-焦磷酸酶基因啟動(dòng)子的缺失突變體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明歸屬于植物基因工程和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種玉米II型 H+-焦磷酸酶基因（ZmVP2)啟動(dòng)子的缺失突變體D8及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物生長(zhǎng)發(fā)育中經(jīng)常遭受逆境脅迫，其中干旱、高鹽等已成為限制農(nóng)業(yè)發(fā)展的重 要因素。據(jù)《中國(guó)水旱災(zāi)害公報(bào)》統(tǒng)計(jì)，每年我國(guó)有1200萬(wàn)公頃以上的耕地遭受不同程度 的干旱脅迫，造成糧食減產(chǎn)約200多億公斤，占農(nóng)作物減產(chǎn)總量的60 %以上；在我國(guó)16億 畝耕地中，鹽堿地約占1億多畝，并且呈現(xiàn)逐年增加趨勢(shì)。發(fā)掘并克隆重要功能基因和調(diào)控 元件，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育作物抗逆新品種是保證糧食高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的有效措施。
[0003] 近年來(lái)，我國(guó)已經(jīng)克隆了一批抗逆基因并用于作物轉(zhuǎn)化，相對(duì)而言我國(guó)具有自主 知識(shí)產(chǎn)權(quán)的啟動(dòng)子的種類及數(shù)量較少，尚不能滿足多基因轉(zhuǎn)化的需求。目前國(guó)內(nèi)外用于作 物遺傳轉(zhuǎn)化的啟動(dòng)子主要是一些組成型啟動(dòng)子，如玉米泛素（Ubiquitin)基因啟動(dòng)子、花 椰菜花葉病毒（CaMV) 35S啟動(dòng)子和水稻肌動(dòng)蛋白（Actin)基因啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子調(diào)控目 標(biāo)基因在所有組織中表達(dá)，且沒(méi)有時(shí)空限制，導(dǎo)致大量目標(biāo)蛋白在不需要的細(xì)胞或發(fā)育階 段大量累積，時(shí)常造成轉(zhuǎn)基因作物的形態(tài)和生理功能異常等，例如Nakashima等利用玉米 Ubiquitin啟動(dòng)子在水稻中過(guò)表達(dá)0sNAC6基因，轉(zhuǎn)基因水稻的抗逆性提高，但同時(shí)也導(dǎo)致 其植株生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，產(chǎn)量降低。
[0004] 植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育需要基因的特異性表達(dá)，基因的表達(dá)調(diào)控可發(fā)生在染色體、 轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后等多個(gè)層次水平，其中轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通 過(guò)順式作用元件與反式作用因子互作實(shí)現(xiàn)。啟動(dòng)子是包含多個(gè)順式作用元件，起始并調(diào)控 基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，在基因轉(zhuǎn)錄的精確起始和轉(zhuǎn)錄效率調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。隨 著對(duì)轉(zhuǎn)基因植物生物安全性要求的提高，同時(shí)植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控也需要目標(biāo)基因的特異性 表達(dá)，誘導(dǎo)型和組織特異型啟動(dòng)子已備受關(guān)注。組織特異性啟動(dòng)子可調(diào)控目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄 一般只發(fā)生在某些特定的器官或組織中，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可根據(jù)需要在植物特定的發(fā)育階段 或特定的生長(zhǎng)環(huán)境下快速啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，即根據(jù)植物的實(shí)際需求實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的時(shí)空或組 織特異性表達(dá)，在植物轉(zhuǎn)基因育種中展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。盡管組織特異性和誘導(dǎo)型 啟動(dòng)子與組成型啟動(dòng)子相比在外源基因的精準(zhǔn)表達(dá)調(diào)控方面體現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但鑒于 我國(guó)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的脅迫誘導(dǎo)性啟動(dòng)子資源匱乏，且對(duì)其啟動(dòng)子序列上的順式作用元 件缺乏系統(tǒng)的了解，限制了我們對(duì)其有效利用，目前已成為作物轉(zhuǎn)基因抗逆遺傳改良的瓶 頸之一。因此，發(fā)掘并分離脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，篩選鑒定其核心功能區(qū)段及特異性調(diào)控序列 具有重要意義。
[0005] H+-焦磷酸酶是一種與H+-ATPase不同的H+轉(zhuǎn)運(yùn)酶，在植物、藻類和光合細(xì)菌中廣 泛存在。植物中H+-焦磷酸酶多定位于液泡膜上，其主要功能是利用水解焦磷酸產(chǎn)生的自 由能將H+從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中，起到質(zhì)子栗的作用，為物質(zhì)的跨液泡膜運(yùn)輸提供能量，同時(shí) 起到酸化液泡的作用。已有的研究表明該酶參與植物逆境脅迫響應(yīng)及生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)。根據(jù) H+-焦磷酸酶對(duì)金屬離子的敏感性差異，將其分為兩類：一類是對(duì)K+敏感而對(duì)Ca2+不敏感的 I型H+-焦磷酸酶；另一類是對(duì)Ca2+敏感而對(duì)K +不敏感的II型H +_焦磷酸酶。Sarafian等 (1992年）首次克隆了擬南芥AVPl基因，是I型H+-焦磷酸酶的典型代表。目前對(duì)I型H+-焦 磷酸酶的研究較多，已從多種植物中克隆出了該酶，其氨基酸序列具有高度相似性，可達(dá)到 80%以上，該酶廣泛參與植物的抗逆性。Carystinos等（1995年）報(bào)道水稻I型H+-焦磷 酸酶基因在缺氧和冷脅迫下轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，解除脅迫后該基因的表達(dá)隨之恢復(fù)至正常 水平。Wang等（2001年）用400mM NaCl處理鹽地堿蓬發(fā)現(xiàn)其I型H+-焦磷酸酶的活性受 到顯著影響。Guo等（2006年）在擬南芥中過(guò)表達(dá)堿蓬I(lǐng)型H+-焦磷酸酶基因 SsVP導(dǎo)致其 耐鹽、抗旱性顯著提高。Gao等（2006年）從鹽芥中克隆了 I型H+-焦磷酸酶基因，命名為 TsVP，在煙草中過(guò)表達(dá)該基因?qū)е缕淠望}和抗寒能力顯著提高。Li等（2008年）在玉米中 過(guò)表達(dá)鹽芥TsVP基因，轉(zhuǎn)基因玉米的耐旱性得到顯著的提高。
[0006] 與I型H+-焦磷酸酶相比，II型H+-焦磷酸酶的研究相對(duì)較少。Oberbeck等（1994 年）利用免疫電鏡技術(shù)在玉米根細(xì)胞高爾基體上發(fā)現(xiàn)了 II型H+-焦磷酸酶的存在，但其基 因未被克隆。Drozdowicz等（2000年）從擬南芥中克隆了第一個(gè)II型H+-焦磷酸酶基因 (AVP2)，與擬南芥I型H+-焦磷酸酶的序列相似度僅為35% ,Mitsuda等（2001年）發(fā)現(xiàn)其 定位于高爾基體膜上。本實(shí)驗(yàn)室的岳桂東等（2008年）從玉米中克隆了 II型H+-焦磷酸酶 基因 ZmVP2 (Genebank accession :EF051578. 1)，其編碼的氨基酸序列具有H+-焦磷酸酶的 保守結(jié)構(gòu)域，與擬南芥II型H+-焦磷酸酶的氨基酸序列相似性為89%，但與玉米I型H+-焦 磷酸酶的氨基酸序列相似度僅為39 %，轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析表明該基因受干旱、高鹽等逆境脅迫 的顯著誘導(dǎo)，且表達(dá)豐度較高?；虻霓D(zhuǎn)錄表達(dá)與啟動(dòng)子密切相關(guān)，克隆ZmVP2的啟動(dòng)子序 列，分析其高鹽和干旱脅迫響應(yīng)特性，發(fā)掘該啟動(dòng)子的核心功能區(qū)段及脅迫響應(yīng)元件具有 重要理論意義和很好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)目前的研究現(xiàn)狀，本發(fā)明主要解決的問(wèn)題是提供一種可用于植物基因工程育 種的高鹽和干旱脅迫誘導(dǎo)性的玉米II型H+-焦磷酸酶基因（ZmVP2)啟動(dòng)子的缺失突變體 D8及其應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明所述的玉米II型H+-焦磷酸酶基因啟動(dòng)子的缺失突變體，其特征在于：所 述缺失突變體是位于玉米Π 型H+-焦磷酸酶基因（ZmVP2)起始密碼子ATG上游的219bp的 連續(xù)堿基序列，該缺失突變體命名為玉米II型H+-焦磷酸酶基因（ZmVP2)啟動(dòng)子的缺失突 變體D8 ;其中所述玉米II型H+-焦磷酸酶基因（ZmVP2)啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示，所述缺失突變體D8的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0009] 上述玉米II型H+-焦磷酸酶基因的啟動(dòng)子序列是從水分脅迫下苗期玉米葉片的 抑制性消減文庫(kù)中篩選并首先克隆了 ZmVP2基因的cDNA序列，利用該cDNA序列在NCBI數(shù) 據(jù)庫(kù)中與玉米高通量基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲取的ZmVP2基因5'端上游1468bp的 核苷酸序列，其為高鹽和干旱脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
[0010] 利用啟動(dòng)子在線分析軟件PLANTCARE和PLACE對(duì)ZmVP2基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分 析，發(fā)現(xiàn)在該啟動(dòng)子1468bp序列上存在35個(gè)可能起作用的順式元件，包括光響應(yīng)元件、脫 落酸及茉莉酸甲酯等激素響應(yīng)元件、低溫等逆境脅迫響應(yīng)元件等（見(jiàn)附圖1)。依據(jù)上述分 析結(jié)果及堿基序列，設(shè)計(jì)ZmVP2啟動(dòng)子5'系列缺失突變體引物，同時(shí)在上下游引物的5' 端分別引入Hind III和EcoR I酶切位點(diǎn)，利用PCR擴(kuò)增獲得不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子缺失片段， 利用兩端的酶切位點(diǎn)將啟動(dòng)子系列缺失片段定向連入植物表達(dá)載體PCAMBIA1391Z中GUS 報(bào)告基因上游的多克隆位點(diǎn)處，構(gòu)建ZmVP2啟動(dòng)子的系列缺失植物表達(dá)載體（見(jiàn)附圖2中 Dl~D9啟動(dòng)子片段與GUS基因的連接示意圖，ATG中的A為+1)。將上述構(gòu)建好的植物表 達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序確認(rèn)，鑒定正確后將上述質(zhì)粒分別命 名為：Dl、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8和D9,其中Dl為ZmVP2全長(zhǎng)啟動(dòng)子，其核苷酸序列如 SEQ ID No. 1所示；缺失突變體D8啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0011] 上述用于構(gòu)建ZmVP2啟動(dòng)子5'端系列缺失突變體的核酸序列可為全長(zhǎng)啟動(dòng)子序 列Dl ;亦可為該啟動(dòng)子的片段序列D2-D9 ;也可為人工修飾改造后仍具有類似該啟動(dòng)子活 性的喊基序列。
[0012] 將上述D1-D9質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中，鑒定正確后用于后續(xù)煙草或玉米等作物 的遺傳轉(zhuǎn)化。
[0013] 鑒于從事相關(guān)研究的本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員很容易通過(guò)定向進(jìn)化或者點(diǎn)突變等方法對(duì) 本發(fā)明中所表述的啟動(dòng)子及其缺失突變體的堿基序列進(jìn)行突變，那些經(jīng)過(guò)人工修飾改造但 具有與本發(fā)明中提供的啟動(dòng)子片段核酸序列同源性2 60%且仍具有啟動(dòng)子活性的堿基序 列均視為本發(fā)明所述啟動(dòng)子核苷酸序列衍生物，等同于本發(fā)明所述序列，屬于本專利保護(hù) 的范疇。
[0014] 含有上述啟動(dòng)子及其缺失片段的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌和轉(zhuǎn)基因植株 均屬于本專利保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0015] 本發(fā)明所描述的玉米II型H+-焦磷酸酶基因（ZmVP2)啟動(dòng)子及其缺失突變體D8 在提高植物抗逆育種中的應(yīng)用。
[0016] 其中：所述的提高植物抗逆育種是通過(guò)利用玉米I