專利名稱：微生物發(fā)酵生產谷氨酸脫氫酶的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物學、酶工程、發(fā)酵工程、生物化學等領域，具體涉及一種谷氨酸脫氫酶微生物發(fā)酵生產方法。該發(fā)明生產的谷氨酸脫氫酶主要應用于臨床肝炎、胃病、胰腺炎的診斷以及其它谷氨酸脫氫酶醫(yī)用診斷行業(yè)。鑒于谷氨酸脫氫酶是一種微生物產生的蛋白質，且無毒、無副作用，可以廣泛應用于醫(yī)用診斷試劑盒的生產。
背景技術：
谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase,簡寫為⑶H)是一種依賴輔酶的不需氧脫氫酶，在氨基酸代謝中占有重要地位。它分為NADH依賴型(EC. I. 4. I. 2)、NAD (P) H依賴型(EC. I. 4. I. 3)和NADPH依賴型(EC. I. 4. I. 4)三種類型，廣泛存在于動物、植物和微生 物中，并廣泛應用于臨床肝炎、胃病、胰腺炎等疾病診斷行業(yè)中(胡漢寧等，武漢大學學報，2001)，目前檢測肝病的酶制劑主要是谷丙轉氨酶(ALT)，但其特異性較差，不能完全反映肝細胞損壞程度(郭紹麗等，中國中西醫(yī)結合消化雜志，2001)。隨著GDH試劑盒在醫(yī)用診斷行業(yè)的應用，以及其GDH特異性高，無毒副作用等優(yōu)點，使其更適于常規(guī)肝功能測定及其他疾病檢測項目，特別是慢性肝病患者肝損傷程度判斷、療效觀察和病情監(jiān)測的疾病監(jiān)測項目(曹燕等，上海醫(yī)學檢驗雜志，2003)。早期生產GDH的方法是從動物臟器中提取，所得酶系復雜，很難得到高純度的酶(王燕等，生物工程學報，2003)，而通過微生物發(fā)酵法則容易制得。目前關于微生物GDH研究主要集中在菌株選育、發(fā)酵條件優(yōu)化、酶學性質，酶分離純化及基因克隆等研究階段(王燕等，生物工程學報，2003)，而微生物發(fā)酵生產⑶H的產業(yè)化、規(guī)?；€未見報道。微生物發(fā)酵生產的⑶H純度高，發(fā)酵生產工藝簡單，提取步驟簡易，酶的純化工藝穩(wěn)定，生產不受原料來源影響，更適用于批量生產，且微生物發(fā)酵生產的GDH在醫(yī)用診斷、檢測精密度上要高于其他方法生產的⑶H。因此，微生物發(fā)酵生產的⑶H具有非常廣闊的開發(fā)潛力和應用前景。

發(fā)明內容
本發(fā)明是提供一種微生物發(fā)酵生產⑶H的方法，該發(fā)明主要是微生物經(jīng)過產物定向馴化后，在24 30°C液體發(fā)酵生產⑶H的方法，這種生產方法獲得的⑶H液活性可以達到145U/mL，如再經(jīng)過分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制劑。該方法生產的微生物發(fā)酵GDH操作簡單、方便、快捷、成本低，可以從根本上避免動物組織提取的繁瑣工藝和昂貴的設備。本發(fā)明所述的一種微生物發(fā)酵生產谷氨酸脫氫酶的方法具體包括以下步驟(I)將產生谷氨酸脫氫酶的微生物進行6 10次活化，再經(jīng)過產物定向馴化4 6次，使其在24 30°C環(huán)境條件下生長良好；(2)按常規(guī)方法將產物定向馴化后的谷氨酸脫氫酶產生菌在24 30°C逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子；(3)將液體一級種子或二級種子，按發(fā)酵液體積的3 9%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在24 30°C培養(yǎng)60 114h時，即微生物發(fā)酵生產谷氨酸脫氫酶結束；(4)將(3)的發(fā)酵液在6，000 8，OOOrpm離心收集液體，用蒸餾水洗滌數(shù)次之后離心收集沉淀；(5)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清為谷氨酸脫氫酶粗酶液；
(6)根據(jù)不同需要和使用對象不同，將(5)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。本發(fā)明中使用的菌種來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生長條件按菌種保藏單位提供的說明進行。谷氨酸脫氫酶產生菌(CGMCC菌種編號1. 495或I. 581)，菌株先活化、定向馴化后，按本發(fā)明產酶條件發(fā)酵生產谷氨酸脫氫酶，定向馴化后的菌株在4°C環(huán)境中可保存2個月，用10 25%甘油制成的菌懸液、在零下80°C條件下可以長期保藏。
具體實施例方式實施例一(I)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基牛肉膏10. 0g，蛋白胨10. Og, NaCl 5. 0g，葡萄糖10. 0g，蒸餾水I. 0L, pH值7. 0 7. 2，121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種定向馴化培養(yǎng)基葡萄糖8. 0 12. 0g，蛋白胨18. 0 22. 0g，牛肉膏16. 0 24. 0g, NaCl 4. 0 6. 0g, pH 值自然，121°C高壓蒸汽滅菌 30min。③液體種子培養(yǎng)基葡萄糖22. 0 26. Og,玉米漿24. 0 28. Og,尿素I. 5 3. 5g, K2HPO4 I. 0 2. 5g, MgSO4 0. 4 0. 8g, FeSO4 0. 002 0. 006g, MnSO4 0. 004
0.008g,自來水1.01，？11值自然，1211高壓蒸汽滅菌30min。④發(fā)酵產酶培養(yǎng)基葡萄糖25. 0 45. Og,玉米衆(zhòng)4. 0 8. Og,尿素4. 0 6. Og,K2HPO4 0. 5 2. 5g, FeSO4 0. 001 0. 004g, MgSO4 5. 0 7. 0g, MnSO4 0. 002 0. 005g,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產生谷氨酸脫氫酶的微生物按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行6 10次活化，再經(jīng)過產物定向馴化4 6次，使其在24 30°C環(huán)境條件下生長良好；(3)按常規(guī)方法將產物定向馴化后的谷氨酸脫氫酶產生菌在24 30°C培養(yǎng)36 60h而后按5%的接種量進行逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子；(4)將(3)制備的二級種子按發(fā)酵液體積的3% 5%接種量接入10L的發(fā)酵產酶培養(yǎng)基中，在24 26°C培養(yǎng)96 114h時，即微生物發(fā)酵生產谷氨酸脫氫酶結束；(5)將(4)的發(fā)酵液在6，000 8，OOOrpm離心收集液體，用蒸餾水洗滌數(shù)次之后離心收集沉淀；(6)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清即為谷氨酸脫氫酶粗酶液；(7)根據(jù)不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
實施例二 (I)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基牛肉膏10. 0g，蛋白胨10. Og, NaCl 5. 0g，葡萄糖10. 0g，蒸餾水I. 0L, pH值7. 0 7. 2，121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種定向馴化培養(yǎng)基葡萄糖8. 0 12. 0g，蛋白胨18. 0 22. 0g，牛肉膏16. 0 24. 0g, NaCl 4. 0 6. 0g, pH 值自然，121°C高壓蒸汽滅菌 30min。③液體種子培養(yǎng)基葡 萄糖22. 0 26. Og,玉米漿24. 0 28. Og,尿素L 5
3.5g, K2HPO4 I. 0 2. 5g, MgSO4 0. 4 0. 8g, FeSO4 0. 002 0. 006g, MnSO4 0. 004
0.008g,自來水1.01，？11值自然，1211高壓蒸汽滅菌30min。④發(fā)酵產酶培養(yǎng)基葡萄糖25. 0 45. Og,玉米衆(zhòng)4. 0 8. Og,尿素4. 0 6. Og,K2HPO4 0. 5 2. 5g, FeSO4 0. 001 0. 004g, MgSO4 5. 0 7. 0g, MnSO4 0. 002 0. 005g,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產生谷氨酸脫氫酶的微生物按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行6 10次活化，再經(jīng)過產物定向馴化4 6次，使其在24 30°C環(huán)境條件下生長良好；(3)按常規(guī)方法將產物定向馴化后的谷氨酸脫氫酶產生菌在24 30°C培養(yǎng)36 60h而后按5%的接種量進行逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子；(4)將(3)制備的二級種子按發(fā)酵液體積的5% 7%接種量接入50L的發(fā)酵產酶培養(yǎng)基中，在26 28°C培養(yǎng)78 96h時，即微生物發(fā)酵生產谷氨酸脫氫酶結束；(5)將(4)的發(fā)酵液在6，000 8，OOOrpm離心收集液體，用蒸餾水洗滌數(shù)次之后離心收集沉淀；(6)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清即為谷氨酸脫氫酶粗酶液；(7)根據(jù)不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。實施例三(I)培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基牛肉膏10. 0g，蛋白胨10. 0g, NaCl 5. 0g，葡萄糖10. 0g，蒸餾水I. 0L, pH值7. 0 7. 2，121°C高壓蒸汽滅菌30min。②菌種定向馴化培養(yǎng)基葡萄糖8. 0 12. 0g，蛋白胨18. 0 22. 0g，牛肉膏
16.0 24. 0g, NaCl 4. 0 6. 0g, pH 值自然，121°C高壓蒸汽滅菌 30min。③液體種子培養(yǎng)基葡萄糖22. 0 26. Og,玉米漿24. 0 28. Og,尿素I. 5
3.5g, K2HPO4 I. 0 2. 5g, MgSO4 0. 4 0. 8g, FeSO4 0. 002 0. 006g, MnSO4 0. 004
0.008g,自來水1.01，？11值自然，1211高壓蒸汽滅菌30min。④發(fā)酵產酶培養(yǎng)基葡萄糖25. 0 45. Og,玉米衆(zhòng)4. 0 8. Og,尿素4. 0 6. Og,K2HPO4 0. 5 2. 5g, FeSO4 0. 001 0. 004g,MgS04 5. 0 7. 0g，MnSO4 0. 002 0. 005g,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。(2)將產生谷氨酸脫氫酶的微生物按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行6 10次活化，再經(jīng)過產物定向馴化4 6次，使其在24 30°C環(huán)境條件下生長良好；(3)按常規(guī)方法將產物定向馴化后的谷氨酸脫氫酶產生菌在24 30°C培養(yǎng)36 60h而后按5%的接種量進行逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子；(4)將(3)制備的二級種子按發(fā)酵液體積的7% 9%接種量接入100L的發(fā)酵產酶培養(yǎng)基中，在28 30°C培養(yǎng)60 78h時，即微生物發(fā)酵生產谷氨酸脫氫酶結束；(5)將⑷的發(fā)酵液在6，000 8，OOOrpm離心收集液體，用蒸餾水洗滌數(shù)次之后離心收集沉淀；(6)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10，000 14，OOOrpm離心，收集到的上清即為谷氨酸脫氫酶粗酶液； (7)根據(jù)不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
權利要求
1.一種微生物發(fā)酵生產谷氨酸脫氫酶(簡寫為GDH)的方法，其包括以下步驟 (1)將產生⑶H的微生物進行6 10次活化，再經(jīng)過產物定向馴化4 6次，使其在24 30°C環(huán)境條件下生長良好； (2)按常規(guī)方法將產物定向馴化后的GDH產生菌在24 30°C逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子； (3)將液體一級種子或二級種子，按發(fā)酵液體積的3 9%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在24 30°C培養(yǎng)60 114h時，即微生物發(fā)酵生產GHD結束； (4)將(3)的發(fā)酵液在6，000 8，OOOrpm離心收集液體，用蒸餾水洗滌數(shù)次之后離心收集沉淀； (5)將沉淀懸浮于緩沖液中，加石英砂研磨破碎，10,000 14，OOOrpm離心,收集到的上清為DGH粗酶液； (6)根據(jù)不同需要和使用對象不同，將(5)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，在步驟(6)之后進一步包括將步驟(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的方法，其中菌種定向馴化培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基、發(fā)酵產酶培養(yǎng)基分別為 (1)菌種定向馴化培養(yǎng)基葡萄糖8.0 12.0g，蛋白胨18.0 22. 0g，牛肉膏16. 0 24. Og, NaCl 4. 0 6. Og, pH 值自然，121°C高壓蒸汽滅菌 30min。
(2)液體種子培養(yǎng)基葡萄糖22.0 26. Og,玉米漿24. 0 28. Og,尿素I. 5 3. 5g，K2HPO4 I. 0 2. 5g, MgSO4 0. 4 0. 8g, FeSO4 0. 002 0. 006g, MnSO4 0. 004 0. 008g,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
(3)發(fā)酵產酶培養(yǎng)基葡萄糖25.0 45. Og,玉米衆(zhòng)4. 0 8. Og,尿素4. 0 6. Og,K2HPO4 0. 5 2. 5g, FeSO4 0. 001 0. 004g,MgS04 5. 0 7. 0g，MnSO4 0. 002 0. 005g,自來水I. 0L, pH值自然，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
全文摘要
本發(fā)明所述的一種微生物發(fā)酵生產谷氨酸脫氫酶(簡寫為GDH)的方法是將產生GDH的微生物進行6～10次活化，再經(jīng)過產物定向馴化4～6次，使其在24～30℃環(huán)境條件下生長良好；按常規(guī)方法將產物定向馴化后的GDH產生菌在24～30℃逐級擴大培養(yǎng)，制備成液體一級種子和二級種子；按發(fā)酵液體積的3～9％接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在24～30℃培養(yǎng)60～114h時，即微生物發(fā)酵生產GDH結束；發(fā)酵液在6,000～8,000rpm離心收集菌體，數(shù)次洗滌后收集沉淀，懸浮于緩沖液中，并加石英砂研磨，10,000～14,000rpm收集上清即為粗酶液；根據(jù)不同需要和使用對象不同，可以將粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
文檔編號C12N9/06GK102653736SQ20121010672
公開日2012年9月5日 申請日期2012年4月12日 優(yōu)先權日2012年4月12日
發(fā)明者于爽, 張慶芳, 王曉輝, 石淑鈺, 竇少華, 遲乃玉 申請人:大連大學