新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)及其應(yīng)用，該系統(tǒng)包含：轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括所述受控于真核啟動子的新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的全基因組cDNA序列；三個受控于真核啟動子的轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒，該輔助質(zhì)粒分別包括編碼所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列以及編碼所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列。利用本發(fā)明建立的反向遺傳操作系統(tǒng)，成功救獲了野生型重組新城疫病毒，為進(jìn)一步開展以該新城疫病毒為載體的疫苗研制、腫瘤溶瘤治療病毒以及NDV病毒相關(guān)的基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng) 及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及病毒遺傳操作領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種新城疫病毒Mukteswar 中等毒力疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] Angela Romer-Oberdo rfer 等與 ΒΕΝ Ρ· H. PEETERS 等于 1999 年分別首次 發(fā) 表文章 《Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA》（Journal of General Virology (1999),80,2987 - 2995)和《Rescue of Newcastle Disease Virus from Cloned cDNA:Evidence that Cleavability of the Fusion Protein Is a Major Determinant for Virulence》 （JOURNAL OF VIROLOGY, Junel999, p. 5001 - 5009)，公開了一種利用T7啟動子控制轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，來拯救新 城疫病毒弱毒株，之后又有一些人陸續(xù)拯救了不同毒株的新城疫病毒，所有這些新城疫病 毒的拯救系統(tǒng)均是受控于T7啟動子，該類新城疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)均是利用表達(dá) T7RNA聚合酶的特殊細(xì)胞系，并需要表達(dá)T7RNA聚合酶的重組痘病毒額外提供T7RNA聚合 酶來有效拯救重組新城疫病毒。在這一類系統(tǒng)中，新城疫病毒的全基因組cDNA克隆于T7 啟動子之下，其拯救病毒所需的必需蛋白NP、P和L的基因也多構(gòu)建于受T7啟動子控制的 質(zhì)粒上。在拯救病毒的過程中，首先需要用表達(dá)T7RNA聚合酶的重組痘病毒感染可以表達(dá) T7RNA聚合酶的細(xì)胞系（如BHK-T7)，之后再將輔助質(zhì)粒與全基因組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系， 依靠細(xì)胞內(nèi)生成的T7RNA聚合酶來轉(zhuǎn)錄出新城疫病毒的基因組RNA，并與輔助質(zhì)粒表達(dá)的 NP、P和L裝配成核衣殼，最后以出芽方式生成重組新城疫病毒。該種反向遺傳操作系統(tǒng)存 在的問題是需要制備穩(wěn)定表達(dá)T7RNA聚合酶的細(xì)胞系，制備細(xì)胞系的過程復(fù)雜，技術(shù)要求 高，周期長，并且細(xì)胞系的培養(yǎng)過程中需要不斷添加維持壓力的抗生素以保持其穩(wěn)定表達(dá) T7RNA聚合酶，但是隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，其表達(dá)T7RNA聚合酶的能力會不斷降低，直 至消失；另外在轉(zhuǎn)染過程中感染的表達(dá)T7RNA聚合酶的重組痘病毒會一直存在于細(xì)胞中， 不但在拯救重組新城疫病毒過程中需要添加阿拉伯糖苷以抑制此痘病毒的復(fù)制，而且在拯 救出重組病毒后還需要通過過濾或多次稀釋傳代的方式去除痘病毒，這不僅會降低新城疫 病毒的拯救效率，還存在有痘病毒污染的風(fēng)險，在這種方法的研究中，如果不過濾轉(zhuǎn)染的細(xì) 胞培養(yǎng)物，新城疫病毒的拯救效率較高，但是去除痘病毒很復(fù)雜，如果過濾轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng) 物，則新城疫病毒的拯救效率很低，甚至失敗。
[0003] 為了更有效利用新城疫病毒這一良好載體，針對以上所述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點，我 們建立的新城疫病毒中等毒力Mukteswar疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)完全拋棄了原來使用 的T7啟動子控制下的T7RNA聚合酶系統(tǒng)，而是利用所有培養(yǎng)細(xì)胞系具有的真核細(xì)胞啟動 子，而且輔助質(zhì)粒的表達(dá)也是受控于真核啟動子，這一系統(tǒng)可以在多種細(xì)胞系上完成拯救 病毒的過程，效率不受影響（如Vero、BHK21、DFEI等細(xì)胞系），我們的拯救系統(tǒng)使用的細(xì)胞 系是廣泛用于疫苗生產(chǎn)的Vero細(xì)胞，這對于今后開發(fā)本毒株為載體的疫苗奠定了安全基 礎(chǔ)。目前國內(nèi)研究者已經(jīng)拯救出新城疫LaSota弱毒疫苗株（葛金英等，Newcastle Disease Virus-Based Live Attenuated Vaccine Completely Protects Chickens and Mice from Lethal Challenge of Homologous and Heterologous H5N1Avian Influenza Viruses)以 及新城疫病毒強(qiáng)毒株，這些反向遺傳操作系統(tǒng)也均是建立在T7啟動子控制下的，但是弱毒 株由于毒力低下，利用效果有限，而強(qiáng)毒株存在生物安全問題。目前還沒有別人拯救出新城 疫病毒Mukteswar株，這株病毒是新城疫病毒中等毒力株，該毒株反向遺傳操作系統(tǒng)的建 立，將為研究新城疫病毒低毒力株與高毒力株之間的遺傳演變提供有力工具，也為開發(fā)以 此毒株為載體的疫苗奠定了基礎(chǔ)。
[0004] 本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中必須由特定細(xì)胞系和重組痘病毒提供T7RNA聚合酶的 缺點，提供了一種可以使用多種細(xì)胞系來拯救重組新城疫病毒的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供一種新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的反向遺 傳操作系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含：
[0006] (1)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括受控于真核啟動子的新城疫病毒Mukteswar中等 毒力疫苗株的全基因組cDNA序列；
[0007] (2)三個轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒，該輔助質(zhì)粒分別包括編碼所述新城疫病毒Mukteswar中 等毒力疫苗株的核蛋白（NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗 株的磷酸蛋白（P)的cDNA序列以及編碼所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的大 聚合酶蛋白（L)的cDNA序列，三個輔助質(zhì)粒均受控于真核啟動子。
[0008] 在本發(fā)明所述的反向遺傳操作系統(tǒng)中，優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒還包括包括編碼具 有自我剪切功能的核酸酶的序列、編碼丁肝核酶（Rbz)的序列以及位于全基因組cDNA序列 內(nèi)部的遺傳標(biāo)簽，所述全基因組cDNA序列位于真核啟動子和編碼具有自我剪切功能的核 酸酶的序列之后，編碼丁肝核酶（Rbz)的序列之前，共同構(gòu)成轉(zhuǎn)錄模板。
[0009] 在本發(fā)明所述的反向遺傳操作系統(tǒng)中，優(yōu)選的，其中所述具有自我剪切功能的核 酸酶是拳頭狀核酶（HamRz)，所述的遺傳標(biāo)簽是位于全基因組cDNA序列內(nèi)部的Notl酶切位 點以及Bgl II酶切位點，所述的真核啟動子為CMV啟動子。
[0010] 在本發(fā)明所述的反向遺傳操作系統(tǒng)中，優(yōu)選的，所述的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示，命名為 pCI-NDV。 toon] 在本發(fā)明所述的反向遺傳操作系統(tǒng)中，優(yōu)選的，所述三個轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒是通過將 編碼所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的核蛋白（NP)的cDNA序列、編碼所述新 城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的磷酸蛋白（P)的cDNA序列以及編碼所述新城疫病 毒Mukteswar中等毒力疫苗株的大聚合酶蛋白（L)的cDNA序列分別克隆入載體pCI中得 到的。
[0012] 在本發(fā)明所述的反向遺傳操作系統(tǒng)中，優(yōu)選的，編碼所述新城疫病毒Mukteswar 中等毒力疫苗株的核蛋白（NP)的cDNA序列如SEQ ID Ν0· 2所示，編碼所述新城疫病毒 Mukteswar中等毒力疫苗株的磷酸蛋白（P)的cDNA序列如SEQ ID N0. 3所示，編碼所述新城 疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的大聚合酶蛋白（L)的cDNA序列如SEQ ID N0. 4所示， 其中，編碼核蛋白（NP)的cDNA序列與編碼磷酸蛋白（P)的cDNA序列分別利用Nhel和Xbal 酶切位點構(gòu)建于PCI載體上，編碼大聚合酶蛋白（L)的cDNA序列是利用Nhel和Notl酶切 位點構(gòu)建于PCI載體上，獲得的三個轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒分別命名為pCI-NP，pCI-P以及pCI-L。
[0013] 在本發(fā)明所述的反向遺傳操作系統(tǒng)中，優(yōu)選的，還包含用于病毒拯救的宿主細(xì)胞， 所述宿主細(xì)胞是Vero細(xì)胞，BHK21細(xì)胞或DFEI細(xì)胞，更優(yōu)選為Vero細(xì)胞。
[0014] 本發(fā)明的另一個目的是提供了一種利用以上任一項所述的反向遺傳操作系統(tǒng)拯 救重組新城疫病毒的方法，包括以下步驟：
[0015] (1)使用以上任一項所述的反向遺傳操作系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn) 染用于病毒拯救的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞；
[0016] (2)從轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液中拯救重組新城疫病毒。
[0017] 在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pCI-NDV與輔助質(zhì)粒pCI-NP，pCI-P以 及pCI-L按照質(zhì)量比為4:2:2:1的比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
[0018] 本發(fā)明的再一個目的是提供所述的反向遺傳操作系統(tǒng)在拯救重組新城疫病毒 Mukteswar株中的應(yīng)用。及所述的反向遺傳操作系統(tǒng)在制備以新城疫病毒株為骨架的活載 體疫苗中的應(yīng)用。
[0019] 相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果是：
[0020] 本發(fā)明中新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)的建立，完全 拋棄了現(xiàn)有技術(shù)所使用T7RNA聚合酶系統(tǒng)，沒有繁瑣的細(xì)胞系制備以及維持過程，也不需 要制備表達(dá)T7RNA聚合酶的重組痘病毒的復(fù)雜技術(shù)，因此在重組病毒的拯救過程中不需要 使用重組痘病毒，也就沒有抑制痘病毒過度復(fù)制和病毒拯救后清除痘病毒的繁瑣過程。本 發(fā)明可以利用所有的培養(yǎng)細(xì)胞系來拯救重組新城疫病毒，這為今后建立并拯救該類副粘病 毒奠定基礎(chǔ)。在本發(fā)明的重組新城疫病毒拯救系統(tǒng)中，我們使用的細(xì)胞系優(yōu)選為在疫苗生 產(chǎn)領(lǐng)域廣為應(yīng)用的Vero細(xì)胞系，該細(xì)胞系是目前公認(rèn)的疫苗生產(chǎn)的安全細(xì)胞系，這為今后 開發(fā)以這株新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株株為載體的疫苗奠定安全基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為新城疫病毒Mukteswar株全基因組cDNA的構(gòu)建示意圖；
[0022] 全基因組分為4段進(jìn)行克隆，并在全基因組cDNA克隆中加入遺傳標(biāo)簽，分別是位 于基因組4953的Notl酶切位點和位于8597的Bgl II酶切位點，基因組頭部是拳頭狀核 酶（HamRz)，在核酶前是與pCI載體連接的酶切位點-Nhel，第一段與第二段之間通過酶切 位點SacII連接，第二段與第三段之間通過酶切位點Mlul連接，第三段與第四段之間通過 酶切位點Mlul連接，第四段尾部是丁肝核酶（Rbz)，NotI是全基因組cDNA克隆與pCI載體 連接的酶切位點；
[0023] 圖2為新城疫病毒Mukteswar株反向遺傳操作系統(tǒng)的質(zhì)粒構(gòu)成示意圖；
[0024] 三個輔助質(zhì)粒均構(gòu)建于pCI載體上，受CMV啟動子控制；
[0025] 圖3為新城疫病毒Mukteswar株反向遺傳操作系統(tǒng)轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，拯救出重組病 毒的不意圖；
[0026] 代表細(xì)胞的圓圈中的多個小圓圈分別表示輔助質(zhì)粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L表達(dá) 的三種蛋白，圖中右下角的三個帶有多個突起的圓圈表示拯救出的重組病毒；
[0027] 圖4為轉(zhuǎn)染上清接種細(xì)胞后，拯救出的重組新城疫病毒Mukteswar株感染細(xì)胞形 成合胞體的顯微鏡下圖片，以及正常細(xì)胞的圖片；
[0028] 圖4A與圖4B是將轉(zhuǎn)染上清接種Vero細(xì)胞40h后在ΙΟΟχ物鏡下觀察的結(jié)果，圖 4C圖是200x物鏡下觀察的結(jié)果，圖中的圓斑是形成的合胞體；圖4D圖是正常Vero細(xì)胞對 昭.
[0029] 圖5為利用本病毒基因組特異性的引物對拯救得到的重組病毒進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié) 果。

【具體實施方式】
[0030] 以下通過實施例并結(jié)合附圖來進(jìn)一步描述本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅 用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的范圍。
[0031] 實施例1新城疫病毒Mukteswar株反向遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建
[0032] 1、材料來源
[0033] 新城疫病毒Mukteswar株購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；質(zhì)粒pCI購自
[0034] PR0MEGA公司，pBluescript II ks(+/_)Phagemids購自上海捷瑞生物技術(shù)有限公 司；DNA聚合酶購自TAKARA公司，T4DNA連接酶及其它限制性內(nèi)切酶均購自NEB公司；病毒 RNA提取試劑盒和中量制備試劑盒購自QIAGEN公司，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒和脂質(zhì)體2000試 劑盒購自IVENTR0GEN公司。
[0035] 2、方法
[0036] 2. 1含有新城疫病毒Mukteswar株全基因組cDNA序列的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的構(gòu)建
[0037] 為建立新城疫病毒Mukteswar株的反向遺傳操作系統(tǒng)，必須首先構(gòu)建相應(yīng)的全基 因組cDNA克隆，在新城疫病毒全基因組cDNA的頭部為具有自我剪切功能的拳頭裝核酶， 之后是病毒的全基因組cDNA，按順序依次核酸蛋白基因（NP)、磷酸蛋白基因（P)、基質(zhì)基因 (M)、融合蛋白基因（F)、血凝素蛋白基因（HA)和大聚合酶蛋白基因（L)，在基因組的尾部連 接有丁肝核酶。在全基因組cDNA的克隆中，我們根據(jù)病毒Mukteswar疫苗株基因序列的酶 切位點將，分為4段完成全基因組cDNA的克隆，并在全基因組cDNA克隆中加入遺傳標(biāo)簽， 分別是位于基因組4953的Notl酶切位點和位于8597的Bgl II酶切位點，整個基因組cDNA 位于PCI載體的Nhel和Notl多克隆位點間（圖1)。具體地，實驗步驟如下：
[0038] 新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株接種9?11日齡SPF雞胚的尿囊腔擴(kuò)增 病毒，接種3天后，收獲尿囊液，封裝置于低溫冰箱保存。利用QIAGEN的病毒RNA提取試 劑盒提取病毒RNA，按照說明書操作，之后利用IVENTR0GEN的M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反 轉(zhuǎn)錄，再利用合成的特異性引物進(jìn)行PCR，膠回收PCR產(chǎn)物并克隆到載體pBluescript II ks(+/_)Phagemids的EcoR V位點處。將新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的全基 因組cDNA序列依據(jù)酶切位點分為4段，各段克隆質(zhì)粒經(jīng)測序證實序列無誤后，按照克隆策 略通過酶切、連接的方式將各段連接在一起克隆到PCI載體上，構(gòu)建得到含有新城疫病毒 Mukteswar株全基因組cDNA序列的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，該質(zhì)粒的完整核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 示,命名為pCI-NDV。
[0039] 2. 2新城疫病毒Mukteswar株中三個轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒的構(gòu)建
[0040] 編碼所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的核蛋白（NP)的cDNA序列如 SEQ ID N0. 2所示，編碼所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的磷酸蛋白（P)的cDNA 序列如SEQ ID NO. 3所示，編碼所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的大聚合酶蛋 白（L)的CDNA序列如SEQIDN0·4所示，其中，編碼核蛋白（NP)的CDNA序列與編碼磷酸 蛋白（P)的cDNA序列分別利用Nhel和Xbal酶切位點構(gòu)建于pCI載體上，編碼大聚合酶蛋 白（L)的cDNA序列是利用Nhel和Notl酶切位點構(gòu)建于pCI載體上，獲得的三個轉(zhuǎn)錄輔助 質(zhì)粒分別命名為pCI-NP，pCI-P以及pCI-L (圖2)。
[0041] 2. 3將上述含有新城疫病毒Mukteswar株全基因組cDNA序列的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和三個輔 助質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞ToplO,之后大體積搖菌，利用QIAGEN的質(zhì)粒中量制備試劑盒 制備轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒，并測定各質(zhì)粒的濃度。
[0042] 實施例2利用實施例1構(gòu)建得到的反向遺傳操作系統(tǒng)進(jìn)行重組病毒的拯救
[0043] 1、方法：
[0044] 將Vreo細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞單層長至60 %?80 %左右時開始 轉(zhuǎn)染。用無血清DMEM培養(yǎng)基，洗滌細(xì)胞2遍，之后加入0pti-MEM，2ml/孔；轉(zhuǎn)染試劑為 Invitrogen公司的脂質(zhì)體2000試劑盒，轉(zhuǎn)染按照試劑盒說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pCI-NDV與 輔助質(zhì)粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L按照質(zhì)量比為4:2:2:1的比例，以每孔4ug的量進(jìn)行轉(zhuǎn)染， 轉(zhuǎn)染6h?8h后，棄掉轉(zhuǎn)染上清，加入含5% FBS的DMEM，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞基本全部死亡時，吸取 上清接種新的培養(yǎng)瓶內(nèi)的Vero細(xì)胞，之后逐日觀察細(xì)胞病變，當(dāng)有顯著的合胞體生成時， 表明拯救出重組病毒（圖3)，之后可以接種拯救出的重組病毒于Vero細(xì)胞以擴(kuò)增病毒，并 用1%的雞紅血球檢測血凝價。
[0045] 2、結(jié)果
[0046] 為了鑒定獲救的病毒，將轉(zhuǎn)染過程中的上清液接種培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)的Vero細(xì)胞，以 擴(kuò)增病毒，野生型毒株產(chǎn)生顯著的細(xì)胞病變，即有合胞體生成，可以進(jìn)行血凝或RT-PCR試 驗以檢測重組病毒。顯微鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)：拯救出的重組新城疫病毒Mukteswar株感染 Vero細(xì)胞均有合胞體產(chǎn)生（圖4A、圖4B和圖4C)，而正常的Vero細(xì)胞沒有合胞體產(chǎn)生（圖 4D)。將救獲的病毒利用Trizol提取總RNA，利用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，之后利用本病毒基 因組特異性的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出特異性目的條帶（圖5)。以上實驗結(jié)果顯示， 通過反向遺傳操作技術(shù)，利用含有新城疫病毒Mukteswar株全基因組cDNA的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和三 個輔助轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的克隆，成功拯救了重組新城疫病毒。
[0047] 本發(fā)明利用新城疫病毒Mukteswar株的反向遺傳操作系統(tǒng)成功地拯救了重組新 城疫病毒，在本發(fā)明的重組新城疫病毒拯救系統(tǒng)中，我們使用的細(xì)胞系是在疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域 廣為應(yīng)用的Vero細(xì)胞系，該細(xì)胞系是目前公認(rèn)的疫苗生產(chǎn)的安全細(xì)胞系，這為今后開發(fā)以 這株新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株株為載體的疫苗奠定安全基礎(chǔ)。
[0048] 以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，對本發(fā)明而言僅是說明性的，而非限制性的； 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進(jìn)行許多改 變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含： (1) 轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒包括受控于真核啟動子的新城疫病毒Mukteswar中等毒力 疫苗株的全基因組cDNA序列； (2) 三個轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒，該輔助質(zhì)粒分別包括編碼所述新城疫病毒Mukteswar中等毒 力疫苗株的核蛋白（NP)的cDNA序列、編碼所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的 磷酸蛋白（P)的cDNA序列以及編碼所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的大聚合 酶蛋白（L)的cDNA序列，三個輔助質(zhì)粒均受控于真核啟動子。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的反向遺傳操作系統(tǒng)，其中所述轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒還包括編碼具有自我 剪切功能的核酸酶的序列、編碼丁肝核酶（Rbz)的序列以及位于全基因組cDNA序列內(nèi)部的 遺傳標(biāo)簽，所述全基因組cDNA序列位于真核啟動子和編碼具有自我剪切功能的核酸酶的 序列之后，編碼丁肝核酶（Rbz)的序列之前，共同構(gòu)成轉(zhuǎn)錄模板。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的反向遺傳操作系統(tǒng)，其中所述具有自我剪切功能的核酸酶是 拳頭狀核酶（HamRz)，所述的遺傳標(biāo)簽是位于全基因組cDNA序列內(nèi)部的Notl酶切位點以及 Bgl II酶切位點，所述的真核啟動子為CMV啟動子。
4. 如權(quán)利要求1-3任一項所述的反向遺傳操作系統(tǒng)，其中所述的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的核苷酸序 列如SEQ ID NO. 1所示，命名為pCI-NDV。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的反向遺傳操作系統(tǒng)，其中所述三個轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒是通過將編 碼所述新城疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的核蛋白（NP)的cDNA序列、編碼所述新城 疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的磷酸蛋白（P)的cDNA序列以及編碼所述新城疫病毒 Mukteswar中等毒力疫苗株的大聚合酶蛋白（L)的cDNA序列分別克隆入載體pCI中得到 的。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的反向遺傳操作系統(tǒng)，其中編碼所述新城疫病毒Mukteswar 中等毒力疫苗株的核蛋白（NP)的cDNA序列如SEQ ID NO. 2所示，編碼所述新城疫病毒 Mukteswar中等毒力疫苗株的磷酸蛋白（P)的cDNA序列如SEQ ID NO. 3所示，編碼所述新城 疫病毒Mukteswar中等毒力疫苗株的大聚合酶蛋白（L)的cDNA序列如SEQ ID NO. 4所示， 其中，編碼核蛋白（NP)的cDNA序列與編碼磷酸蛋白（P)的cDNA序列分別利用Nhel和Xbal 酶切位點構(gòu)建于PCI載體上，編碼大聚合酶蛋白（L)的cDNA序列是利用Nhel和Notl酶切 位點構(gòu)建于PCI載體上，獲得的三個轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒分別命名為pCI-NP，pCI-P以及pCI-L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項的反向遺傳操作系統(tǒng)，其中還包含用于病毒拯救的宿 主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞是Vero細(xì)胞，BHK21細(xì)胞或DFEI細(xì)胞，優(yōu)選為Vero細(xì)胞。
8. -種利用權(quán)利要求1-7任一項所述的反向遺傳操作系統(tǒng)拯救重組新城疫病毒的方 法，包括以下步驟： (1) 使用權(quán)利要求1-7任一項所述的反向遺傳操作系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒 共轉(zhuǎn)染用于病毒拯救的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞，優(yōu)選的，轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒PCI-NDV與輔 助質(zhì)粒口(：1-即，？(：1-?以及？(：1-1^按照質(zhì)量比為4 :2:2:1的比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染； (2) 從轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液中拯救重組新城疫病毒。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的反向遺傳操作系統(tǒng)在拯救重組新城疫病毒 Mukteswar株中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的反向遺傳操作系統(tǒng)在制備以新城疫病毒株為骨架 的活載體疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N7/01GK104195154SQ201410373399
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】王永 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)