專利名稱：：刺激真皮乳頭細(xì)胞生長及促進(jìn)毛囊生長的、含有維生素c衍生物的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種含有維生素c衍生物的組合物，該組合物可用于刺激真皮乳頭細(xì)胞生長及促進(jìn)毛囊生長。
背景技術(shù)：
：通常，哺乳動(dòng)物的毛囊是一種組織嚴(yán)密的、多層且動(dòng)態(tài)的器官。毛囊包括諸如內(nèi)根鞘細(xì)胞和外根鞘細(xì)胞之類的上皮細(xì)胞、衍生自上皮組織的基質(zhì)和毛干、以及衍生自間充組織的真皮乳頭細(xì)胞和真皮鞘細(xì)胞。上皮組織和間充組織之間的相互作用對于出生后毛發(fā)的生長以及毛囊的發(fā)育是十分必要的。出生后毛發(fā)的生長具有以下細(xì)胞周期生長期、退化期和毛發(fā)生長終期。人們已經(jīng)知道真皮乳頭在生長期期間被上皮基質(zhì)細(xì)胞包圍，并且真皮乳頭所分泌的生長因子(例如胰島素樣生長因子1(IGF-1)、角化細(xì)胞生長因子(KGF)等)在該生長期期間被分化出來，促使上皮細(xì)胞的增殖和毛干的生成(參見文獻(xiàn)ItamiS等人，"BiochenBiophysResCommun"，212:第988-94頁，1995年；WernerS等人，"Science",266:第819-22頁，1994年)。同時(shí)，人們發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞在退化期因真皮乳頭內(nèi)所分泌的生長抑制因子(例如腫瘤生長因子(3(TGF-P))而發(fā)生程序性細(xì)胞死亡(凋亡)(參見文獻(xiàn):Soma等人，"JInvestDermatol"，111:第948-54頁，1998年；Hibino和Nishiyama，"JDermatolSci"，35:第9-18頁，2004年)。因此，人們已知真皮乳頭細(xì)胞分泌的因子控制毛發(fā)的生長。同時(shí)真皮乳頭的尺寸也與毛囊的尺寸成比例(參見文獻(xiàn)Stenn和Paus，"PhysiolRev"，81:第449-494頁，2001年)。此外，可以預(yù)測能夠控制真皮乳頭細(xì)胞生長或其基因表達(dá)的天然提取物或化學(xué)品，在控制毛發(fā)生長中發(fā)揮重要的作用。維生素C(L-抗壞血酸)在膠原蛋白的合成中表現(xiàn)出輔助因子的活性，并可用作培養(yǎng)基中的補(bǔ)充成分。然而，由于維生素c在水溶液、特別是在通常的培養(yǎng)條件下被快速氧化和降解，所以，維生素C的這種應(yīng)用受到了限制。維生素C衍生物L(fēng)-抗壞血酸-2-磷酸酯鎂鹽(也稱作Asc2-P)是一種比維生素C更穩(wěn)定的制品，并且已經(jīng)在多種培養(yǎng)基中被用作補(bǔ)充成分。與維生素C一樣，Asc2-P也刺激人真皮成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞的生長(參見文獻(xiàn)Hata等人，"EurJBiohem"，173:第261-267頁，1988年)。但是人們根本不知道維生素C或Asc2-P對毛發(fā)和真皮乳頭細(xì)胞的生長有什么影響。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明被設(shè)計(jì)用來解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題，由此本發(fā)明的目的就是提供一種治療脫發(fā)癥的藥劑，該藥劑能夠剌激真皮乳頭細(xì)胞和/或毛囊的生長。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種剌激真皮乳頭細(xì)胞生長及促進(jìn)毛囊生長的組合物，該組合物含有維生素C衍生物作為有效成分。在本發(fā)明中，優(yōu)選的是，維生素C衍生物選自L-抗壞血酸-2-磷酸酯鎂鹽、L-抗壞血酸棕櫚酸酯和L-抗壞血酸硬脂酸酯，并且下面化學(xué)式1所示的L-抗壞血酸-2-磷酸酯鎂鹽是最優(yōu)選的。而且，本發(fā)明的維生素C衍生物的特征在于它們促進(jìn)毛囊的生長、刺激真皮乳頭細(xì)胞的生長、刺激真皮乳頭細(xì)胞內(nèi)胰島素樣生長因子1(IGF-1)的產(chǎn)生、增強(qiáng)真皮乳頭細(xì)胞和毛囊內(nèi)多功能蛋白聚糖的表達(dá)以及增強(qiáng)真皮乳頭細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的表達(dá)。附圖筒要說明下文將參照附圖，將更充分地說明本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的以上這些或其它特征、方面和優(yōu)點(diǎn)。在附圖中圖1是顯示Asc2-P對體外孵育的毛囊的生長的影響的圖。將毛囊在Asc2-P存在下孵育9天后，測量毛囊的生長長度(*，P<0.05)。圖2是顯示Asc2-P對孵育的真皮乳頭細(xì)胞的生長的影響的圖。將真皮乳頭細(xì)胞在含有Asc2-P的培養(yǎng)基中孵育5天后，使用MTT法計(jì)量細(xì)胞的數(shù)量(*，P<0.05)。圖3是顯示Asc2-P對真皮乳頭細(xì)胞中生長因子(A)、膠原蛋白(B)、多功能蛋白聚糖(C)和堿性磷酸酶(D)的表達(dá)的影響的圖。在使用Asc2-P對真皮乳頭細(xì)胞處理5天后，測量mRNA的含量。圖4是顯示Asc2-P對毛囊中的多功能蛋白聚糖的表達(dá)的影響的圖。在使用Asc2-P對毛囊處理5天后，對其進(jìn)行免疫染色。實(shí)施本發(fā)明的最佳方式下文將參照附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的非限制性實(shí)施例。實(shí)施例1:細(xì)胞培養(yǎng)和人毛囊的生長在患有雄激素性脫發(fā)癥的患者到達(dá)Kyungpook國立大學(xué)醫(yī)院進(jìn)行頭發(fā)移植手術(shù)期間，在其同意的前提下，從他們的后腦部頭皮獲得活體解剖樣本。根據(jù)已知的方法(參見文獻(xiàn)Philpott等人，"JCellSci"，97:第463-471頁，1990年)分離并孵育毛囊。使用立體雙目顯微鏡從頭皮中分離出處于生長期的毛囊。將分離出的處于生長期的毛囊從上部切掉三分之一，所余三分之二部分置于WilliamsE培養(yǎng)基中(得自位于美國的Sigma公司)在37。C及5。/。C02氣氛下孵育。該毛囊在含有Asc2-P的培養(yǎng)基中孵育9天，然后使用立體顯微鏡測量其長度。實(shí)施例2:細(xì)胞培養(yǎng)和真皮乳頭細(xì)胞的生長使用雙目顯微鏡從病情嚴(yán)重的毛囊球部分離出真皮乳頭，然后將其轉(zhuǎn)移至組織培養(yǎng)皿中。該真皮乳頭在補(bǔ)加有青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100pg/ml)和20%熱滅活的胎牛血清(FBS，得自于美國的Hyclone公司)的DMEM培養(yǎng)基中，在37°C及5%C02氣氛下孵育5天，然后在相同的條件下傳代培養(yǎng)。在傳代培養(yǎng)后，將真皮乳頭細(xì)胞保存在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中。本發(fā)明使用二次傳代的培養(yǎng)細(xì)胞。將真皮乳頭細(xì)胞在密度為5,000個(gè)細(xì)胞/孔的96孔培養(yǎng)板中孵育過夜，該培養(yǎng)板的孔中裝有補(bǔ)加有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。然后將培養(yǎng)基更換為含有各種濃度的Asc2-P的DMEM培養(yǎng)基并孵育5天，再使用MTT法測量細(xì)胞的數(shù)量。實(shí)施例3:真皮乳頭細(xì)胞中各種基因的表達(dá)將真皮乳頭細(xì)胞在含有0.25mM的Asc2-P的培養(yǎng)基中孵育5天，然后使用TRIzol試劑(得自位于美國紐約州GrandIsland市的Gibco-BRL公司)分離出它們的RNA。使用包含SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶和六堿基隨機(jī)引物(得自Gibco-BRL公司)的cDNA合成試劑盒，由RNA合成cDNA。使用表1所示的成套的特定基因擴(kuò)增引物對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。RT-PCR引物和它們的條件列于下面的表1中。在本發(fā)明中分析了IGF-1(胰島素樣生長因子1)、HGF(肝細(xì)胞生長因子)、VEGF(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子)、KGF(角質(zhì)細(xì)胞生長因子)、i型膠原蛋白、m型膠原蛋白、多功能蛋白聚糖和堿性磷酸酶(ALP)的基因的表達(dá)水平。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例4:毛囊中多功能蛋白聚糖的免疫染色將毛囊在分別添加有O.lmM和lmM的Asc2-P的培養(yǎng)基中孵育5天，然后對多功能蛋白聚糖進(jìn)行免疫染色試驗(yàn)。實(shí)施例5:統(tǒng)計(jì)分析使用t-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)偏差分析。概率(P)值為小于或等于0.05被認(rèn)為該試驗(yàn)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。發(fā)明人從上述實(shí)施例中獲得的結(jié)果如下在體外Asc2-P對毛囊生長的刺激作用發(fā)明人研究了Asc2-P對從頭皮中分離出的人生長期毛囊的影響。結(jié)果表明當(dāng)毛囊在分別含有0.05mM和0.25mM的Asc2-P的WilliamsE培養(yǎng)基中孵育9天時(shí)，毛囊均顯著地生長(如圖1所示)。在體外Asc2-P對真皮乳頭細(xì)胞生長的刺激作用當(dāng)使用的Asc2-P的濃度分別為0.05mM、0.25mM、lmM和5mM時(shí)，Asc2-P可顯著地刺激真皮乳頭細(xì)胞的生長(如圖2所示)。特別地是，當(dāng)使用的Asc2-P的濃度為0.25mM時(shí)，Asc2-P所刺激的真皮乳頭細(xì)胞的生長與對照組相比較，要高出2.4倍。Asc2-P對真皮乳頭細(xì)胞的基因表達(dá)的影響當(dāng)使用的Asc2-P的濃度為0.25mM時(shí)，Asc2-P使IGF-1、多功能蛋白聚糖和堿性磷酸酶(ALP)的mRNA的濃度增加。但是Asc2-P對HGF、VEGF、KGF、I型膠原蛋白和III型膠原蛋白不起作用(如圖3所示)。上述免疫染色試驗(yàn)揭示出，在用Asc2-P處理的毛囊中，多功能蛋白聚糖的表達(dá)增加(如圖4所示)。工業(yè)適用性如從上述說明中可見的那樣，本發(fā)明的維生素C衍生物Asc2-P由于能夠剌激真皮乳頭細(xì)胞和/或毛囊的生長，因此可用作治療脫發(fā)癥的藥劑。權(quán)利要求1.一種治療脫發(fā)癥的組合物，該組合物含有維生素C衍生物作為有效成分。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述維生素C衍生物選自L-抗壞血酸-2-磷酸酯鎂鹽、L-抗壞血酸棕櫚酸酯和L-抗壞血酸硬脂酸酯。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述維生素C衍生物促進(jìn)毛囊的生長。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述維生素C衍生物剌激真皮乳頭細(xì)胞的生長。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述維生素C衍生物刺激真皮乳頭細(xì)胞中胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的產(chǎn)生。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述維生素C衍生物增強(qiáng)真皮乳頭細(xì)胞和毛囊中多功能蛋白聚糖的表達(dá)。7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述維生素C衍生物增強(qiáng)真皮乳頭細(xì)胞中堿性磷酸酶的表達(dá)。全文摘要本發(fā)明公開一種含有維生素C衍生物的組合物，該組合物可用于刺激真皮乳頭細(xì)胞生長及促進(jìn)毛囊生長。文檔編號A61K31/375GK101102763SQ200680002189公開日2008年1月9日申請日期2006年1月6日優(yōu)先權(quán)日2005年1月13日發(fā)明者成榮寬,金政澈,金汶奎申請人:毛發(fā)基因有限公司