5% (1)2孵箱培養(yǎng)，每天換團(tuán)塊形成誘導(dǎo)液一次。培養(yǎng)至第5天時(shí)，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞形成直徑約為500 μπι球形細(xì)胞團(tuán)塊。
[0039]本步驟三所使用的團(tuán)塊形成誘導(dǎo)液由高糖DMEM、胎牛血清、維生素C和TGF-β 3組成，其中，胎牛血清的的體積分?jǐn)?shù)為10%，維生素C的濃度為50mg/ml，TGF-β 3的濃度為30ng/ml。
[0040]步驟四、脂肪充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)
收集脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊于50ml離心管中，加入成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液25ml，擰緊離心管蓋，水平放置于恒溫氣浴搖床中，于37°C，75r/min震蕩培養(yǎng)，每天換成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液一次。15天后收集細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色。
[0041]誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊分化所使用的成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液由高糖DMEM、胎牛血清、胰島素、TGF-β 3、地塞米松、維生素C、IL-1 β、轉(zhuǎn)鐵蛋白和ΒΜΡ-6組成。其中，胎牛血清的體積分?jǐn)?shù)為10%，胰島素的濃度為10 μ g/ml，TGF- β 3的濃度為50ng/ml，地塞米松的濃度為10nmol/L，維生素C的濃度為50mg/ml，IL-1 β的濃度為5ng/ml，轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為4mg/ml，ΒΜΡ-6 的濃度為 300ng/ml。
[0042]實(shí)施例3，成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損
將得到的向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊收集起來(圖3A)，使用PBS清洗3遍后備用。
[0043]按實(shí)施例1中所述方法麻醉新西蘭白兔，取仰臥位，于右膝關(guān)節(jié)處備皮。取內(nèi)側(cè)髕旁入路暴露膝關(guān)節(jié)股骨端，使用電動(dòng)骨鉆在關(guān)節(jié)滑車部位制造直徑4.5mm，深度3mm的關(guān)節(jié)軟骨缺損。將上述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊填充至缺損部位，至接近關(guān)節(jié)面1/3處，使用纖維蛋白膠進(jìn)行封閉，髕骨復(fù)位，分層縫合傷口并消毒。
[0044]三個(gè)月后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取完整右膝關(guān)節(jié)股骨端，觀察缺損部位修復(fù)情況，如圖4A所示，缺損表面光滑，與周圍組織融合良好。經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫鈣、石蠟包埋、切片后，進(jìn)行HE染色，如圖4B所示，缺損部位被軟骨組織填充，其表面光滑，潮線完整。
[0045]上述觀察顯示，成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)后的間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊能夠有效修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損。
[0046]實(shí)施例4，成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)后脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊修復(fù)羊關(guān)節(jié)軟骨缺損將得到的向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)行收集，使用PBS清洗后備用。
[0047]用1%戊巴比妥鈉按35mg/kg靜脈麻醉動(dòng)物。取膝關(guān)節(jié)外側(cè)髕旁入路，打開關(guān)節(jié)囊。將髕骨外置脫位，暴露關(guān)節(jié)軟骨滑車部位，環(huán)鉆造直徑為6mm左右全層缺損，充分止血、沖洗，制成關(guān)節(jié)軟骨缺損模型。將上述脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊填充至缺損部位，至接近關(guān)節(jié)面1/3處，使用纖維蛋白膠進(jìn)行封閉，髕骨復(fù)位，分層縫合傷口并消毒。
[0048]24周后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，可見缺損表面光滑，與周圍組織融合良好(圖5A)。經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫鈣、石蠟包埋、切片后，進(jìn)行HE染色，缺損部位被軟骨組織填充，其表面光滑，潮線完整(圖5B)。
[0049]上面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做了進(jìn)一步的敘述，但本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識(shí)范圍內(nèi)，還可以在不脫離本發(fā)明宗旨的前提下做出各種變化。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.自組裝間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊，其特征在于，通過下述方法制備: 步驟一，多孔培養(yǎng)板的包被 在無菌條件下，使用水凝膠包被多孔培養(yǎng)板； 步驟二，間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng) 將間充質(zhì)干細(xì)胞接種在包被后的培養(yǎng)板中，將間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)至第三代； 步驟三，自組裝間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊的形成 取步驟二培養(yǎng)的第三代間充質(zhì)干細(xì)胞，用團(tuán)塊形成誘導(dǎo)液配制成間充質(zhì)干細(xì)胞懸液，向步驟一包被的多孔培養(yǎng)板的每一孔中加入100?250 μ I間充質(zhì)干細(xì)胞懸液，使每一孔中細(xì)胞數(shù)量為I X 15?I X 10 6個(gè)，每天換團(tuán)塊形成誘導(dǎo)液一次，將多孔培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4?7天后，形成直徑為500?600 μπι的間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自組裝間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊，其特征在于，步驟一所述多孔培養(yǎng)板的包被方法為:在無菌條件下，向孔直徑為6?7mm、孔深度為10?12mm、底部為U型的多孔培養(yǎng)板的每一孔中加入30?60 μ I水凝膠，待凝膠凝固后，形成包被的多孔培養(yǎng)板。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的自組裝間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊，其特征在于，所述水凝膠選自瓊脂糖凝膠、海藻酸鈉凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、PLGA凝膠中的任一種。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自組裝間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊，其特征在于，所述水凝膠為瓊脂糖凝膠，瓊脂糖凝膠的濃度為I?2W/V%。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自組裝間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊，其特征在于，所述團(tuán)塊形成誘導(dǎo)液由高糖DMEM、胎牛血清、維生素C和TGF- β 3組成，其中，胎牛血清的的體積分?jǐn)?shù)為10%?15%，維生素C的濃度為10?100 mg/ml, TGF-β 3的濃度為10?50 ng/ml。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自組裝間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊，其特征在于，所述間充質(zhì)干細(xì)胞選自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞中的任一種。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的自組裝間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊，其特征在于，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。8.誘導(dǎo)權(quán)利要求1?2、4?7中任一項(xiàng)所述自組裝間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊向軟骨細(xì)胞的分化方法，其特征在于，將間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊置于50 ml離心管中，加入成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液10?25 ml，密封離心管管口并橫置于恒溫氣浴搖床中以75 r/min震蕩培養(yǎng)，每天換成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液一次，連續(xù)誘導(dǎo)15天后收集細(xì)胞團(tuán)塊。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的誘導(dǎo)分化方法，其特征在于，所述成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液由高糖DMEM、胎牛血清、胰島素、TGF-β 3、地塞米松、維生素C、IL-1 β、轉(zhuǎn)鐵蛋白和ΒΜΡ-6組成，其中，胎牛血清的的體積分?jǐn)?shù)為10%?15%，胰島素的濃度為I?10 μ g/ml，TGF-f3 3的濃度為10?50 ng/ml，地塞米松的濃度為10?150 nmol/L，維生素C的濃度為20?70 mg/ml,IL-1 β的濃度為I?6ng/ml，轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為4?8 mg/ml,BMP-6的濃度為300?500ng/mlο10.如權(quán)利要求1?2、4?7中任一項(xiàng)所述的自組裝間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊在關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種自組裝間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊的制備、誘導(dǎo)分化及應(yīng)用。間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊通過下述方法制備：1）在無菌條件下，使用水凝膠包被多孔培養(yǎng)板；2）將間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)至第三代；3）用團(tuán)塊形成誘導(dǎo)液將第三代間充質(zhì)干細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，向包被的多孔培養(yǎng)板的每一孔中加入細(xì)胞懸液，使每一孔中細(xì)胞數(shù)量為1×105～1×106個(gè)，每天換團(tuán)塊形成誘導(dǎo)液一次，將多孔培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，形成直徑為500～600μm的間充質(zhì)干細(xì)胞團(tuán)塊。本發(fā)明無需使用支架材料實(shí)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的高密度三維培養(yǎng)，增加成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的均一性，可直接應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)。
【IPC分類】A61K35/28, C12N5/0775, A61P19/02, C12N5/077
【公開號(hào)】CN104962517
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510453579
【發(fā)明人】魏菁
【申請(qǐng)人】西安芙金細(xì)胞科技有限公司
【公開日】2015年10月7日
【申請(qǐng)日】2015年7月29日