專利名稱：檢測瘧原蟲谷氨酸脫氫酶抗原的方法
發(fā)明的所屬領域本發(fā)明涉及檢測瘧原蟲抗原的方法，特別是涉及使用自測式免疫層析法(ICT)檢測體液樣品中的瘧原蟲谷氨酸脫氫酶(GDH)抗原，并借以診斷惡性瘧或間日瘧的方法，以及用于該方法的檢測條。
發(fā)明的背景瘧疾是廣泛流行于熱帶、亞熱帶及溫帶邊緣地區(qū)的一種重要蟲媒傳染病。在所有蟲媒傳染性疾病中，瘧疾是發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一。目前世界上仍有90多個國家、24億人生活在瘧疾流行區(qū)。每年有5億人發(fā)病，250多萬人死亡。發(fā)病和死亡的病例中，90％是在非洲和亞洲的貧窮國家。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前中國全國估計每年有25-30萬人發(fā)病。另外，瘧疾還是造成進入瘧區(qū)部隊非戰(zhàn)斗減員的主要疾病之一。面對瘧疾對人類造成的嚴重威脅，世界衛(wèi)生組織(WHO)提出進一步研究與開發(fā)更有效的瘧疾防治藥物和診斷技術，以達到2010年全球瘧疾死亡人數(shù)減少50％，2015年再減少50％的目標。
由于受各種因素的影響，瘧疾疫苗的研制進展緩慢，因此實現(xiàn)瘧疾的快速有效的診斷和治療就顯得尤為重要。八十年代以來，隨著分子生物學的發(fā)展和基因診斷技術的出現(xiàn)，瘧疾診斷方法也在不斷改進，顯示了較高的敏感性和特異性，且實現(xiàn)了瘧疾的早期快速診斷。然而，這些方法都需要使用復雜的儀器設備和技術條件，所以難以在基層推廣應用。
以檢測瘧原蟲特異性抗原為基礎的免疫學方法具有快速、簡便、可靠等優(yōu)點，在瘧疾診斷上日益受到重視。
目前常用的檢測方法中，所使用的靶抗原主要是相對特異的瘧原蟲富組氨酸蛋白II(HRPII)和乳酸脫氫酶(LDH)。但基于靶抗原HRPII的診斷方法(Parasight-F及ICT)存在某些缺點，這些缺點包括由于HRPII只存在于無性期和早期配子體中，故不能檢測僅含有成熟配子體的血液樣品；臨床癥狀已消失、血液中蟲體已被清除之后，HRPII仍會存在很長一段時間；由于抗HRPII單克隆抗體可能與類風濕因子產(chǎn)生交叉反應，因而可能導致假陽性。
相對地，基于以LDH為靶抗原的診斷方法則較好地解決了這些問題。與傳統(tǒng)的鏡檢法相比，其敏感性在86％至93％之間，特異性在92％至97％之間，其準確性高于已知以瘧原蟲HRP II為診斷靶抗原的Parasight-F和ICT方法。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是提供一種以免疫層析技術檢測血液樣品中的惡性瘧原蟲或間日瘧原蟲抗原的方法，特征在于其中所使用的抗體是抗瘧原蟲谷氨酸脫氫酶(GDH)抗體。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，特征在于所說的抗體是抗惡性瘧原蟲GDH抗體。
根據(jù)本發(fā)明方法的另一個優(yōu)選實施方案，特征在于所說的抗體是抗惡性瘧原蟲GDH和間日瘧原蟲GDH的交叉反應性抗體(以下簡稱為交叉反應性抗體)。
根據(jù)本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案，特征在于所說的抗體是單克隆抗體。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于本發(fā)明的檢測方法的抗體。
根據(jù)本發(fā)明抗體的一個優(yōu)選實施方案，特征在于所說的抗體僅與惡性瘧原蟲GDH結合的抗體。
根據(jù)本發(fā)明抗體的另一個優(yōu)選實施方案，所說的抗體是可與惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲結合的交叉反應性抗體。
根據(jù)本發(fā)明抗體的再一個優(yōu)選實施方案，所說的交叉反應性抗體是用膠體金或乳膠顆粒標記的。
根據(jù)本發(fā)明的再一個優(yōu)選實施方案，其中所說的膠體金顆粒的粒度為20-30nm。
根據(jù)本發(fā)明的再一個優(yōu)選實施方案，其中所說的血液樣品可以是血漿、全血或血清。
根據(jù)本發(fā)明抗體的再一個優(yōu)選實施方案，所說的交叉反應性抗體可與惡性瘧原蟲GDH的不同抗原決定基結合。
本發(fā)明的再一個目的是提供用于檢測血液樣品中惡性瘧原蟲或間日瘧原蟲的檢測條，其中包括試劑載體條、抗惡性瘧原蟲GDH抗體、抗惡性瘧原蟲GDH和間日瘧原蟲GDH交叉反應性抗體，以及羊或兔抗小鼠IgG抗體的第二抗體。
附圖簡要說明

圖1顯示惡性瘧原蟲基因組PCR擴增結果。其中泳道M是分子量標志；泳1，2是PCR產(chǎn)物；泳道3是陰性對照圖2顯示pGEX-GDH重組質粒的酶切鑒定。其中泳道1-5是pGEX-GDH的EcoRI+Sal I酶切片段；泳道6是pGEX-4T-1的EcoR I+Sal I酶切片段；泳道7是PCR產(chǎn)物；泳道M是分子量標志。
圖3顯示重組蛋白的SDS-PAGE分析。其中泳道M是蛋白質分子量標準；泳道1是pGEX-4T-1/BL21；泳道2是pGEX-GDH/BL21；泳道3是pGEX-GDH/BL21超聲處理后的上清；泳道4是pGEX-GDH/BL21超聲處理后的沉淀；泳道5是經(jīng)3mol/L尿素洗后的包涵體；泳道6是純化的重組蛋白質。
圖4顯示重組蛋白的Western-blot分析。其中泳道M是蛋白質分子量標準；泳道1是pGEX-GDH/BL21；泳道2是pGEX-4T-1/BL21。
圖5顯示多克隆抗體的Western-blot分析。其中泳道M是蛋白質分子量標準；泳道1是間日瘧原蟲；泳道2是惡性瘧原蟲；泳道3是正常人紅細胞。
圖6顯示用于本發(fā)明檢測方法的檢測試劑載體條上的試劑分布模式圖。
發(fā)明的詳細描述以免疫學為基礎的血清學檢測，由于其具有操作簡便快速和結果易于判定等優(yōu)點，所以已成為瘧疾診斷的主要方法。免疫學檢測主要是利用單克隆抗體檢測瘧原蟲的特異性抗原(即所謂抗原捕獲法)。目前報道的被檢抗原主要是HRPII和LDH。
根據(jù)瘧疾流行區(qū)偏僻、落后的特點，迄今已開發(fā)了多種適合瘧疾流行區(qū)現(xiàn)場使用的免疫層析檢測方法和相應的試劑條，例如檢測惡性瘧原蟲的商品檢測條ParaSight-F(dipstick)和ICT Malaria P.f(ICT1)，以及同時檢測惡性瘧原蟲和非惡性瘧原蟲的商品檢測條OptiMAL和ICT Malaria P.f/P.v(ICT2)等。這些檢測方法和檢測條基本上都是基于瘧原蟲HRP II或LDH抗原的。其原理為利用硝酸纖維素膜(NC)制備免疫層析測試條，在NC上包被抗被檢抗原的一株單克隆抗體作為捕獲帶，同時，將另一株單克隆抗體偶聯(lián)在膠體金或乳膠上作為檢測試劑。當樣品溶液和檢測試劑通過捕獲帶時，二者形成的復合物即被包被在膜上的抗體捕捉，如果樣品中含有被檢抗原，則捕獲帶可發(fā)生顏色反應，并且顏色反應的強弱與樣本中的抗原濃度成正比。雖然這些方法和檢測條同樣具有使用上簡便快捷，不需特殊儀器和適于基層醫(yī)院或防疫部門大面積普查使用等優(yōu)點，但它們的特異性和敏感性仍受到一定的限制。
為了進一步尋找具有更高特異性和敏感性的靶抗原，近年來人們也已對瘧原蟲的另一種重要代謝酶一谷氨酸脫氫酶(GDH)引起了的關注。
GDH是一種普遍存在于生物體內對碳、氮代謝起重要作用的酶，在瘧疾的整個紅內期均能表達。該酶催化谷氨酸脫氨基生成α-酮戊二酸，并使輔酶I和II由氧化型(NAD+、NADP+)轉化為還原型(NADH、NADPH)。以前的研究已揭示，瘧原蟲GDH與脊椎動物組織的GDH在理化性質、酶學特性及生物學活性上均有較大差異，如瘧原蟲GDH活性不受嘌呤核苷酸(GTP、ADP)的影響，而脊椎動物組織的GDH可被GTP、ADP激活或抑制；瘧原蟲GDH以輔酶II為其輔酶，而脊椎動物組織的GDH可以輔酶I或II作為輔酶。臨床和實驗研究證據(jù)表明，瘧原蟲比其宿主細胞更易受氧化壓力影響。因此，參與巰基代謝及參與還原型輔酶II(NADPH)再生的脫氫酶對于瘧原蟲免受宿主體內氧化劑損傷及維持生存起著極其重要的作用。瘧原蟲GDH被認為是NADPH生成的主要來源，而且更為重要的是，宿主紅細胞內沒有此酶。另外，Ling等人(LingIT，et al.1986；Parasitology.92313-324)的研究結果初步證明，瘧原蟲GDH可能具有一定的種屬特異性。Rodriguez-Acosta等人(Rodriguez-Acosta A，et al.1998；Braz J Med Biol Res.311149-1155；Rodriguez-Acosta A，et al.1999；Indian J MedRes.109152-156)利用變形桿菌GDH交叉反應性抗體檢測瘧疾感染者血漿和瘧原蟲培養(yǎng)上清中的GDH酶活性，借以診斷惡性瘧原蟲感染并取得了較滿意的結果，因而推測有可能使用谷氨酸脫氫酶作為瘧疾的診斷分子。由于瘧原蟲GDH只能由活蟲體產(chǎn)生，而且血液中瘧原蟲量與GDH水平呈線形關系，所以也可能根據(jù)血液中的GDH水平監(jiān)測感染過程和抗瘧藥物的治療效果?；谏鲜鲞@些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人試圖利用已知的免疫層析檢測系統(tǒng)，以瘧原蟲GDH作為靶抗原，完成惡性瘧或間日瘧的診斷。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種以免疫層析技術同時檢測血液樣品中的惡性瘧原蟲或間日瘧原蟲抗原的方法，特征在于其中所使用的抗體是抗瘧原蟲GDH抗體。
如前所述，雖然目前常用的檢測方法基本上都是檢測相對特異的瘧原蟲HRP II和LDH，但包括我們實驗室在內的有關基礎研究表明，有可能使用具有種屬特異性并只能由活蟲體產(chǎn)生的，特別是紅細胞內不存在的瘧原蟲谷氨酸脫氫酶作為檢測瘧原蟲的靶抗原。事實上，我們初步實驗結果顯示，以瘧原蟲谷氨酸脫氫酶為靶抗原的瘧原蟲檢測方法比以瘧原蟲HRP II、LDH為靶抗原的方法具有更好的特異性和敏感性。
因此，根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明方法中使用的抗體是抗惡性瘧原蟲GDH抗體、抗惡性瘧原蟲GDH和間日瘧原蟲GDH的交叉反應性抗體，以及膠體金顆粒標記的交叉反應性抗體。所說的抗體最好單克隆抗體。并且所說的抗體是哺乳動物特別是小鼠來源的。
可以使用本領域已知的常規(guī)方法制備并用膠體金或乳膠顆粒標記所說的單克隆抗體(參見實施例1)。其中，最好使用帶有紅顏色的膠體金顆粒標記抗體，并且所說的膠體金顆粒的粒度最好是在20-30nm之間。
本發(fā)明的方法可用于同時檢測惡性瘧原蟲GDH和間日瘧原蟲GDH，也可以檢測單一的惡性瘧原蟲GDH或間日瘧原蟲GDH。
在本發(fā)明的基于免疫層析技術(ICT)的瘧原蟲抗原檢測方法中，使用對液體樣品和溶液態(tài)檢測試劑有很好吸附和擴散能力纖維素材料，特別是硝酸纖維素(NC)或玻璃纖維素薄膜作為載體。例如在同時檢測惡性瘧原蟲GDH和間日瘧原蟲GDH的情況下，可以在NC膜上設置分別包被抗惡性瘧原蟲GDH抗體的檢測線1、包被交叉反應性抗體的檢測線2，以及上端包被抗小鼠IgG抗體(第二抗體)的質控線。為了避免試劑溶液和/或介質的流溢，層析條的頂端可接有一段吸水紙。其中所說的第二抗體可以是羊或兔抗小鼠IgG抗體，并且可以是純化的單克隆或多克隆抗體。
使用本發(fā)明的方法檢測血液樣品中惡性瘧原蟲GDH或間日瘧原蟲GDH時，將層析條置于含有被檢樣品中，如待檢樣品中存在瘧原蟲GDH，它首先與膠體金標記的抗惡性瘧原蟲GDH和間日瘧原蟲GDH的交叉反應性抗體結合，瘧原蟲GDH和膠體金-抗體結合物接觸到檢測線1處的抗惡性瘧原蟲GDH抗體時，如果被檢樣品中存在有惡性瘧原蟲抗原，該抗原與檢測試劑形成的復合物即可被包被在層析條上檢測線1處的抗惡性瘧原蟲GDH抗體捕獲，形成惡性瘧特異抗體-惡性瘧原蟲GDH抗原-交叉反應抗體復合物，部分膠體金顆粒便在此處沉著而顯示出一條紅色帶。當檢測試劑的其余部分通過檢測線2時，如果被檢樣品中存在有惡性瘧原蟲或間日瘧原蟲抗原，該抗原與檢測試劑形成的復合物即可被包被在層析條上檢測線2處的惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲交叉抗體捕獲，形成新的交叉反應抗體-惡性瘧原蟲或間日瘧原蟲GDH抗原-交叉反應抗體復合物，并且又有部分膠體金顆粒在此線上沉著而顯示出一條紅色帶。因此，本發(fā)明的層析條可用于同時檢測惡性瘧原蟲GDH或間日瘧原蟲GDH抗原。
為了確保試劑條檢測的可靠性和準確性，層析條上檢測線的上端還設有預包被了羊或兔抗小鼠免疫球蛋白(IgG)抗體(第二抗體)的質控線。當含有惡性瘧特異抗體-惡性瘧原蟲GDH抗原-交叉反應抗體復合物或交叉反應抗體-惡性瘧GDH或間日瘧GDH抗原-交叉反應抗體復合物的溶液繼續(xù)向前泳動并接觸到包被在質控線處的第二抗體時，如果用于捕獲瘧原蟲表面GDH抗原的抗瘧原蟲GDH抗體是特異的并且是特定哺乳動物來源的，上述抗體-抗原-抗體復合物便可與該第二抗體結合，形成新的抗體-抗原-抗體-第二抗體復合物，并且攜帶于復合物中的膠體金顆粒同樣會在該質控線上沉著而顯示出一條紅色帶(參見實施例2)。
因此，基于上述反應原理，層析完成后可根據(jù)層析條上各檢測線處有無紅色線條來判定檢測結果，并可根據(jù)顏色的深淺對被檢材料進行半定量分析。一般說來，陽性反應為質控線出現(xiàn)陽性的前提下，兩條檢測至少出現(xiàn)一條。第一檢測線呈紅色或第一和第二檢測線同時呈紅色判斷為惡性瘧原蟲感染。僅第二檢測線呈紅色判斷為間日瘧原蟲感染。陰性反應則只在質控線上顯示紅顏色。
總之，本發(fā)明的基于ICT技術檢測血液樣品中瘧原蟲抗原的方法，由于使用具有種屬特異性并只能由活蟲體產(chǎn)生的，特別是紅細胞內不存在的瘧原蟲谷氨酸脫氫酶作為檢測瘧原蟲的靶抗原，所以本發(fā)明的方法不僅具有較高陽性活蟲檢出率，而且與使用組氨酸蛋白II(HRPII)和乳酸脫氫酶(LDH)的已有方法相比，本發(fā)明的方法還表現(xiàn)有更好的特異性和準確性。因此，本發(fā)明為瘧疾診斷領域提供了一種可供選擇的新方法。
實施例實施例1抗瘧原蟲抗體的制備本實施例舉例描述本發(fā)明的惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲免疫層析法中所使用的抗瘧原蟲抗體材料的制備。
(1)PCR擴增惡性瘧原蟲GDH基因以惡性瘧原蟲基因組DNA為模板，PCR法擴增GDH基因片段，引物為GDH-P15’-CCTCGAATTCATGAGTGCTCTTAAAGACAA-3’(SEQ ID NO1)GDH-P25’-CCCTGTCGACTTAAAAAC AACCTTGTTCA-3’(SEQ ID NO2)。
反應在50μl體系中進行。循環(huán)參數(shù)為94℃變性5分鐘，94℃ 60秒→58℃40秒→72℃ 90秒，共33個循環(huán)后，72℃延伸7分鐘。擴增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳顯示在約1430bp處有一特異擴增條帶，分子量大小與已報道的惡性瘧原蟲Thailand株的GDH一致(圖1)。
(2)重組表達質粒的構建及鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)酚/氯仿抽提、乙醇沉淀后溶解于水中并用EcoR I/Sal I雙酶消化。取30μl連接混合物轉化TG1感受態(tài)細胞。被轉化的細胞經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜挑取9個單菌落，分別培養(yǎng)后，以提取的質粒DNA為模板PCR擴增得到大小約1430bp的單一條帶。上述克隆質粒進一步用EcoR I+Sal I雙酶切后可產(chǎn)生約4900bp及1430bp兩條帶，而空載體酶切后只有4900bp的一條帶(圖2)。測定的惡性瘧原蟲海南株(FCC1/HN)的GDH基因編碼區(qū)序列(GenBank登錄號為AY040586)，顯示其全度長為1410bp，其中無內含子，A+T/G+C構成比為2.27∶1，符合惡性瘧原蟲結構基因富含A+T堿基的特點。預測其編碼470個氨基酸，分子量為52KD，等電點約為7.43。結果表明GDHpf基因已被正確克隆到pGEX-4T-1載體中，從而得到定名為pGEX-GDH的重組質粒。
(3)表達產(chǎn)物分析將陽性克隆株接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中保溫過夜，次日按1％(V/V)比例轉入相應的新鮮培養(yǎng)液中。當培養(yǎng)物的OD600值達到0.8時，加入IPTG至終濃度為1.0mmol/L，30℃誘導培養(yǎng)4小時收菌。經(jīng)SDS-PAGE檢測，可見重組子表達產(chǎn)物顯示為一條分子量約為66KDa的新的蛋白條帶，作為對照的空質粒載體的表達產(chǎn)物則只顯示一條約29KDa的條帶(圖3)。用制備性電泳法純化的重組蛋白為抗原并使用鼠抗惡性瘧原蟲血清對表達產(chǎn)物進行ELISA分析，結果可見鼠抗惡性瘧原蟲血清能夠與pGEX-GDH表達產(chǎn)物反應，而與BL21和pGEX-4T-1轉化菌的表達產(chǎn)物無反應。然后將工程菌的表達產(chǎn)物電轉移至硝酸纖維素膜上，以鼠抗惡性瘧原蟲血清為抗體進行Western印跡分析，結果顯示在66KDa蛋白處出現(xiàn)一特異性反應條帶，而pGEX-4T-1轉化的細菌則未見相應的帶(圖4)。
用純化后的重組蛋白免疫小鼠，40天后以瓊脂擴散法檢測效價達1:16。Western-blot分析結果顯示該血清能識別惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲分子量約為49KDa處的蟲源蛋白，但與紅細胞則幾乎無反應(圖5)，上述結果為以瘧原蟲GDH作為瘧疾診斷靶抗原提供了免疫學依據(jù)。。
(4)抗惡性瘧原蟲GDH抗體的制備使用19-21周齡的Balb/C小鼠作為被免疫動物。首先用純化的惡性瘧原蟲GDH 75μg加等體積完全弗氏佐劑乳化后，皮下多點注射進行基礎免疫。2周后，以在不同完全弗氏佐劑中乳化的同樣劑量蛋白進行追加免疫。追加免疫后2周，再次用不含弗氏佐劑的同樣劑量蛋白腹腔注射，以進行加強免疫。末次免疫后，從動物的尾靜脈采血并測試抗體效價。必要時，可于處死動物分離脾細胞前3天，再加強免疫一次。
血清抗體效價達到足夠的水平后，處死動物并分離脾細胞，按適當比例將被免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞混合并在PEG-4000作用下融合之。
適當稀釋惡性瘧原蟲GDH并純化蛋白后，用所得稀釋液包被微量滴定板，然后以間接ELISA法檢測雜交瘤陽性克隆，并用有限稀釋法對檢出的陽性克隆進行亞克隆。經(jīng)四次亞克隆后，共篩選出15株分泌抗惡性瘧原蟲GDH的雜交瘤細胞株。進一步試驗表明，其中有11株為惡性瘧原蟲特異性的，4株為既能與惡性瘧原蟲GDH發(fā)生反應，又能與間日瘧原蟲GDH發(fā)生交叉反應。經(jīng)配對實驗得到一株僅與惡性瘧原蟲GDH產(chǎn)生反應的單克隆抗體(5C3)；兩株可與惡性瘧原蟲GDH和間日瘧原蟲GDH發(fā)生交叉反應，且可與不同結合位點結合的單克隆抗體(2H1和14B9)。
ELISA試驗表明，在體外培養(yǎng)條件下，得自雜交瘤培養(yǎng)物上清的抗體5C3、2H1和14D9的效價分別為1:512、1:256和1:256。在體內培養(yǎng)條件下，得自動物腹水液的抗體效價為分別1:25600、1:12800和1:12800。進一步的抗體分型實驗結果顯示，5C3雜交瘤細胞分泌的抗體類型為IgG1，2H1和14B9雜交瘤細胞分泌的抗體類型均為IgG2a。對三株雜交瘤細胞的形態(tài)學觀察可見，它們的染色體數(shù)目范圍在92-110之間，并且大多數(shù)為端著絲點，少數(shù)為亞中部及中央著絲點。
(3)14B9單克隆抗體的純化和膠體金標記用蛋白G Sepharose 4 Fast Flow柱(Amersham)純化腹腔內接種雜交瘤(細胞株14B9)后得到的小鼠腹水液。采用檸檬酸三鈉還原法制備20-30nm膠體金顆粒。取純化的單抗14B9 0.5mg，在磁力攪拌條件下緩慢加到20ml膠體金溶液中并室溫攪拌30分鐘，然后加入10％BSA 0.8ml并室溫攪拌5分鐘，最后再加入10％PEG 0.4ml并室溫攪拌5分鐘。處理后，將所得到的膠體金-抗體結合物于4℃ 15000rpm離心60分鐘。離心后，收集沉淀物并溶解于2ml保存液中，然后用0.45μm濾膜過濾。取膠體金-抗體結合物原液2ml，用稀釋液稀釋至14ml。將用作層析條的玻璃纖維素膜浸泡在膠體金-抗體溶液10分鐘，37℃烤干后熱合封口并置于4℃下保存?zhèn)溆谩?br> (4)抗體固相硝酸纖維素膜的制備用固相溶液(0.02mol/L PB，pH8.0)將純化的5C3和2H1單抗稀釋至3mg/ml，同時取羊抗小鼠IgG用固相溶液稀釋至1mg/ml。將三種抗體分別點樣在硝酸纖維素膜上(5C3、2H1和羊抗小鼠IgG分別加樣于檢測線1、檢測線2和質控線線處)，然后將硝酸纖維素膜置于封閉液(1％脫脂奶粉)中37℃孵育1小時。保溫后，在洗滌液(0.02mol/L PB，pH7.0)中將負載固相化抗體的硝酸纖維素膜浸洗二次，然后室溫風干并置4℃下保存。
(5)免疫層析條的制作按圖6所示，在雙面膠白色塑料板25mm端內側粘附抗體固相硝酸纖維素膜；在雙面膠白色塑料板25mm端中間粘附金標抗體結合物-玻璃纖維素膜條，并在其上面覆蓋一條25mm寬的玻璃纖維素膜條并與抗體固相硝酸纖維素膜重疊2mm，再粘附一層白色膠帶；在雙面膠白色塑料板50mm端粘附32mm寬吸水紙與抗體固相硝酸纖維素膜重疊2mm，并粘附一層白色膠帶；在切條機上切成5mm寬的條帶，即完成免疫層析條的制作。
實施例2血液樣品中瘧原蟲的檢測本實施例舉例描述使用本發(fā)明的抗瘧疾單克隆抗體，以免疫層析法檢測血液樣品中惡性瘧原蟲或間日瘧原蟲的方法。
具體步驟如下用裂解液將10ul血樣稀釋至100ul，加入反應盤內并將預制備的免疫層析條垂直放于反應盤上，待稀釋的血樣全部吸收到條上并用PBS-Tween20(pH7.4)洗滌后，即可清晰看到反應結果。陽性反應為質控線出現(xiàn)陽性的前提下，兩條檢測至少出現(xiàn)一條。第一檢測線呈紅色或第一和第二檢測線同時呈紅色判斷為惡性瘧原蟲感染。僅第二檢測線呈紅色判斷為惡性瘧原蟲感染。陰性反應則只有一條紅色的質控線。
在實驗室研究的基礎上，我們使用本發(fā)明的方法共檢測了門診可疑瘧疾患者血液樣品89份。以鏡檢法檢查的結果作為標準，對使用瘧原蟲GDH和瘧原蟲LDH作為被檢抗原檢測瘧原蟲感染的結果進行比較，結果如下列表1所示。
表1.GDH檢測法和LDH檢測法檢測瘧疾的比較鏡檢 GDH檢測條 LDH檢測條種類 例數(shù) 陽性陰性陽性陰性惡性瘧原蟲 3532 3 30 5間日瘧原蟲 1818 0 17 1混合感染 8 8 0 8 0陰性 280 28 1 27
由表1所示的結果可以看出，鏡檢法檢查89份樣品中有61(68.54％)份檢出瘧原蟲，其中35(57.38％)份為惡性瘧原蟲，18(29.51％)份為間日瘧原蟲，8(13.11％)份為兩種瘧原蟲混存。由于以瘧原蟲LDH和GDH為靶抗原的ICT法都不能診斷混合感染，因此鏡檢法檢出的8份混合感染的血樣在ICT檢測法中都判定為惡性瘧原蟲感染。以瘧原蟲LDH為靶抗原的ICT法則檢出56(62.92％)份陽性血樣，其中38(67.86％)份為惡性瘧原蟲，17(30.36％)份為間日瘧原蟲。本發(fā)明的以GDH為被檢抗原的ICT方法檢出58(65.17％)份陽性血樣，其中40(68.97％)份為惡性瘧原蟲，18(31.03％)份為間日瘧原蟲。
以鏡檢法為參考標準，GDH檢測法和LDH檢測法檢測瘧疾的陽性檢出符合率分別為95.08％和90.16％，特異度分別為100％(28/28)和96.43(27/28)。
序列表<110>熱帶病研究所<120>檢測瘧原蟲谷氨酸脫氫酶抗原的方法<140>
<141>
<160>3<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。
<400>1CCTCGAATTC ATGAGTGCTC TTAAAGACAA<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。
<400>2CCCTGTCGAC TTAAAAACAA CCTTGTTCA
權利要求
1.以免疫層析技術檢測血液樣品中的惡性瘧原蟲或間日瘧原蟲抗原的方法，特征在于其中所使用的抗體是抗瘧原蟲谷氨酸脫氫酶(GDH)抗體。
2.根據(jù)權利要求1的方法，特征在于所說的抗體是抗惡性瘧原蟲GDH抗體。
3.根據(jù)權利要求1的方法，特征在于所說的抗體是抗惡性瘧原蟲GDH和間日瘧原蟲GDH交叉反應性抗體。
4.根據(jù)權利要求1的方法，特征在于所說的抗體是單克隆抗體。
5.用于權利要求1所述檢測方法的抗體。
6.根據(jù)權利要求5的抗體，特征在于所說的抗體是僅與惡性瘧原蟲GDH結合的抗體。
7.根據(jù)權利要求5的抗體，特征在于所說的抗體是可與惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲結合的交叉反應性抗體。
8.根據(jù)權利要求5的抗體，所說的交叉反應性抗體是用膠體金或乳膠顆粒標記的。
9.根據(jù)權利要求5的抗體，所說的交叉反應性抗體可與惡性瘧原蟲GDH的不同抗原決定基結合。
10.用于檢測血液樣品中惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲的檢測條，其中包括試劑載體條，及其上面吸附的抗惡性瘧原蟲GDH抗體、抗惡性瘧原蟲GDH和間日瘧原蟲GDH交叉反應性抗體，以及抗GDH抗體的第二抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測瘧原蟲抗原的方法，特別是涉及使用自測式免疫層析法(ICT)檢測體液樣品中的瘧原蟲谷氨酸脫氫酶(GDH)抗原，并借以診斷惡性瘧或間日瘧的方法。本發(fā)明進一步涉及用于所說的方法的層析條。
文檔編號G01N33/53GK1595156SQ03140430
公開日2005年3月16日 申請日期2003年9月8日 優(yōu)先權日2003年9月8日
發(fā)明者李明, 吳英松, 李妍, 李林海, 寧云山 申請人:熱帶病研究所