反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測轉(zhuǎn)染后毛囊干細胞中VEGF165mRNA表達的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測轉(zhuǎn)染后毛囊干細胞中VEGF165mRNA表達的方法，該方法包括以下的步驟：1）提取總RNA；2）毛囊干細胞RNA的逆轉(zhuǎn)錄體系；3）聚合酶鏈式反應(yīng)；4）瓊脂糖電泳：取擴增產(chǎn)物6μl上樣，1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在透射紫外光分析儀下攝影，并用激光光密度圖象掃描儀掃描。本發(fā)明由于采用了上述的技術(shù)方案，實現(xiàn)了轉(zhuǎn)染后毛囊干細胞中VEGF165mRNA的表達的檢測。
【專利說明】反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測轉(zhuǎn)染后毛囊干細胞中VEGF165mRNA表達的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及皮膚組織工程學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測轉(zhuǎn)染后毛囊干細胞中VEGF165mRNA表達的方法。
[0002]【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]皮膚作為人體最大的器官，具有感覺、調(diào)節(jié)體溫、分泌與排泄、防止水分蒸發(fā)等多種作用，其中最主要的功能是作為人體與外界環(huán)境的屏障以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，同時其也是免疫系統(tǒng)的重要組成部分。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，特別是作為“世界工廠”的我國制造業(yè)和手工業(yè)的繁榮發(fā)展，各種涉及皮膚缺損的外傷特別是燒傷、壓軋傷、切割傷等也越來越多。其中，外傷導(dǎo)致的皮膚大面積缺損常常導(dǎo)致非常嚴重的肢體殘疾，甚至死亡。目前臨床上治療皮膚缺損的標準治療方法是自體皮膚移植，由于具有無免疫排斥反應(yīng)，成活率高等特點，其在臨床上應(yīng)用極為廣泛，并取得了很好的療效。但自體皮膚移植的缺點也非常明顯，由于是自體取材，其本身就是對患者的再次損傷,極大增加了患者痛苦,而且有發(fā)生供皮區(qū)感染，不愈合等并發(fā)癥的風(fēng)險。更為嚴重的是，對于上述的大面積皮膚缺損，常由于缺乏足夠可供移植的自體皮膚而導(dǎo)致創(chuàng)面修復(fù)困難，嚴重影響了治療進程，甚至導(dǎo)致死亡。
[0004]正因如此，科學(xué)家們一直試圖尋找一種外源性的皮膚替代物。早在公元前1500年，異種皮膚移植就被用于臨時覆蓋皮膚缺損創(chuàng)面。而隨著組織工程學(xué)的創(chuàng)立和發(fā)展，皮膚組織工程學(xué)迅速興起，并成為近十年來研究的熱點。組織工程學(xué)是應(yīng)用工程學(xué)及生命科學(xué)的原理與方法，研究生物替代物，以用于重建、保持或提高組織功能的一門學(xué)科。目前，國外應(yīng)用皮膚組織工程學(xué)構(gòu)建人工皮膚的研究已取得了實質(zhì)性進展，Apligraf, OrCel,Suprathel> Biobrane、OASIS、Integra、Lyphoder等產(chǎn)品已先后被美國藥品與食品管理局(FDA)批準上市并已應(yīng)用于臨床皮膚缺損的治療中。
[0005]然而，雖然目前已有以上數(shù)種人工皮膚產(chǎn)品可供臨床選擇，也確實促進了對大面積皮膚缺損患者的臨床治療。但是，根據(jù)我們多年臨床應(yīng)用過程中遇到的問題，結(jié)合文獻報道，我們認為目前人工皮膚移植還存在著許多問題，其中甚至包括可能導(dǎo)致治療最終失敗的“硬傷”:①由于以上人工皮膚產(chǎn)品都沒有血管生成能力，導(dǎo)致移植的人工皮膚沒有血管系統(tǒng)供給營養(yǎng)，從而使人工皮膚容易發(fā)生壞死，使移植失敗。②人工皮膚產(chǎn)品中所含的各種異體細胞容易引起免疫排斥反應(yīng)，臨床上常出現(xiàn)移植的皮膚壞死、脫落，嚴重的甚至出現(xiàn)全身免疫反應(yīng)等嚴重并發(fā)癥，并且有可能傳播疾病。③目前所有的人工皮膚產(chǎn)品都只能恢復(fù)正常皮膚的部分解剖結(jié)構(gòu)和生理功能，而無法再生具有重要功能的皮膚附屬器結(jié)構(gòu)，例如:血管、毛發(fā)、汗腺等。
[0006] 毛囊干細胞是一類存在于毛囊外根鞘隆突部的干細胞，具有未分化性、自我更新和體外增殖能力強等特點。體外培養(yǎng)研究中的毛囊干細胞表現(xiàn)出了高克隆形成能力，具有很高的再生潛能。由于毛囊干細胞來源于毛發(fā)，可以直接從患者自身取得，數(shù)量極其豐富，且沒有任何并發(fā)癥，對患者完全無創(chuàng)，現(xiàn)已成為皮膚組織工程學(xué)研究的焦點。Taylor等(Taylor G，Lehrer MS, Jensen PJ，et al.1nvolvement of follicular stem cells informing not only the follicle but also the epidermis.Cell, 2000, 102(4):451-461.)研究發(fā)現(xiàn)毛囊干細胞不僅能夠分化形成毛囊，而且還參與了表皮組織的形成過程。Stelios等發(fā)表的最新研究結(jié)果證明，頭發(fā)毛囊中含有大量的干細胞，是最容易獲得的干細胞來源之一，并已成功將毛囊干細胞分化發(fā)育生成新的脈管系統(tǒng)。血管內(nèi)皮細胞生長因子165 (VEGF165)是血管內(nèi)皮細胞生長因子5種亞型之一，其活性最強，分布范圍最廣，是VEGF體內(nèi)發(fā)揮作用的主要亞型。近年來圍繞VEGF165為中心的血管再生性基因治療研究成為國內(nèi)外研究熱點。
[0007]為此 申請人:申請了一種VEGF165基因修飾毛囊干細胞的方法，該方法以毛囊干細胞為種子細胞，具有體外培養(yǎng)時能快速大量擴增，來源非常豐富，減小免疫排斥反應(yīng)；同時利用VEGF165基因轉(zhuǎn)染修飾毛囊干細胞，能夠形成具有擴張和收縮功能的新的工程血管系統(tǒng)，將很好的解決移植人工皮膚容易壞死，成活率低的問題。但是如何檢測毛囊干細胞中VEGF165mRNA表達是一個難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為了解決上述的問題，本發(fā)明的目的是提供一種反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測轉(zhuǎn)染后毛囊干細胞中VEGF165mRNA表達的方法。
[0009]為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
[0010]反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測轉(zhuǎn)染后毛囊干細胞中VEGF165mRNA表達的方法，該方法包括以下的步驟:
[0011]I)提取總RNA:將接種了毛囊干細胞的六孔培養(yǎng)板置于冰上，吸去培養(yǎng)液；每孔加預(yù)冷的Trizol試劑1ml，反復(fù)吹打裂解充分后移入EP管中；加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩混勻后放置2-3min ；12000g , 4°C離心15min ;將上清液移入另一 EP管中，約0.5ml，加等體積異丙醇，顛倒混勻，靜置lOmin, 12000g，4°C離心lOmin，棄上清；用0.5ml DEPC處理的75%酒精Iml洗滌沉淀，7500g，4°C離心5min ;傾去酒精，倒置EP管，干燥至酒精揮發(fā)；加適量的DEPC處理的水_70°C冷凍備用；
[0012]2)毛囊干細胞RNA的逆轉(zhuǎn)錄體系
[0013]
【權(quán)利要求】
1.反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測轉(zhuǎn)染后毛囊干細胞中VEGF165mRNA表達的方法，其特征在于該方法包括以下的步驟: . 1)提取總RNA:將接種了毛囊干細胞的六孔培養(yǎng)板置于冰上，吸去培養(yǎng)液；每孔加預(yù)冷的Trizol試劑1ml，反復(fù)吹打裂解充分后移入EP管中；加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩混勻后放置2-3min ；12000g, 4°C離心15min ;將上清液移入另一 EP管中，約0.5ml，加等體積異丙醇，顛倒混勻，靜置10min，12000g，4°C離心lOmin，棄上清；用0.5ml DEPC處理的75%酒精Iml洗滌沉淀，7500g, 4°C離心5min ;傾去酒精，倒置EP管，干燥至酒精揮發(fā)；加適量的DEPC處理的水_70°C冷凍備用； .2)毛囊干細胞RNA的逆轉(zhuǎn)錄體系
【文檔編號】C12Q1/68GK103468793SQ201310290237
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月10日
【發(fā)明者】全仁夫, 黃忠名, 鄭宣, 許世超 申請人:杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院