專利名稱：Angptl4缺失突變體及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及腫瘤相關(guān)新基因，尤其涉及ANGPTL4缺失突變體及其應用。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組計劃的完成和科學技術(shù)的不斷進步，以對基因(尤其是致病基因)功能研究為主要內(nèi)容的“后基因組時代”已經(jīng)來臨。
盡管國內(nèi)外相繼克隆了與各種功能相關(guān)的基因、并對其初步生物學功能和作用機制進行了研究，本實驗室進行的以細胞生長為基礎的大規(guī)模功能篩選就發(fā)現(xiàn)并克隆了372個新基因[Wan等，PNAS(2004)101(44)15724-15729]。
ANGPTL4基因(最初該基因被李錦軍的實驗室命名為pp1158)[朱洪新等，中華腫瘤雜志(2002)24(2)123-125]就是利用此功能篩選技術(shù)平臺從人胎盤cDNA文庫中克隆到的新基因，該基因cDNA全長為1943bp，開放閱讀框含1218bp，編碼406個氨基酸，預計分子量為45.2kDa。N端有一疏水信號肽和卷曲(Coiled-Coil)結(jié)構(gòu)域，C端有一纖維蛋白原樣(Fibrinogen-like)結(jié)構(gòu)域。并于2000年首先將該基因(原基因名為pp1158)的cDNA序列在GenBank上登錄(登錄號為AF202636)?，F(xiàn)已同Yoon等克隆的PGAR[Mol.Cell.Biol.，Jul 2000；205343-5349]和Kim等克隆的HFARP[Biochem.J，2000，346603-610]由HUGO統(tǒng)一正式命名為ANGPTL4(angiopoietin-like 4)。
Kim等對該基因的研究結(jié)果表明ANGPTL4能夠抑制內(nèi)皮細胞HUVEC的凋亡，但對內(nèi)皮細胞HUVEC的出芽(sprouting)沒有影響。Yoon等的研究結(jié)果表明ANGPTL4能夠調(diào)節(jié)脂代謝。
目前，對全長的基因序列及其功能的研究比較普遍，然而人們并不知道或了解其缺失體或片斷。ANGPTL4就是這樣的基因。
基于許多生理反應和疾病與基因缺失體有關(guān)，因此，本領域迫切需要確定各種基因缺失體的結(jié)構(gòu)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供了一種確定結(jié)構(gòu)域的ANGPTL4缺失突變體。本發(fā)明的另一目的是基于上述缺失突變體，提供其應用。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種ANGPTL4的缺失突變體，它具有體外抑制癌細胞生長的功能，并且所述的缺失突變體選自下組(a)缺失了SEQ ID NO2中第192-406位氨基酸序列的ANGPTL4的缺失突變體；(b)缺失了SEQ ID NO2中第1-65位氨基酸序列的ANGPTL4的缺失突變體；(c)缺失了SEQ ID NO2中第1-182位氨基酸序列的ANGPTL4的缺失突變體。
在一優(yōu)選例中所述的突變體氨基酸序列選自SEQ ID NO3、4或5。
在另一優(yōu)選例中所述的突變體完全缺失了C端纖連蛋白Fibronectin功能域或卷曲功能域。
在本發(fā)明的另一方面，提供了ANGPTL4的缺失突變體在制備抑制肝癌細胞生長的藥物中的應用。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼下組缺失體的多核苷酸(i)缺失了SEQ ID NO2中第192-406位氨基酸序列的ANGPTL4的缺失突變體；(ii)缺失了SEQ ID NO2中第1-65位氨基酸序列的ANGPTL4的缺失突變體；(iii)缺失了SEQ ID NO2中第1-182位氨基酸序列的ANGPTL4的缺失突變體。
(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
其中所述的多核苷酸編碼具有SEQ ID NO3、4或5所示氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有權(quán)上述的多核苷酸。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有上述的載體。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種多肽的制備方法，它包含
(a)在適合表達的條件下，培養(yǎng)上述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出ANGPTL4的缺失突變體。
在本發(fā)明的另一方面，提供了所述的ANGPTL4的缺失突變體的用途，它包括用于(a)制備促進腫瘤血管新生的組合物；或(b)制備調(diào)節(jié)腫瘤細胞遷移能力的組合物。
本發(fā)明確定了ANGPTL4的缺失突變體的結(jié)構(gòu)域，并將其用于制備抑癌組合物、促進腫瘤血管新生的組合物或制備調(diào)節(jié)腫瘤細胞遷移能力的組合物，顯示其廣闊的使用價值。


圖1A顯示了基因ANGPTL4染色體定位及功能域。
圖1B顯示了構(gòu)建基因ANGPTL4的缺失突變體。
圖2顯示了基因ANGPTL4及基因ANGPTL4的缺失突變體在轉(zhuǎn)染的SMMC7721細胞中的定位。
圖3顯示了基因ANGPTL4及基因ANGPTL4的缺失突變體Western blot檢測結(jié)果。其中，各泳道如下1空載體；2ANGPTL4-全長；3ANGPTL4-Δ1；4ANGPTL4-Δ2；5ANGPTL4-Δ3。
圖4顯示了基因ANGPTL4及基因ANGPTL4的缺失突變體生長曲線的測定結(jié)果。
圖5顯示了基因ANGPTL4及基因ANGPTL4的缺失突變體轉(zhuǎn)染SMMC7721細胞遷移24小時測定結(jié)果。
圖6顯示了基因ANGPTL4及基因ANGPTL4的缺失突變體轉(zhuǎn)染SMMC7721細胞侵襲24小時測定結(jié)果。
圖7顯示了基因ANGPTL4及基因ANGPTL4的缺失突變體轉(zhuǎn)染SMMC7721細胞管狀形成24小時測定結(jié)果。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，構(gòu)建了基因ANGPTL4的多個特異性缺失突變體，發(fā)現(xiàn)它們能抑制肝癌細胞體外生長，有的能使肝癌細胞的遷移、侵潤和管狀結(jié)構(gòu)形成能力降低，有的能促進腫瘤血管新生(包括細胞的遷移、侵潤和管狀結(jié)構(gòu)形成能力升高)，從而可以將它們用于制備抑制肝癌的藥物。
在本發(fā)明中，術(shù)語“ANGPTL4蛋白”、“ANGPTL4多肽”或“血管生成素樣蛋白ANGPTL4”可互換使用，都指具有人血管生成素樣蛋白ANGPTL4氨基酸序列AAG22490(gi10732648)(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的血管生成素樣蛋白ANGPTL4。
在本發(fā)明中，術(shù)語“ANGPTL4基因”、“ANGPTL4多核苷酸”或“血管生成素樣蛋白基因ANGPTL4”可互換使用，都指具有人ANGPTL4核苷酸序列(AF202636或SEQID NO1)的核酸序列。
在本發(fā)明中，術(shù)語“本發(fā)明的多肽”指ANGPTL4蛋白的缺失體。
在優(yōu)選例中，構(gòu)建了ANGPTL4的缺失突變體ANGPTL4-Δ1(ANGPTL4-deltal或pp1158-deltal)，該缺失體是缺失了第192-406位氨基酸序列，屬于編碼C端纖連蛋白Fibronectin功能域的缺失突變體。
在優(yōu)選例中，構(gòu)建了ANGPTL4的缺失突變體ANGPTL4-Δ2(ANGPTL4-delta2或pp1158-delta2)。該缺失體是缺失了1-65氨基酸序列，屬于缺失N端一疏水信號肽的缺失突變體。
在優(yōu)選例中，構(gòu)建了ANGPTL4的缺失突變體，ANGPTL4-Δ3(ANGPTL4-delta3或pp1158-delta3)，該缺失體是缺失了編碼1-182氨基酸序列，屬于缺失N端信號肽和卷曲(Coiled-Coil)功能域的缺失突變體。
本發(fā)明提供的ANGPTL4缺失突變體對肝癌細胞的體外生長具有抑制作用。
本發(fā)明提供的ANGPTL4缺失突變體ANGPTL4-Δ1和ANGPTL4-Δ2的過表達產(chǎn)物主要定位于胞核，且呈點狀分布。
本發(fā)明提供的ANGPTL4缺失突變體ANGPTL4-Δ3的過表達產(chǎn)物主要定位于核，呈均勻分布。
本發(fā)明提供的ANGPTL4缺失突變體ANGPTL4-Δ1能使肝癌細胞遷移能力下降。
本發(fā)明提供的ANGPTL4缺失突變體ANGPTL4-Δ2能促使腫瘤血管新生。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
本發(fā)明還包括人ANGPTL4蛋白缺失體的的衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然人ANGPTL4蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導，這些衍生物和類似物屬于本領域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，還包括具有與人ANGPTL4蛋白缺失體相同功能的、SEQ ID NO3、4或5序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人ANGPTL4蛋白的活性片段和活性衍生物。
發(fā)明還提供人ANGPTL4蛋白缺失體的類似物。這些類似物人ANGPTL4缺失體的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，還包括與SEQ ID NO3、4或5的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發(fā)明的人ANGPTL4核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就司以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應用PCR技術(shù)擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。可用常規(guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或ANGPTL4蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的ANGPTL4缺失體多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼人ANGPTL4缺失體多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，人ANGPTL4缺失體多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術(shù)語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee andNathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人ANGPTL4缺失體編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，aLaboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎允蛊淠軌虮磉_蛋白質(zhì)。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的缺失體多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的人ANGPTL4缺失體或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)用表達的重組人ANGPTL4缺失體篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激人ANGPTL4缺失體功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對人ANGPTL4 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里， “特異性”是指抗體能結(jié)合于人ANGPTL4基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人ANGPTL4基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人ANGPTL4缺失體的分子，也包括那些并不影響人ANGPTL4缺失體功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人ANGPTL4基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈FV分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。例如，純化的人ANGPTL4基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達人ANGPTL4缺失體或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人ANGPTL4缺失體功能的抗體以及不影響人ANGPTL4缺失體功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人ANGPTL4基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人ANGPTL4基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
抗人ANGPTL4缺失體的抗體可用于免疫組織化學技術(shù)中，檢測活檢標本中的人ANGPTL4缺失體。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預防與人ANGPTL4缺失體相關(guān)的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷人ANGPTL4缺失體的產(chǎn)生或活性。
抗體也可用于設計成針對體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如人ANGPTL4缺失體高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人ANGPTL4缺失體陽性的細胞。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用人ANGPTL4缺失體或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與ANGPTL4缺失體發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明ANGPTL4缺失體，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供所需的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療，例如，用于抑制腫瘤細胞生長方面的治療。在使用本發(fā)明ANGPTL4缺失體時，還可同時使用其他治療劑，如順鉑、5-FU等。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明ANGPTL4缺失體多肽或其激動劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的ANGPTL4缺失體、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于確定了ANGPTL4的缺失突變體的結(jié)構(gòu)域，并可將其用于制備抑癌組合物、促進腫瘤血管新生的組合物或制備調(diào)節(jié)腫瘤細胞遷移能力的組合物。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1ANGPTL4缺失突變體的構(gòu)建對ANGPTL4的生物信息學分析結(jié)果顯示，ANGPTL4基因定位于染色體19p13.3，含有7個外顯子和6個內(nèi)含子；該基因cDNA全長為1943bp，開放閱讀框含1218bp，編碼406個氨基酸，預計分子量為45.2kDa。N端有一疏水信號肽和卷曲(Coiled-Coil)結(jié)構(gòu)域，C端有一纖維蛋白原樣(Fibrinogen-like)結(jié)構(gòu)域(圖lA)。
本實施例中，用哺乳動物細胞表達載體EGFP-N1(購自Clontech公司)構(gòu)建ANGPTL4基因全長和3個缺失突變體亞克隆(圖1B)，具體操作為利用含有酶切位點的特異性引物，用PCR的方法擴增ANGPTL4基因的編碼區(qū)(1-406位氨基酸)及其3個ANGPTL4缺失子Δ1(1-191位氨基酸)，Δ2(67-406位氨基酸)，Δ3(183-406位氨基酸)，均以XhoI/KpnI酶切位點分別裝入EGFP-N1載體，構(gòu)建成能夠表達C端帶有GFP標簽的融合蛋白ANGPTL4-GFP，ANGPTL4-Δ1-GFP，ANGPTL4-Δ2-GFP和ANGPTL4-Δ3-GFP，ANGPTL4基因融合表達載體均經(jīng)過酶切鑒定及測序驗證無誤。
實施例2ANGPTL4蛋白缺失突變體融合蛋白在人肝癌細胞SMMC-7721的細胞定位從圖2可以看出EGFP蛋白均勻分布于細胞核、胞質(zhì)和胞膜；ANGPTL4全長基因定位于細胞質(zhì)，而缺失C端Fibronectin功能域的缺失突變體(pp1158-delta1)和只缺失N端信號肽的缺失突變體(pp1158-delta2)其過表達產(chǎn)物主要定位于胞核，且呈點狀分布。缺失N端信號肽和Coiled-coil功能域的缺失突變體(pp1158-delta 3)其過表達產(chǎn)物定位主要定位于核，但呈均勻分布。
實施例3ANGPTL4基因及缺失突變體穩(wěn)定細胞系的建立及Western blot檢測用LipofectAMINE脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染EGFP-N1空載體、ANGPTL4-GFP-N1(全長)、ANGPTL4-delta1-GFP-N1、ANGPTL4-delta2-GFP-N1、ANGPTL4-delta3-GFP-N1融合表達載體、經(jīng)G418篩選的肝癌細胞系SMMC7721細胞的Western blot檢測，見圖3。
結(jié)果顯示目的基因均表達，表明穩(wěn)定細胞系成功建立。
實施例4ANGPTL4基因及缺失突變體轉(zhuǎn)染肝癌細胞的體外增殖試驗a)分別將生長狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)染EGFP-N1空載體、ANGPTL4-GFP-N1(全長)、ANGPTL4-delta1-GFP-N1、ANGPTL4-delta2-GFP-N1、ANGPTL4-delta3-GFP-N1融合表達載體、經(jīng)G418篩選的肝癌細胞系SMMC7721細胞消化后制成單細胞懸液；b)按每孔1.5×103細胞的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，接種并開始貼壁生長當天為0天，每隔24h為一個檢測點，用MTT試驗法連續(xù)測定7天的細胞增埴狀況；c)測定時每孔加入10μl的MTT(5mg/ml)(Sigma)，4h后棄培養(yǎng)液，加入150μl的DMSO溶解藍紫色結(jié)晶，待其經(jīng)振蕩充分溶解后每孔各取100μl移至新的酶標板，于540nm波長處測定吸收值，取3個孔的均值(Mean±SD)，繪制生長曲線。(圖4)結(jié)果表明與轉(zhuǎn)染EGFP-N1空載體的SMMC7721細胞相比，轉(zhuǎn)染ANGPTL4-GFP-N1(全長)、ANGPTL4-delta1-GFP-N1、ANGPTL4-delta2-GFP-N1、ANGPTL4-delta3-GFP-N1質(zhì)粒的SMMC7721細胞生長明顯受到抑制(P＜0.05)，提示ANGPTL4基因?qū)Ω伟┘毎捏w外生長具有抑制作用。
實施例5ANGPTL4基因及缺失突變體轉(zhuǎn)染肝癌細胞的遷移試驗a)在60mm細胞培養(yǎng)皿接種1×106分別轉(zhuǎn)染EGFP-N1，ANGPTL4-full-GFP-N1(全長)， ANGPTL4-delta1-GFP-N1，ANGPTL4-delta2-GFP-N1和ANGPTL4-delta3-GFP-N1融合表達載體的SMMC7721肝癌穩(wěn)定細胞系培養(yǎng)至融合度為90％以上；b)用滅菌雙面剃須刀片刮制三條寬2-5mm的無細胞區(qū)，用無血清培養(yǎng)基輕洗除去脫壁細胞；c)添加新鮮培養(yǎng)液3ml，加Thymidine至終濃度為1mmol/L；d)G418 200ug/ml繼續(xù)培養(yǎng)24h，棄培養(yǎng)液，PBS輕洗細胞5minx3，10％緩沖福爾馬林固定，Giemsa染色，每條刮痕上隨機選取3個視野，共9個重復拍照并進行計數(shù)，比較不同處理組之間遷移細胞數(shù)，未轉(zhuǎn)染細胞作陰性對照。圖5結(jié)果顯示與EGFP-N1(空載體組)相比，ANGPTL4-delta1-GFP-Nl轉(zhuǎn)染組遷移細胞稍少，ANGPTL4-delta3-GFP-N1轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染組侵潤細胞較多但差異不顯著，而ANGPTL4-full-GFP-N1(全長)和ANGPTL4-delta2-GFP-N1轉(zhuǎn)染組侵潤細胞顯著增多(P＜0.001，P＜0.001)差異極顯著。
實施例6ANGPTL4基因及缺失突變體轉(zhuǎn)染肝癌細胞的侵襲試驗a)取24-well細胞培養(yǎng)板用孔徑為8μm的培養(yǎng)碟，外底側(cè)均勻涂布10μlCollagen type I，內(nèi)底側(cè)均勻涂布10μl matrigel的PBS稀釋液，凈化工作臺內(nèi)風干后置于24-well培養(yǎng)板孔內(nèi)；
b)培養(yǎng)杯內(nèi)分別添加100μl 5×105/ml的分別轉(zhuǎn)染EGFP-N1，ANGPTL4-full-GFP-N1(全長)，ANGPTL4-delta1-GFP-N1，ANGPTL4-delta2-GFP-N1和ANGPTL4-delta3-GFP-N1融合表達載體的SMMC7721肝癌穩(wěn)定細胞系細胞懸液；c)培養(yǎng)板每孔內(nèi)各加入600μl完全培養(yǎng)基，另外分別加終濃度為100ug/ml的高純度BSA，PBS空白對照；d)繼續(xù)培養(yǎng)12h，PBS輕洗細胞5minx3，甲醇固定，Giemsa染色，用濕潤的醫(yī)用棉簽拭去培養(yǎng)碟內(nèi)未穿膜的細胞，切下培養(yǎng)碟底膜并用中性樹脂封固在載玻片和蓋玻片中，顯微鏡下進行細胞計數(shù)并拍照，比較不同處理間的侵潤細胞數(shù)。圖6結(jié)果顯示與EGFP-N1(空載體組)相比，ANGPTL4-delta1-GFP-N1轉(zhuǎn)染組侵潤細胞稍少，ANGPTL4-delta3-GFP-N1轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染組侵潤細胞較多但差異不顯著，而ANGPTL4-full-GFP-N1(全長)和ANGPTL4-delta2-GFP-N1轉(zhuǎn)染組侵潤細胞顯著增多，差異極顯著。
實施例7ANGPTL4基因及缺失突變體轉(zhuǎn)染肝癌細胞的管狀形成試驗a)取24孔培養(yǎng)板每孔加入300μl matrigel原液，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30min待凝固后再在每孔內(nèi)添加1ml濃度為1.0×105的分別轉(zhuǎn)染EGFP-N1，ANGPTL4-full-GFP-N1(全長)，ANGPTL4-delta1-GFP-N1，ANGPTL4-delta2-GFP-N1和ANGPTL4-delta3-GFP-N1融合表達載體的SMMC7721肝癌穩(wěn)定細胞系細胞懸液；b)同時設未轉(zhuǎn)染細胞的空白對照；c)37℃，5％CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，在2h，4h，6h，12h，24h時間點觀察不同處理組之間內(nèi)皮細胞管狀排列情況，單位面積內(nèi)管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量，完整程度的差異。圖7結(jié)果顯示未轉(zhuǎn)染組、EGFP-N1、ANGPTL4-delta1-GFP-N1和ANGPTL4-delta3-GFP-N1轉(zhuǎn)染組在各時間點上均未形成完整的管狀結(jié)構(gòu)；而ANGPTL4-full-GFP-N1(全長)和ANGPTL4-delta2-GFP-N1轉(zhuǎn)染組所形成的管狀結(jié)構(gòu)排列整齊，較完整，單位面積內(nèi)管狀結(jié)構(gòu)較多。
本發(fā)明所述的基因ANGPTL4的缺失突變體的結(jié)構(gòu)和功能

在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海市腫瘤研究所<120>ANGPTL4缺失突變體及其應用<130>058128<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1943<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(173)..(1393)<223>
<400>1ggagaagaag ccgagctgag cggatcctca cacgactgtg atccgattct ttccagcggc 60ttctgcaacc aagcgggtct tacccccggt cctccgcgtc tccagtcctc gcacctggaa120ccccaacgtc cccgagagtc cccgaatccc cgctcccagg ctacctaaga gg atg agc178Met Ser1ggt gct ccg acg gcc ggg gca gcc ctg atg ctc tgc gcc gcc acc gcc 226Gly Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Met Leu Cys Ala Ala Thr Ala5 10 15gtg cta ctg agc gct cag ggc gga ccc gtg cag tcc aag tcg ccg cgc 274Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Gly Pro Val Gln Ser Lys Ser Pro Arg20 25 30ttt gcg tcc tgg gac gag atg aat gtc ctg gcg cac gga ctc ctg cag 322Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Val Leu Ala His Gly Leu Leu Gln35 40 45 50ctc ggc cag ggg ctg cgc gaa cac gcg gag cgc acc cgc agt cag ctg 370Leu Gly Gln Gly Leu Arg Glu His Ala Glu Arg Thr Arg Ser Gln Leu55 60 65agc gcg ctg gag cgg cgc ctg agc gcg tgc ggg tcc gcc tgt cag gga 418Ser Ala Leu Glu Arg Arg Leu Ser Ala Cys Gly Ser Ala Cys Gln Gly70 75 80acc gag ggg tcc acc gac ctc ccg tta gcc cct gag agc cgg gtg gac 466Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg Val Asp85 90 95cct gag gtc ctt cac agc ctg cag aca caa otc aag gct cag aac agc 514Pro Glu Val Leu His Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln Ash Ser100 105 110
agg atc cag caa ctc ttc cac aag gtg gcc cag cag cag cgg cae ctg 562Arg Ile Gln Gln Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg His Leu115 120 125 130gag aag cag cac ctg cga att cag cat ctg caa agc cag ttt ggc ctc 610Glu Lys Gln His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe Gly Leu135 140 145ctg gac cac aag cac cta gac cat gag gtg gcc aag cct gcc cga aga 658Leu Asp His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala Arg Arg150 155 160aag agg ctg ccc gag atg gcc cag cca gtt gac ccg gct cac aat gtc 706Lys Arg Leu Pro Glu Met Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His Asn Val165 170 175agc cgc ctg cac cgg ctg ccc agg gat tgc cag gag ctg ttc cag gtt 754Ser Arg Leu His Arg Leu Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu Phe Gln Val180 185 190ggg gag agg cag agt gga cta ttt gaa atc cag cct cag ggg tct ccg 802Gly Glu Arg Gln Ser Gly Leu Phe Glu Ile Gln Pro Gln Gly Ser Pro195 200205 210cca ttt ttg gtg aac tgc aag atg acc tca gat gga ggc tgg aca gta 850Pro Phe Leu Val Asn Cys Lys Met Thr Ser Asp Gly Gly Trp Thr Val215 220 225att cag agg cgc cac gat ggc tca gtg gac ttc aac cgg ccc tgg gaa 898Ile Gln Arg Arg His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn Arg Pro Trp Glu230 235 240gcc tac aag gcg ggg ttt ggg gat ccc cac ggc gag ttc tgg ctg ggt 946Ala Tyr Lys Ala Gly Phe Gly Asp Pro His G1y Glu Phe Trp Leu Gly245 250 255ctg gag aag gtg cat agc atc acg ggg gac cgc aac agc cgc ctg gcc 994Leu Glu Lys Val His Ser Ile Thr Gly Asp Arg Asn Ser Arg Leu Ala260 265 270gtg cag ctg cgg gac tgg gat ggc aac gcc gag ttg ctg cag ttc tcc 1042Val Gln Leu Arg Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu Leu Leu Gln Phe Ser275 280285 290gtg cac ctg ggt ggc gag gac acg gcc tat agc ctg cag ctc act gca 1090Val His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu Thr Ala295 300 305ccc gtg gcc ggc cag ctg ggc gcc acc acc gtc cca ccc agc ggc ctc 1138Pro Val Ala Gly Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser Gly Leu310 315 320tcc gta ccc ttc tcc act tgg gac cag gat cac gac ctc cgc agg gac 1186Ser Val Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg Arg Asp325 330 335aag aac tgc gcc aag agc ctc tct gga ggc tgg tgg ttt ggc acc tgc 1234Lys Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly Thr Cys340 345 350agc cat tcc aac ctc aac ggc cag tac ttc cgc tcc atc cca cag cag 1282Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro Gln Gln355 360 365 370cgg cag aag ctt aag aag gga atc ttc tgg aag acc tgg cgg ggc cgc 1330Arg Gln Lys Leu Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg Gly Arg
375 380 385tac tac ccg ctg cag gcc acc acc atg ttg atc cag ccc atg gca gca 1378Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile Gln Pro Met Ala Ala390 395 400gag gca gcc tcc tag cgtcctggct gggcctggtc ccaggcccac gaaagacggt 1433Glu Ala Ala Ser405gactcttggc tctgcccgag gatgtggccg ttccctgcct gggcaggggc tccaaggagg 1493ggccatctgg aaacttgtgg acagagaaga agaccacgac tggagaagcc ccctttctga 1553gtgcaggggg gctgcatgcg ttgcctcctg agatcgaggc tgcaggatat gctcagactc 1613tagaggcgtg gaccaagggg catggagctt cactccttgc tggccaggga gttggggact 1673cagagggacc acttggggcc agccagactg gcctcaatgg cggactcagt cacattgact 1733gacggggacc agggcttgtg tgggtcgaga gcgccctcat ggtgctggtg ctgttgtgtg 1793taggtcccct ggggacacaa gcaggcgcca atggtatctg ggcggcgtca cagagttctt 1853ggaataaaag caacctcaga acacttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1913aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa1943<210>2<211>406<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Ser Gly Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Met Leu Cys Ala Ala1 5 10 15Thr Ala Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Gly Pro Val Gln Ser Lys Ser20 25 30Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Val Leu Ala His Gly Leu35 40 45Leu Gln Leu Gly Gln Gly Leu Arg Glu His Ala Glu Arg Thr Arg Ser50 55 60Gln Leu Ser Ala Leu Glu Arg Arg Leu Ser Ala Cys Gly Ser Ala Cys65 70 75 80Gln Gly Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg85 90 95Val Asp Pro Glu Val Leu His Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln100 105 110Asn Ser Arg Ile Gln Gln Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg115 120 125His Leu Glu Lys Gln His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe130 135 140Gly Leu Leu Asp His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala145 150 155 160Arg Arg Lys Arg Leu Pro Glu Met Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His165 170 175Asn Val Ser Arg Leu His Arg Leu Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu Phe180 185 190Gln Val Gly Glu Arg Gln Ser Gly Leu Phe Glu Ile Gln Pro Gln Gly
195 200 205Ser Pro Pro Phe Leu Val Asn Cys Lys Met Thr Ser Asp Gly Gly Trp210 215 220Thr Val Ile Gln Arg Arg His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn Arg Pro225 230 235 240Trp Glu Ala Tyr Lys Ala Gly Phe Gly Asp Pro His Gly Glu Phe Trp245 250 255Leu Gly Leu Glu Lys Val His Ser Ile Thr Gly Asp Arg Asn Ser Arg260 265 270Leu Ala Val Gln Leu Arg Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu Leu Leu Gln275 280 285Phe Ser Val His Leu Gly Gln Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu290 295 300Thr Ala Pro Val Ala Gly Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser305 310 315 320Gly Leu Ser Val Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg325 330 335Arg Asp Lys Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly340 345 350Thr Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro355 360 365Gln Gln Arg Gln Lys Leu Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg370375 380Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile Gln Pro Met385 390 395 400Ala Ala Glu Ala Ala Ser405<210>3<211> 191<212>PRT<213>人工序列<220>
<221> misc_feature<223>ANGPTL4缺失突變體Δ1<400>3Met Ser Gly Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Met Leu Cys Ala Ala1 5 10 15Thr Ala Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Gly Pro Val Gln Ser Lys Ser20 25 30Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Val Leu Ala His Gly Leu35 40 45Leu Gln Leu Gly Gln Gly Leu Arg Glu His Ala Glu Arg Thr Arg Ser50 55 60Gln Leu Ser Ala Leu Glu Arg Arg Leu Ser Ala Cys Gly Ser Ala Cys
65 70 75 80Gln Gly Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg85 90 95Val Asp Pro Glu Val Leu His Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln100 105 110Asn Ser Arg Ile Gln Gln Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg115 120 125His Leu Glu Lys Gln His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe130 135 140Gly Leu Leu Asp His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala145 150 155 160Arg Arg Lys Arg Leu Pro Glu Met Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His165 170 175Asn Val Ser Arg Leu His Arg Leu Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu180 185 190<210>4<211> 341<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>ANGPTL4缺失突變體Δ2<400>4Leu Ser Ala Leu Glu Arg Arg Leu Ser Ala Cys Gly Ser Ala Cys Gln1 5 10 15Gly Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg Val20 25 30Asp Pro Glu Val Leu His Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln Asn35 40 45Ser Arg Ile Gln Gln Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg His50 55 60Leu Glu Lys Gln His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe Gly65 70 75 80Leu Leu Asp His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala Arg85 90 95Arg Lys Arg Leu Pro Glu Met Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His Asn100 105 110Val Ser Arg Leu His Arg Leu Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu Phe Gln115 120 125Val Gly Glu Arg Gln Ser Gly Leu Phe Glu Ile Gln Pro Gln Gly Ser130 135 140Pro Pro Phe Leu Val Asn Cys Lys Met Thr Ser Asp Gly Gly Trp Thr145 150 155 160Val Ile Gln Arg Arg His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn Arg Pro Trp
165 170 175Glu Ala Tyr Lys Ala Gly Phe Gly Asp Pro His Gly Glu Phe Trp Leu180 185 190Gly Leu Glu Lys Val His Ser Ile Thr Gly Asp Arg Asn Ser Arg Leu195 200 205Ala Val Gln Leu Arg Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu Leu Leu Gln Phe210 215 220Ser Val His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu Thr225 230 235 240Ala Pro Val Ala Gly Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser Gly245 250 255Leu Ser Val Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg Arg260 265 270Asp Lys Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly Thr275 280 285Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro Gln290 295 300Gln Arg Gln Lys Leu Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg Gly305 310 315 320Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile Gln Pro Met Ala325 330 335Ala Glu Ala Ala Ser340<210>5<211>224<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>ANGPTL4缺失突變體Δ3<400>5Arg Leu Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu Phe Gln Val Gly Glu Arg Gln1 5 10 15Ser Gly Leu Phe Glu Ile Gln Pro Gln Gly Ser Pro Pro Phe Leu Val20 25 30Asn Cys Lys Met Thr Ser Asp Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg35 40 45His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn Arg Pro Trp Glu Ala Tyr Lys Ala50 55 60Gly Phe Gly Asp Pro His Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Val65 70 75 80His Ser lle Thr Gly Asp Arg Asn Ser Arg Leu Ala Val Gln Leu Arg85 90 95Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu Leu Leu Gln Phe Ser Val His Leu Gly
100 105 110Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu Thr Ala Pro Val Ala Gly115 120 125Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser Gly Leu Ser Val Pro Phe130 135 140Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg Arg Asp Lys Asn Cys Ala145 150 155 160Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly Thr Cys Ser His Ser Asn165 170 175Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro Gln Gln Arg Gln Lys Leu180 185 190Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu195 200 205Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile Gln Pro Met Ala Ala Glu Ala Ala Ser210 215 220
權(quán)利要求
1.一種ANGPTL4的缺失突變體，其特征在于，所述的缺失突變體具有體外抑制癌細胞生長的功能，并且所述的缺失突變體選自下組(a)缺失了SEQ ID NO2中第192-406位氨基酸序列的ANGPTL4的缺失突變體；(b)缺失了SEQ ID NO2中第1-65位氨基酸序列的ANGPTL4的缺失突變體；(c)缺失了SEQ ID NO2中第1-182位氨基酸序列的ANGPTL4的缺失突變體。
2.如權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于，所述的突變體氨基酸序列選自SEQ ID NO3、4或5。
3.如權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于，所述的突變體完全缺失了C端纖連蛋白Fibronectin功能域或卷曲功能域。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的ANGPTL4的缺失突變體在制備抑制肝癌細胞生長的藥物中的應用。
5.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權(quán)利要求1所述缺失體的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
6.如權(quán)利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO3、4或5所示氨基酸序列的多肽。
7.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求5所述的多核苷酸。
8.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求7所述的載體。
9.一種多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出ANGPTL4的缺失突變體。
10.如權(quán)利要求1所述的ANGPTL4的缺失突變體的用途，其特征在于，用于(a)制備促進腫瘤血管新生的組合物；或(b)制備調(diào)節(jié)腫瘤細胞遷移能力的組合物。
全文摘要
基因ANGPTL4缺失突變體及其應用涉及腫瘤相關(guān)新基因，尤其涉及ANGPTL4基因的功能應用?；駻NGPTL4缺失突變體ANGPTL4－Δ1缺失了C端纖連蛋白功能域；缺失突變體ANGPTL4－Δ2缺失了N端信號肽；缺失突變體ANGPTL4－Δ3缺失了N端信號肽和卷曲功能域?；駻NGPTL4缺失突變體具有抑制肝癌細胞體外生長的作用，可用于制備抑癌的藥物。
文檔編號C07K14/435GK1952129SQ200510030668
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月20日
發(fā)明者李錦軍, 張鋒銳, 顧建人 申請人:上海市腫瘤研究所