一種酶活提高的谷氨酸脫羧酶突變體構(gòu)建及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種酶活提高的谷氨酸脫簇酶突變體構(gòu)建及其應(yīng)用，屬于基因工程技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]谷氨酸脫簇酶（glutamatedecarbo巧lase，GAD，EC4. 1. 1. 15)是生物合成 丫-氨 基下酸（GABA)的限速酶，催化谷氨酸脫簇形成C〇2和GABA。谷氨酸脫簇酶廣泛存在于微生 物，動物，人體，W及植物中。異源表達(dá)谷氨酸脫簇酶突出的問題是，蛋白表達(dá)量低、谷氨酸 脫簇酶活力低。因此，定點突變改造谷氨酸脫簇酶，提高胞外酶活，對于提高谷氨酸脫簇酶 工業(yè)化應(yīng)用前景具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明首先提供了一種酶活提高的谷氨酸脫簇酶突變體，其氨基酸序列是SEQID NO. 1所示的序列。
[0004] 編碼所述突變體的核巧酸序列是SEQIDNO. 2所示的序列。
[0005]本發(fā)明還提供了表達(dá)所述谷氨酸脫簇酶突變體的大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌基因 工程菌。
[0006] 所述大腸桿菌基因工程菌的制備方法，是WSEQIDNO. 2所示核巧酸序列為模板， Flprimer(序列如沈QIDNO. 3所示），Rlp;rime;r(序列如沈QIDNO. 4所示）為引物，進(jìn) 行PCR即得到SEQID^.2所示的重組基因，將重組基因連接到表達(dá)載體祀1'-28曰得到重 組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主菌中即得到大腸桿菌基因工程菌。
[0007] 所述谷氨酸棒桿菌基因工程菌的制備方法，是WSEQIDNO. 2所示核巧酸序列為 模板，F(xiàn)lprimer(序列如沈QIDNO. 3所示），Rlprimer(序列如沈QIDNO. 4所示）為引 物，進(jìn)行PCR即得到SEQIDNO. 2所示的重組基因，將重組基因連接到表達(dá)載體PXMJ9得到 重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到谷氨酸棒桿菌宿主菌中即得到谷氨酸棒桿菌基因工程菌。
[0008] 本發(fā)明在天然谷氨酸脫簇酶的基礎(chǔ)上，通過定點突變生物技術(shù)改造谷氨酸脫簇酶 分子結(jié)構(gòu)，突變體酶的純酶液比酶活較突變前提高81 %。突變體酶Y172C的底物親和力Km 較突變前降低53%，在35°C下酶的半衰期由1化延長至2地。本發(fā)明表明172位氨基酸殘 基對酶的催化作用和熱穩(wěn)定性有較大影響，對該酶的催化機(jī)理的研究提供了一定的基礎(chǔ)， 并提高了該酶的工業(yè)應(yīng)用潛力。本發(fā)明所得可用于生物合成丫-氨基下酸。
【具體實施方式】
[0009] 實施例1含谷氨酸脫簇酶突變體的重組載體的構(gòu)建
[0010] (1)Y172C突變體的獲得：WSEQIDNO. 2所示核巧酸序列為模板，巧rimer(序列 如SEQIDNO. 3所示）、化rimer(序列如SEQIDNO. 4所示）為引物，進(jìn)行PCR即得到SEQ IDNO. 2所示的重組基因。
[0011] (2)將重組基因與祀T-28a分別用BamHI、EcoRI雙酶切，純化后用Τ4DM連接酶 16°C過夜連接。連接產(chǎn)物化學(xué)法轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化液涂布含卡那霉素巧Omg/L)LB平板，提取質(zhì)粒，雙酶切驗證構(gòu)建的重組質(zhì)粒，命名為祀T-28a-Y172C。測序工作由上海 生工完成。
[001引 （3)將重組基因與PXMJ19分別用BamHI、EcoRI雙酶切，純化后用T4DNA連接酶 16°C過夜連接。連接產(chǎn)物化學(xué)法轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化液涂布含卡那霉素巧Omg/L) LB平板，提取質(zhì)粒，雙酶切驗證構(gòu)建的重組質(zhì)粒，命名為PXMJ19-Y172C。測序工作由上海生 工完成。
[0013] 實施例2產(chǎn)谷氨酸脫簇酶大腸桿菌工程菌構(gòu)建
[0014] 將實施例1得到的重組質(zhì)粒祀T-28a-Y172C化學(xué)法轉(zhuǎn)化入E.coli化21感受態(tài)細(xì) 胞，具體方法如下：
[001引 （1)轉(zhuǎn)化實驗所需培養(yǎng)基如下（g/L):
[001引LB培養(yǎng)基：蛋白腺10,酵母粉5,化C1 10。
[0017] 0)轉(zhuǎn)化方法：
[0018] 將ΙΟμΙ重組質(zhì)粒祀T-28a-Y172C加入到120μ1感受態(tài)E.coil化21中，于冰上 放置45min，42°C熱擊90s，放置冰上2min，加入800μ1LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)比，離 屯、，倒掉大部分上清液，留150μL與沉淀混勻，涂布到卡那霉素平板（Km+LB)上，于37°C培 養(yǎng)箱培養(yǎng)化左右，挑去平板上的陽性菌落到10ml液體LB培養(yǎng)基中，37Γ搖床過夜培養(yǎng)。 提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗證連接成功后，將重組菌祀T-28a-Y172C/E.coliBL21加入終濃度17% (w/v)的甘油，-20°C冰箱保藏。
[0019] 實施例3產(chǎn)谷氨酸脫簇酶谷氨酸棒桿菌工程菌構(gòu)建
[0020] 將實施例1得到的重組質(zhì)粒PXMJ19-Y172C點擊法轉(zhuǎn)化入C.glutami州ml3032感 受態(tài)細(xì)胞，具體方法如下：
[00川 （1)轉(zhuǎn)化實驗所需培養(yǎng)基如下（g/L):
[0022]LBG培養(yǎng)基：蛋白腺10,酵母粉5,化C1 10,葡萄糖5。
[002引 似轉(zhuǎn)化方法：
[0024]將 10μL重組質(zhì)粒PXMJ19-Y172C加入到 120μ1 感受態(tài)C.glutamicuml3032 中，于 冰上放置5min，1800V電擊5ms，放置冰上2min，加入800μ1LBG液體培養(yǎng)基，37°C搖床培 養(yǎng)化，離屯、，倒掉大部分上清液，留150μL與沉淀混勻，涂布到卡那霉素平板（Km+LBG)上， 于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)2化左右，挑去平板上的陽性菌落到10ml液體LBG培養(yǎng)基中，37°C搖床 過夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗證連接成功后，將重組菌PXMJ19-Y172C/C.glutamicuml3032 加入終濃度17% (w/v)的甘油，-20°C冰箱保藏。
[00巧]實施例4重組菌祀T-28a-Y172C/E.coliBL21谷氨酸脫簇酶高效表達(dá)及酶活測定。
[0026] (1)將實施例2構(gòu)建的重組菌祀T-28a-Y172C/E.coliBL21與表達(dá)未突變的酶的 對照菌株祀T-28a-gad/E.coli化21分別接種于10血含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩 培養(yǎng)過夜，次日按4%的接種量轉(zhuǎn)接于大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，37Γ培養(yǎng)12h，取發(fā)酵液于 4°C、lOOOOr/min離屯、lOmin，上清為胞外粗酶液，細(xì)胞破碎上清液為胞內(nèi)粗酶液，用于酶活 力的測定。
[0027] (2)大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白腺lOg/l，酵母粉5g/l，化C1lOg/l，葡萄糖20g/L。 調(diào)節(jié)抑6. 8-7. 0。
[0028] (3)酶活定義：酶活力單位扣）定義為在測定條件下每分鐘產(chǎn)生1μmolGABA所 需的酶量。
[0029] (4)谷氨酸脫簇酶酶活測定方法：谷氨酸脫簇酶（GAD)檢測方法采用比色法，取 200μL底物溶液（0. 2mol/L，抑4.8醋酸-醋酸鋼緩沖液含k谷氨酸鋼0. 4mol/L)和 100μL粗酶液37°C反應(yīng)一定時間后加入200μL棚酸緩沖液（0. 2mol/l，pH9. 0)終止反 應(yīng)，再依次加入6%苯酪1. 0血、次氯酸鋼溶液400μL，混勻后沸水浴lOmin，立即冰浴冷卻 20min至顯色，測定光吸收值A(chǔ)ew。
[0030] (4)結(jié)果表明重組菌祀T-28a-Y17