專利名稱：有關(guān)谷氨酸脫氫酶α－和β－亞基的新多肽和多核苷酸及用法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是在政府資助下完成的，USDA Competitive GrantNumber 87-CRCR-1-2476。政府對(duì)本發(fā)明擁有一定權(quán)利。
本申請(qǐng)是1995年10月6日提交的未決申請(qǐng)No.08/541,033的部分接續(xù)申請(qǐng)。
植物獲取的無(wú)機(jī)氮在有機(jī)氮代謝中被同化之前就立刻被轉(zhuǎn)化為銨。被認(rèn)為是在同化過(guò)程中所涉及的一種酶是谷氨酸脫氫酶(GDH)，它是一組發(fā)現(xiàn)于從微生物到高等植物和動(dòng)物的幾乎所有生物體的普遍存在的酶(Srivastava，H.S.，R.P.SingliPhytochem.26597-610)。GDH催化經(jīng)由還原性胺化作用由α-酮戊二酸至谷氨酸的可逆轉(zhuǎn)化，所述胺化作用利用還原的β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或還原的β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)作為輔因子。自從發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是高等植物銨同化作用的優(yōu)選途徑的谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶(GS/GOGAT)途徑以來(lái)，已開(kāi)始懷疑植物GDH在銨同化為氨基酸中的作用(Miflin，B.J.，P.J.LeaPhytochem.15873-885)。
在植物氮代謝中起主要作用的GDH的主要缺點(diǎn)是它對(duì)銨的低親和力，這就需要高的胞內(nèi)銨濃度來(lái)起合成作用。早期的證據(jù)表明，GDH是催化谷氨酸脫氨基作用的分解酶，在谷氨酸合成中只起部分合成功能(Wallgrove，J.C.，N.P.Hall.A.C.Kendall，Plant Physiol.83155-158)。各種植物組織和細(xì)胞器中存在的大量GDH的生理作用尚不清楚，GDH在碳和氮代謝中可起顯著作用的可能條件還沒(méi)有判定。
迄今所鑒定的大多數(shù)GDH定位于線粒體中；然而，已從單細(xì)胞綠藻Chlorella sorokiniana鑒定了在幾種性質(zhì)(例如，輔因子特異性、Km值、細(xì)胞器定位、熱穩(wěn)定性等)上有差別的一種GDH。已表明，C.sorokiniana細(xì)胞具有一種組成型、線粒體的、四聚體NAD-特異性的GDH(下文稱為“NAD-GDH”)(Meredith，M.J.，R.M.Gronostajski，R.R.SchmidtPlant Physiol，61967-974)，以及七種銨-可誘導(dǎo)的、葉綠體定位的、均-和雜六聚體NADP-特異性的GDH同工酶(下文中稱為“NADP-GDH”)(Prunkard，D.E.，N.F.Bascomb，R.W.Robinson，R.R.SchmidtPlant Physiol.81349-355；Bascomb，N.F.，R.R.Schmidt Plant Physiol.8375-84)。已表明，在非變性PAGE過(guò)程中七種葉綠體NADP-GDH同工酶具有不同的電泳遷移率，這可歸因于形成了由不同比例α-和β-亞基(分別為53.5和52.3kDa)組成的均-和雜六聚體。
培養(yǎng)于1-2mM銨培養(yǎng)基中的小球藻屬(Chlorella)細(xì)胞只積累α-均六聚體(Bascomb和Schmidt，上文)。向硝酸鹽培養(yǎng)的細(xì)胞中添加更高的銨濃度造成NADP-GDH全酶中α-和β-亞基的積累(Prunkard等，上文；Bascomb和Schmidt，上文；Bascomb，N.F.，D.E.Prunkard，R.R.SchmidtPlant Physiol.8385-91)。Prunkard等(Prunkard，D.E.，N.F.Bascomb，N.F，W.T.Molin，R.R.SchmidtPlant Physiol.81413-422)指出，NADP-GDH亞基比例和同工酶模式受碳和氮源以及細(xì)胞培養(yǎng)的光照條件的影響。
從小球藻屬細(xì)胞純化的α-和β-NADP-GDH均六聚體具有差別驚人的銨Km值；不過(guò)，對(duì)它們的其它底物來(lái)說(shuō)Km值非常相似。催化谷氨酸的生物合成的α-均六聚體(由六個(gè)相同的α-亞基組成)別構(gòu)地受NADPH的調(diào)節(jié)并且具有在0.02-3.5mM間變化的非常低的銨Km，這取決于NADPH濃度(Bascomb和Schmidt，上文)。對(duì)迄今所鑒定的任何植物GDH而言，α-均六聚體的銨Km值是報(bào)道的最低的銨Km值。與此相反，β-均六聚體(分解形式)是銨Km約為75mM的非別構(gòu)酶。根據(jù)涉及純化酶的這些研究，迄今已經(jīng)假設(shè)，雜六聚體對(duì)銨具有不同程度的親和力，在α-和β-均六聚體的Km值間變化。不過(guò)，令人驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)某些雜六聚體可具有比α-或β-均六聚體高的胺化∶脫氨基活性比。
盡管α-和β-亞基具有不同的體內(nèi)轉(zhuǎn)換比(Bascomb等，上文)而且相應(yīng)的均六聚體具有顯著不同的銨Km值，但是α-和β-亞基源于幾乎相同大小的前體蛋白(約58,000Da)而且具有非常相似的肽圖(Prunkard等，上文；Bascomb和Schmidt，上文)。此外，制備的抗β-均六聚體的多克隆抗體能夠免疫沉淀所有這些NADP-GDH同工酶(Yeung，A.T.，K.J.Turner，N.F.Bascomb，R.R.SchmidtAnal.Biochem.10216-228；Bascomb等，上文)，但不與線粒體NAD-GDH發(fā)生交叉反應(yīng)。而且，該試驗(yàn)室中先前的研究提供了基因組克隆化和Southern印跡的證據(jù)，它表明C.sorokiniana基因組具有一個(gè)單一的NADP-GDH結(jié)構(gòu)基因(Cock，J.M.，K.D，Kim，P.W.Miller，R.G.Hutson，R.R.SchmidtPlant Mol.Biol.1717-27)。
C.sorokiniana核編碼的葉綠體NADP-GDH同工酶是從植物分離和鑒定的唯一的葉綠體定位的GDH序列。雖然以前已經(jīng)鑒定過(guò)小球藻屬GDH同工酶，但本發(fā)明中已發(fā)現(xiàn)，經(jīng)由特異性加工兩個(gè)由兩個(gè)mRNA所編碼的相似前體蛋白而產(chǎn)生兩個(gè)成熟亞基，所述mRNA是通過(guò)旁路剪接得自單一核基因的前-mRNA而形成的。此外，在本發(fā)明之前，沒(méi)有鑒定出成熟功能性GDH亞基的切割位點(diǎn)和氨基端肽序列。
本發(fā)明提供了從分離自單細(xì)胞綠藻Chlorella sorokiniana的mRNA得到的兩個(gè)全長(zhǎng)cDNA的分離和鑒定。這兩個(gè)cDNA編碼前體蛋白(α-前體，56.35kD；β-前體，57.85kD)，所述前體蛋白經(jīng)加工可產(chǎn)生組成活性NADP-GDH六聚體同工酶的成熟α-和β-亞基(分別為53.5kD和52.3kDa)。本發(fā)明涉及一個(gè)單一NADP-GDH基因，該基因被旁路剪接而產(chǎn)生兩個(gè)編碼兩個(gè)不同葉綠體前體蛋白的mRNA。這些前體蛋白再被加工成NADP-GDH同工酶的成熟α-和β-亞基。還描述了保留住所公開(kāi)的活性或?qū)嵱眯缘暮塑账岷桶被嵝蛄械挠杏闷瑪嗷蛲蛔凅w。例如，這里所提供的氨基酸序列的某些片斷可用作轉(zhuǎn)運(yùn)肽(transit peptide)，只要該蛋白有能力進(jìn)入并保留于某些細(xì)胞區(qū)室。例如，這里所述的核苷酸序列以及這些核苷酸序列的片斷可用作擴(kuò)增程序中的引物或者用作與感興趣的互補(bǔ)序列雜交的探針。這里所述的核苷酸和氨基酸序列及其片斷也可用作分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物或用于鑒定和符合其它核苷酸序列、多肽或與NADP-GDH有關(guān)的同工酶的相關(guān)性。
本發(fā)明還提供了一些方法，在這些方法中，通過(guò)表達(dá)得自C.sorokiniana的GDH或分離自其它生物體的GDH可以改變高等植物從無(wú)機(jī)氮到有機(jī)氮代謝的同化作用。氮同化作用的改變可具有提高氮同化作用的作用，正如本領(lǐng)域公知的那樣，這可以通過(guò)對(duì)碳代謝的逆向作用例如糖類的積累來(lái)影響植物的組成。本發(fā)明還涉及用于所述方法的DNA構(gòu)建物。本發(fā)明包括α-和β-亞基的氨基端序列的鑒定，所述α-和β-亞基可以組裝形成NADP-GDH同工酶，例如C.sorokinlana葉綠體中發(fā)現(xiàn)的天然六聚體NADP-GDH。可利用這一精確的分子信息來(lái)表達(dá)具有C.sorokiniana葉綠體α-和β-NADP-GDH均六聚體的獨(dú)特動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的NADP-GDH。本發(fā)明還提供重組細(xì)胞或生物體，例如轉(zhuǎn)基因作物或植物，通過(guò)表達(dá)所述多核苷酸序列的基因產(chǎn)生相應(yīng)的多肽，該轉(zhuǎn)基因作物或植物可提高產(chǎn)量、改善氨同化性質(zhì)(這可有利地提高它們對(duì)氨毒性的耐受性)、改變滲透應(yīng)力耐受性、改善作物或植物的組成。


圖1表示連續(xù)光照下于29mM銨培養(yǎng)基中培養(yǎng)240分鐘的同步C.sorokiniana細(xì)胞的勻漿物中NADP-GDH活性的圖式。對(duì)得自不同時(shí)刻收集到的細(xì)胞的澄清勻漿物的等分試樣進(jìn)行胺化(●)和脫氨基(o)NADP-GDH活性的分光光度分析。
圖2表示在29mM銨培養(yǎng)基中培養(yǎng)240分鐘的照明細(xì)胞中NADP-GDH抗原積累的圖式。在0時(shí)刻，向同步C.sorokiniana子代細(xì)胞中添加銨并照明培養(yǎng)物。用激光光密度分析法分析Western印跡的放射性自顯影來(lái)確定240分鐘的誘導(dǎo)期間NADP-GDHα-亞基(●)和β-亞基(o)的相對(duì)水平。
SEQ ID NO.1是NADP-特異性的谷氨酸脫氫酶的α-亞基的前體蛋白的cDNA。
SEQ ID NO.2是SEQ ID NO.1的多核苷酸的推定氨基酸序列。
SEQ ID NO.3是NADP-特異性的谷氨酸脫氫酶的β-亞基的前體蛋白的cDNA。
SEQ ID NO.4是SEQ ID NO.3的多核苷酸的推定氨基酸序列。
SEQ ID NO.5是NADP-GDHα-亞基的N端序列。
SEQ ID NO.6是NADP-GDHβ-亞基的N端序列。
SEQ ID NO.7是稱為pBGDc53的克隆中cDNA序列。
SEQ ID NO.8是與NADP-GDH mRNA的保守區(qū)雜交的引物。
SEQ ID NO.9是按照本發(fā)明用作銜接子引物的poly(dT)多核苷酸。
SEQ ID NO.10是按照本發(fā)明用作引物的多核苷酸。
SEQ ID NO.11是按照本發(fā)明用作引物的多核苷酸。
SEQ ID NO.12是按照本發(fā)明用作銜接子引物的多核苷酸。
SEQ ID NO.13是稱為pRGDc60的克隆中多核苷酸插入片斷。
SEQ ID NO.14是稱為pRGDc61的克隆中多核苷酸插入片斷。
SEQ ID NO.15是按照本發(fā)明用作引物的多核苷酸。
SEQ ID NO.16是稱為pGDc63的克隆中多核苷酸插入片斷。
SEQ ID NO.17是稱為pGDc64的克隆的多核苷酸插入片斷。
SEQ ID NO.18是按照本發(fā)明連接稱為pBGD53和pGDc63的克隆中插入片斷的純化片斷而得到的多核苷酸。
SEQ ID NO.19是連接稱為pGDc64和pBGDc53的克隆的純化插入片斷而得到的多核苷酸。
SEQ ID NO.20是按照本發(fā)明用作引物的多核苷酸。
SEQ ID NO.21是按照本發(fā)明用作與模板DNA的3′端雜交的引物的多核苷酸。
SEQ ID NO.22是按照本發(fā)明用作引物的多核苷酸。
SEQ ID NO.23是經(jīng)加工的、成熟NADP-GDHα-亞基的多核苷酸序列(cDNA)。
SEQ ID NO.24是經(jīng)加工的、成熟NADP-GDHα-亞基的氨基酸序列。
SEQ ID NO.25是經(jīng)加工的、成熟NADP-GDHβ-亞基的多核苷酸(cDNA)序列。
SEQ ID NO.26是經(jīng)加工的、成熟NADP-GDHβ-亞基的氨基酸序列。
本發(fā)明提供了迄今未描述過(guò)的多核苷酸序列，例如，得自Chlorellasorokiniana的銨可誘導(dǎo)的、葉綠體-定位的NADP-特異性的谷氨酸脫氫酶(下文稱NADP-GDH)的α-和β-亞基的前體蛋白的cDNA。形成NADP-GHD的α-和β-亞基的前體蛋白的核苷酸序列分別示于SEQ ID NO.1和3。得自Chlorella sorokiniana的NADP-GDH酶的α-和β-亞基的前體蛋白的推定氨基酸序列分別示于SEQ ID NO.2和4。
包含主題cDNA插入片斷的大腸桿菌(E.coli)宿主保藏于theAmerican Type Culture Collection(ATCC)，12301 ParklawnDrive，Rockville，Maryland 20852 USA。保藏單位給出了培養(yǎng)物的入藏登記號(hào)培養(yǎng)物入藏登記號(hào)保藏日期大腸桿菌DH5α ATCC 699251995年10月6日α-NADP-GDHSEQ NO.1(+42bp)大腸桿菌DH5α ATCC 699261995年10月6日β-NADP-GDHSEQ NO.1(-42bp)按照37 CFR 1.14和35USC 122，該主題培養(yǎng)物已于一定條件下保藏，該條件保證在該專利申請(qǐng)未決期間專利商標(biāo)官員依職權(quán)指定的人能夠獲得該培養(yǎng)物。按照主題申請(qǐng)的相應(yīng)申請(qǐng)或其子申請(qǐng)已被提交的國(guó)家的專利法的要求，可獲得該保藏物。不過(guò)應(yīng)該理解的是，可獲得一種保藏物并不構(gòu)成實(shí)施主題申請(qǐng)的許可，并不是廢除政府行為所授予的專利權(quán)。
而且，按照關(guān)于微生物保藏的布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，主題培養(yǎng)保藏物將被保存并使公眾可獲得它，例如，保存時(shí)應(yīng)采取必須措施使之在一定期限內(nèi)是存活的、未受污染的，該期限是最近一次要求提交保藏物樣品之后至少五年，無(wú)論如何，保藏日期之后至少30年或者可能發(fā)布公開(kāi)該培養(yǎng)物的任何專利的可實(shí)施期間。如果保藏單位因保藏物的情況而在被要求時(shí)不能提供該樣品，寄存人承認(rèn)替換該保藏物的責(zé)任。公開(kāi)這些保藏物的專利一旦被授權(quán)，對(duì)公眾獲取主題保藏物的所有限制將最終取消。
自動(dòng)氨基酸序列分析分別鑒定了α-和β-亞基的20個(gè)和10個(gè)氨基端氨基酸殘基。α-和β-亞基肽序列的對(duì)照顯示，除了在較大的α-亞基中存在11個(gè)氨基酸的突出端之外，這兩個(gè)亞基是相同的。發(fā)現(xiàn)抗α-亞基的單克隆抗體能識(shí)別β-亞基，這提供更進(jìn)一步的證據(jù)證明這兩個(gè)亞基幾乎是相同的。對(duì)前體蛋白中獨(dú)特的α-和β-亞基加工位點(diǎn)的鑒定提供了解釋?duì)?和β-NADP-GDH均六聚體同工酶的不同動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的分子機(jī)理。
上述資料提供了適用于遺傳工程植物的信息，所述植物具有特異性的GDH，該GDH具有能影響碳和氮代謝兩者的有利動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。根據(jù)高的鳥(niǎo)嘌呤/胞嘧啶含量，這些cDNA對(duì)高等植物中的異源表達(dá)而言是高度適用的。把帶有其葉綠體導(dǎo)向序列或帶有其它細(xì)胞器導(dǎo)向序列的任一亞基或二者導(dǎo)入異源植物系統(tǒng)可以改善氮同化作用并影響碳/氮平衡。
已發(fā)現(xiàn)葉綠體定位與α-或β-前體蛋白的N端有關(guān)或者取決于它。切割前體的N端產(chǎn)生成熟蛋白。因此，葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽包括一種肽，這種肽形成從前體蛋白切下的N端或者就是它的活性片斷。具有相似或等同氨基酸序列的肽，或者具有與這些切割的肽相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)或構(gòu)象的肽也可起轉(zhuǎn)運(yùn)肽的作用。葉綠體-轉(zhuǎn)運(yùn)膚包括從α-前體(40聚體)或β-前體(37聚體)切下的N端肽的活性片斷。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可用編碼葉綠體-轉(zhuǎn)運(yùn)肽的多核苷酸序列來(lái)產(chǎn)生葉綠體-轉(zhuǎn)運(yùn)肽，采用這里所述的肽或本領(lǐng)域已知的其它肽。
可通過(guò)本領(lǐng)域公知技術(shù)，采用添加、消除或取代與一種蛋白(例如GDH酶)結(jié)合的葉綠體-轉(zhuǎn)運(yùn)肽來(lái)按需要定位該蛋白。例如，通過(guò)把葉綠體-轉(zhuǎn)運(yùn)肽插入缺乏這種轉(zhuǎn)運(yùn)肽的氨基酸序列中，可完成酶在細(xì)胞葉綠體中的定位。種特異性的葉綠體-轉(zhuǎn)運(yùn)肽可被添加或者用其替換存在的那些肽，以最優(yōu)化地插到所需種的葉綠體中。此外，通過(guò)用編碼表達(dá)出的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列直接轉(zhuǎn)化質(zhì)體可實(shí)現(xiàn)在葉綠體中表達(dá)出的蛋白質(zhì)在葉綠體中的定位。類似地，可采用除去葉綠體-轉(zhuǎn)運(yùn)肽或產(chǎn)生缺乏該肽的重組蛋白，在除葉綠體之外的細(xì)胞區(qū)室中掩蔽該蛋白。
表達(dá)α-均六聚體的轉(zhuǎn)化植物可以對(duì)氨毒性有更高的耐受力，更有效地同化銨，通過(guò)提供谷氨酸即滲透保護(hù)劑脯氨酸的前體而對(duì)暫時(shí)含鹽土壤中遇到的滲透應(yīng)力更迅速地作出反應(yīng)。例如，可以利用β-均六聚體或GDH雜六聚體的表達(dá)來(lái)改變氮的同化速率，有利于果實(shí)和其它貯藏器官中糖類的積累。
出乎意料地發(fā)現(xiàn)，包含至少一個(gè)α-亞基和至少一個(gè)β-亞基的六聚體即雜六聚體可具有有利的活性。具體地說(shuō)，通過(guò)把α-和β-亞基二者摻入六聚體蛋白而不是采用僅包含α-亞基或僅包含β-亞基的均六聚體，可以提高葉綠體NADP-GDH同工酶的胺化∶脫氨基活性比(即合成谷氨酸的生物合成能力)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，以不同的比例/水平在同一植物中共表達(dá)編碼這兩種類型亞基的cDNA會(huì)是有利的，這樣可以在雜六聚體中得到特定比例的α-和β-亞基。例如，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)提高胺化∶脫氨基活性比而言，至少具有一個(gè)β-型亞基的NADP-GDH雜六聚體是優(yōu)選的。更優(yōu)選的雜六聚體具有2-5個(gè)β-亞基。這兩種cDNA的不同表達(dá)比例可這樣達(dá)到將它們置于不同強(qiáng)度的植物啟動(dòng)子控制之下或者置于已修飾成能產(chǎn)生不同表達(dá)水平的同一啟動(dòng)子的控制之下。在植物生物技術(shù)中應(yīng)用這種藻類NADP-GDH同工酶系統(tǒng)比使用得自諸如細(xì)菌的生物體的NADP-GDH(僅含有單一形式的該酶，即沒(méi)有同工酶)有優(yōu)勢(shì)。
公認(rèn)的是，通過(guò)提高穩(wěn)定化mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)可以改善某些重組蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)水平；反過(guò)來(lái)可以利用對(duì)這些穩(wěn)定化RNA轉(zhuǎn)錄物的檢測(cè)來(lái)衡量翻譯產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的表達(dá)。通過(guò)使用得自基因源生物體、確定所需蛋白的、改善的合成基因，可以解決植物中蛋白R(shí)NA的低表達(dá)問(wèn)題和由此產(chǎn)生的低蛋白表達(dá)問(wèn)題。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以對(duì)細(xì)胞和植物進(jìn)行工程化處理以獲得具有農(nóng)業(yè)或其它商業(yè)價(jià)值的新型蛋白的所需表達(dá)水平。為提供在植物中表達(dá)得到提高的基因，可對(duì)該基因的DNA序列進(jìn)行修飾以包含為高度表達(dá)的植物基因所優(yōu)選的密碼子，大體上獲得植物中發(fā)現(xiàn)的核苷酸堿基組成中的A+T含量，而且還優(yōu)選形成一個(gè)植物起始序列，并且消除那些導(dǎo)致RNA的去穩(wěn)定作用、不適當(dāng)?shù)木巯佘账峄?、降解和終止的序列，避免那些構(gòu)成二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)夾和RNA剪接位點(diǎn)的序列。例如，在合成基因中，可以根據(jù)高度表達(dá)的植物基因中所采用密碼子使用的分配頻率來(lái)選擇用于確定一個(gè)給定氨基酸的密碼子以確定那個(gè)氨基酸。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)到的那樣，合成基因中用到的密碼子使用的分配頻率是表達(dá)水平的一個(gè)決定因素。
對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，“優(yōu)選密碼子使用的頻率”是指使用核苷酸密碼子來(lái)確定一個(gè)給定氨基酸時(shí)由特定宿主細(xì)胞所表現(xiàn)出的優(yōu)先性。為確定一個(gè)基因中一個(gè)特定密碼子的使用頻率，把該基因中那個(gè)密碼子的出現(xiàn)數(shù)目除以該基因中確定同一氨基酸的所有密碼子的總出現(xiàn)數(shù)目。類似地，通過(guò)對(duì)宿主細(xì)胞表達(dá)的大量基因中的優(yōu)選密碼子使用的頻率進(jìn)行平均，可以計(jì)算出宿主細(xì)胞所表現(xiàn)的優(yōu)選密碼子使用的頻率。最好將這種分析方法局限于被宿主細(xì)胞高度表達(dá)的基因。
合成在宿主細(xì)胞中的表達(dá)得以改善的基因時(shí)，希望設(shè)計(jì)這種基因使其密碼子使用的頻率接近宿主細(xì)胞的優(yōu)選密碼子使用的頻率。
按下述方法計(jì)算一個(gè)合成基因的優(yōu)選密碼子使用頻率與宿主細(xì)胞所采用的頻率的百分偏差首先確定單一密碼子的使用頻率與宿主細(xì)胞的頻率的百分偏差，再獲得所有密碼子的平均偏差。如此處所定義，這種計(jì)算包括獨(dú)特的密碼子(即ATG和TGG)。一般而言，用下式計(jì)算一個(gè)合成基因的密碼子使用與宿主細(xì)胞的密碼子使用的總平均偏差A(yù)=Σn=1ZXn-YnXnx100Z]]>其中Xn＝宿主細(xì)胞中密碼子n的使用頻率；Yn＝合成基因中密碼子n的使用頻率。當(dāng)n代表確定一個(gè)氨基酸的單個(gè)密碼子時(shí)，密碼子總數(shù)為Z。對(duì)所有氨基酸的密碼子使用頻率的總偏差A(yù)優(yōu)選應(yīng)低于約25％，更優(yōu)選低于約10％。因此，可以設(shè)計(jì)一種基因，使其密碼子使用的分配頻率與高度表達(dá)的植物基因的分配頻率的偏離優(yōu)選不超過(guò)25％，更優(yōu)選不超過(guò)約10％。此外，研究了簡(jiǎn)并的第三個(gè)堿基(單子葉植物在該位置上似乎傾向于G+C，而雙子葉植物則不然)的百分G+C含量。還認(rèn)識(shí)到，XCG(其中X是A、T、C或G)核苷酸是雙子葉植物中最少優(yōu)選的密碼子，而XTA密碼子則在單子葉植物和雙子葉植物中都得到避免。本發(fā)明的合成基因還優(yōu)選具有CG和TA雙重避免指數(shù)，非常接近選定宿主植物的指數(shù)。更優(yōu)選的是，這些指數(shù)與宿主指數(shù)的偏差不超過(guò)大約10-15％。
可利用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行本發(fā)明的NADP-GDH基因的裝配?？梢杂妹复俜椒ò褳樘岣咴谥参镏斜磉_(dá)而設(shè)計(jì)的、特定實(shí)施方案的結(jié)構(gòu)基因裝配在得自化學(xué)法合成的寡核苷酸雙鏈體區(qū)段的DNA載體中。然后可將該基困導(dǎo)入植物宿主細(xì)胞并用本領(lǐng)域已知手段表達(dá)。優(yōu)選地，在植物中表達(dá)合成基團(tuán)時(shí)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)與天然蛋白功能上是等同的，因?yàn)榫哂锌杀葦M的或改善的胺化/脫氨基活性。根據(jù)本發(fā)明，“功能上等同”是指功能相同或幾乎相同。具有至少一個(gè)與其活性或功能有關(guān)的性質(zhì)、與天然蛋白相同或相似的合成基因產(chǎn)物被視為與其功能上等同?？梢詫?duì)編碼區(qū)的核苷酸序列進(jìn)行修飾，以改變合成基因的DNA堿基組成中A+T含量從而反映用于宿主細(xì)胞固有的高度表達(dá)的蛋白質(zhì)的基因中常見(jiàn)的情況。合成基因的A+T含量最好與用于高度表達(dá)的蛋白質(zhì)的所述基因的A+T含量大體相等。在編碼高度表達(dá)的植物蛋白的基因中，A+T含量大約為55％。該合成基因最好具有接近該值的A+T含量，而不是高得足以造成RNA的去穩(wěn)定作用從而降低蛋白表達(dá)水平。更優(yōu)選A+T含量不高于大約60％，最優(yōu)選約為55％。為了在植物中最終表達(dá)，可以優(yōu)選地對(duì)合成基因核苷酸序列進(jìn)行修飾以在編碼區(qū)的5′端形成一個(gè)植物起始序列。另外，最好特別加以注意以保證獨(dú)特的限制位點(diǎn)處于關(guān)鍵位置，以便在構(gòu)建合成基因期間有效地裝配寡核苷酸區(qū)段，并且有利于后續(xù)的核苷酸修飾。天然基因的編碼區(qū)中這些修飾的結(jié)果是，在植物中表達(dá)了優(yōu)選的合成基因，與天然結(jié)構(gòu)基因的觀察結(jié)果相比，該表達(dá)水平提高了。
已經(jīng)知道，在單子葉植物和雙子葉植物之間，同義密碼子的相對(duì)使用有所不同。一般而言，區(qū)分單子葉植物和雙子葉植物密碼子使用模式的最重要因素是簡(jiǎn)并的第三個(gè)堿基的百分G+C含量。對(duì)單子葉植物來(lái)說(shuō)，18個(gè)氨基酸中有16個(gè)偏向于該位置的G+C，而雙子葉植物則在18個(gè)氨基酸中僅有7個(gè)偏向于G+C。
對(duì)大豆和玉米而言，玉米的密碼子使用模式通常類似于單子葉植物，而大豆密碼子使用模式與一般的雙子葉植物模式幾乎相同。
設(shè)計(jì)用于在植物中表達(dá)的基因時(shí)，最好消除那些影響基因表達(dá)效能的序列。
也可以為提高表達(dá)水平之外的其它目的合成合成基因。例如，按照本發(fā)明，可以對(duì)編碼NADP-GDH的α-亞基或β-亞基的核苷酸序列之一進(jìn)行修飾，以便有差別地表達(dá)出產(chǎn)物，有利于亞基之一的表達(dá)。這種有差別的表達(dá)的一個(gè)結(jié)果是所含一種亞基多于另一種亞基的雜六聚體。這種修飾可以包括把用于構(gòu)建該合成基因的一個(gè)或多個(gè)(但不是全部)寡核苷酸區(qū)段用天然序列的相應(yīng)區(qū)域代替。最好可以采用編碼NADP-GDH多肽的α-和β-亞基的核苷酸序列的有差別表達(dá)來(lái)產(chǎn)生一種雜六聚體，該雜六聚體帶有至少一個(gè)β-亞基，更優(yōu)選2-5個(gè)β-亞基，最優(yōu)選3個(gè)β-亞基。
可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何方法把包括本發(fā)明核苷酸序列的重組DNA分子導(dǎo)入植物組織。用于一給定的植物種或特定類型的植物組織的技術(shù)取決于已知的成功技術(shù)。因?yàn)殚_(kāi)發(fā)了用于適當(dāng)?shù)匕淹庠椿虿迦胫参锛?xì)胞或用于操作已修飾細(xì)胞的新手段，所以熟練技術(shù)人員應(yīng)能選擇已知手段達(dá)到所需目的。把重組DNA導(dǎo)入植物組織的方法包括(但不局限于)直接DNA攝取(Paszkowski，J.等，(1984)EMBO J.32717)，電穿孔法(Fromm，M.等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825824)，顯微注射(Crossway，A.等，(1986)Mol.Gen.Genet.202179)，T-DNA介導(dǎo)的由根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)至植物組織的轉(zhuǎn)移。就T-DNA對(duì)農(nóng)桿菌屬天然宿主范圍進(jìn)行的轉(zhuǎn)化而言，似乎沒(méi)有根本的限制。已報(bào)道了成功的T-DNA介導(dǎo)的單子葉植物的轉(zhuǎn)化(Hooykaas-Van Slogeren，G.等(1984)Nature 311763)，裸子植物轉(zhuǎn)化(Dandekar，A.等(1987)Biotechnology，5587)以及藻類轉(zhuǎn)化(Ausich，R.，EPO申請(qǐng)108,580)。代表性的T-DNA載體系統(tǒng)描述于下列文獻(xiàn)中An，G.等(1985)EMBO J.4277；Herrera-Estrella，L.等(1983)Nature 303209；Herrera-EstreUa，L.等(1983)EMBO J.2987；Herrera-Estrella，L.等(1985)見(jiàn)Plant Genetic Engineering，NewYorkCambridge University Press，P.63。一旦導(dǎo)入植物組織中，就可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法分析結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，用轉(zhuǎn)錄的mRNA或合成的蛋白質(zhì)衡量表達(dá)。已經(jīng)知道一些體外培養(yǎng)植物組織的技術(shù)，在一些情形中，在完整植物中再生的技術(shù)。把導(dǎo)入的表達(dá)復(fù)合體轉(zhuǎn)移入有商業(yè)價(jià)值的栽培品種的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本文所披露的本發(fā)明包括在一種植物可表達(dá)啟動(dòng)子的控制下在植物細(xì)胞中表達(dá)NADP-GDH基因，即在植物可表達(dá)啟動(dòng)子的控制下將該基因插入T-DNA并使用已知手段把含該插入片斷的T-DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞。一旦獲得在植物可表達(dá)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)該基因的植物細(xì)胞，就可以用本領(lǐng)域熟知的方法和技術(shù)再生植物組織和完整植物。然后用常規(guī)手段繁殖再生的植物，可以用常規(guī)的植物育種技術(shù)把導(dǎo)入的基因轉(zhuǎn)移入其它株和栽培品種。
NADP-GDH基因的導(dǎo)入和表達(dá)可用于改善(例如提高)作物的產(chǎn)量。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，利用導(dǎo)入植物種中的基因的性質(zhì)的本發(fā)明其它用途是顯而易見(jiàn)的。
植物核基因與葉綠體之間在密碼子選擇方面存在差異。葉綠體與高等植物之間的差別在于它們只編碼30種tRNA。既然葉綠體已限制了其tRNA基因，葉綠體編碼的蛋白質(zhì)的優(yōu)選密碼子的使用似乎更為極端。不過(guò)，已經(jīng)報(bào)道了用于一給定氨基酸的同工tRNA水平與葉綠體基因組中這一密碼子的使用頻率之間的正相關(guān)關(guān)系(Pfitzinger等(1987)Nucl.Acids Res.151377-1386)。一般而言，葉綠體密碼子分配與單細(xì)胞生物體的更為相似，在簡(jiǎn)并的第三個(gè)堿基上更偏于使用A+T。
下面的實(shí)施例闡述了實(shí)施本發(fā)明的方法，包括最佳方式。不應(yīng)將這些實(shí)施例視為限制性的。除非另有指明，所有的百分?jǐn)?shù)是指重量百分?jǐn)?shù)，所有的溶劑混合物比例按體積。
實(shí)施例實(shí)施例1-C.sorokiniana葉綠體谷氨酸脫氫酶的動(dòng)力學(xué)下列試驗(yàn)中用到的葉綠體谷氨酸脫氫酶α-和β-同工酶是由被鑒定為Clorella sorokiniana的生物體天然產(chǎn)生的。
C.sorokiniana培養(yǎng)條件。為了在胺化和脫氨基這兩個(gè)方向進(jìn)行動(dòng)力學(xué)表征，從只積累一種形式的均六聚體GDH同工酶的細(xì)胞中純化α-和β-全酶。
如前面所述(Prunkard等，同上文)，在改進(jìn)的基本鹽培養(yǎng)基中自養(yǎng)法培養(yǎng)C.sorokiniana細(xì)胞(UTEX-1230，University of Texas algalculture collection；3B2NA，Robert R.Schmidt，University of Florida，Microbiology Cell Science Department)。這種改進(jìn)的培養(yǎng)基含有以mM濃度計(jì)的CaCl2，0.34；K2SO4，6.0；KH2PO4，18.4；MgCl2，1.5；以μM濃度計(jì)的CoCl2，0.189；CuCl2，0.352；EDTA，72；FeCl3，71.6；H3BO3，38.8；MnCl2，10.1；NH4VO4，0.20；(NH4)6MO7O24，4.19；NiCl2，0.19；SnCl2，0.19；ZnCl2，0.734。該培養(yǎng)基補(bǔ)充有作為氮源的1mM NH4Cl，29mM NH4Cl，或29mMKNO3，這取決于試驗(yàn)條件。在高壓滅菌之后，用KOH調(diào)節(jié)含NH4Cl的培養(yǎng)基至pH7.4，調(diào)節(jié)含KNO3的培養(yǎng)基至pH6.8。為細(xì)胞提供2％(v/v)CO2-空氣混合物以及光強(qiáng)，要足以使細(xì)胞分裂四代。
NADP-GDH同工酶的純化。為純化谷氨酸脫氫酶α-同工酶，如前所述，在30升Plexiglas室中29mM銨培養(yǎng)基中于連續(xù)光照下培養(yǎng)C.sorokiniana細(xì)胞( Baker，A.L.，R.R.Schmidt(1963)Biochim.Biophys.Acta.7475-83)。在Sharples離心機(jī)中通過(guò)30,000rpm下離心作用收獲4.0OD640的細(xì)胞，在10mM Tris(pH8.5，4℃)中洗滌兩次。把沉淀的細(xì)胞(130g)貯藏在-20℃的250ml離心瓶中備用。采用對(duì)Yeung等(見(jiàn)上文)的改進(jìn)方法完成NADP-GDH的純化。對(duì)其方法的改進(jìn)之處包括用Sephadex G-200凝膠(Pharmacia)代替凝膠過(guò)濾柱中的G-150凝膠，向凝膠過(guò)濾緩沖液和所有后繼貯存緩沖液中添加作為穩(wěn)定劑的NADP+至終濃度為0.1mM。作為最后一項(xiàng)改進(jìn)，省去NADP+親和樹(shù)脂步驟，代之以制備型非變性PAGE步驟(Miller，P.W.，W.D.Dunn，R.R.SchmidtBioRad US/EG Bulletin 1987)。
GDH脫氨基酶分析溶液組成為44mM Tris，20.4mM谷氨酸和1.02mM NADP+，pH8.8。胺化分析溶液組成為50mM Tris，25mMα-酮戊二酸，0.357mM NADPH和0.356M(NH4)2SO4，pH7.4。一個(gè)酶活性單位定義為38.5℃下，每分鐘還原或氧化1.0μ mol NADP+或NADPH所需的NADP-GDH的量。
收集具有NADP-GDH活性的Sephadex G-200柱級(jí)分，經(jīng)Diaflow過(guò)濾而濃縮。通過(guò)添加DTT至終濃度為10mM來(lái)保護(hù)可溶酶(68mg)使之免受氧化，并使該酶在28.8mM Tris，192mM甘氨酸，2mM DTT(pH8.4)中滲析30分鐘。4℃下于20,000g下離心10分鐘來(lái)澄清滲析液，并使其與3ml 40％(w/v)蔗糖和1ml 0.02％溴酚藍(lán)混合。
為進(jìn)行制備型非變性PAGE，將3cm高的7％丙烯酰胺(w/v，28丙烯酰胺0.735雙丙烯酰胺，pH8.8)分離膠和2cm高的2％丙烯酰胺(w/v，1.6丙烯酰胺0.4雙丙烯酰胺，pH6.6)堆積膠澆注于Model 491 Prep Cell的28mm ID凝膠管中。所有丙烯酰胺原料都用AG501-X8混合床樹(shù)脂進(jìn)行過(guò)預(yù)處理以除去任何污染的丙烯酸殘基，從而防止電泳過(guò)程中蛋白質(zhì)的體外N-?；⒌鞍讟悠吩?5mA穩(wěn)定功率下電泳20分鐘，然后在30mA穩(wěn)定功率下電泳3.5小時(shí)。收集6ml級(jí)分并分析其NADP-GDH脫氨基活性，匯集含GDH的級(jí)分。利用Diaflow超濾把10mM KPO4(pH6.2)，0.1mM NADP+中匯集的級(jí)分中的酶濃縮至1mg/ml，濃度測(cè)定采用Bradford的方法，將BSA用作標(biāo)準(zhǔn)物。將濃縮的酶制劑貯存于-20℃。通過(guò)銀染色法測(cè)定該制劑的純度，采用該方法是為顯示被10％(w/v)Tris-Tricine SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)(Schagger，H.，G.von JagowAnal.Biochem.166368-379)。
按照Bascomb和Schmidt(同上文)所述，從下述細(xì)胞的混合物純化NADP-GDHβ-同工酶于1mM銨培養(yǎng)基中培養(yǎng)240分鐘(14g)、1mM銨培養(yǎng)基中培養(yǎng)90分鐘、于29mM銨培養(yǎng)基中培養(yǎng)20、40、60和80分鐘(每個(gè)時(shí)刻1g)。采用對(duì)Yeung等(見(jiàn)上文)的方法進(jìn)行縮小的改進(jìn)方法，對(duì)NADP-GDHβ-同工酶進(jìn)行部分純化。將DEAE Sephacel離子交換柱(pH7.4，和pH7.6)縮小為40ml柱體積，用400ml線性KCl梯度(0-0.4M)洗脫3ml級(jí)分中的蛋白質(zhì)。把含NADP-GDH的pH6 DEAE離子交換柱級(jí)分混入2種匯集物中；相應(yīng)于NADP-GDH活性峰的前沿部和尾部。如前所述(Bascomb和Schmidt，見(jiàn)上文)，在10mM KPO4(pH6.2)，2mM DTT中把分別匯集的級(jí)分滲析16小時(shí)，用Type 3 NADP+親和凝膠(Pharmacia)進(jìn)行親和純化。通過(guò)Diaflow超濾濃縮匯集級(jí)分中的NADP-GDH，至2mg/ml蛋白，蛋白濃度測(cè)定用Bradford的方法(Bradford，M.M.Anal.Biochem.72248-254)，于4℃貯存?zhèn)溆谩Ｓ?％(w/v)Tris-TricineSDS-PAGE分離蛋白質(zhì)之后，用銀染色法測(cè)定制劑的純度。
表1歸納了測(cè)定的α-和β-均六聚體同工酶胺化反應(yīng)兩者的Km值。
表1GDH同工型 底物 Km值(mM)α-均六聚體NADPH 0,14NH4+0.02-3.5α-酮戊二酸 0.35*β-均六聚體NADPH 0.14NH4+77α-酮戊二酸 12*按照Shatilov，V.R.，W.L.Kretovich(1977)Mol.Cell Biochem.15201-212。
表2歸納了測(cè)定的α-和β-均六聚體同工酶脫氨基反應(yīng)兩者的Km值。
表2GDH同工型 底物Km值(mM)α-均六聚體NADP+0.04谷氨酸 38.2β-均六聚體NADP+0.04谷氨酸 32.3α-、β-雜六聚體的活性。還在240分鐘誘導(dǎo)期內(nèi)用飽和水平的底物測(cè)定了天然NADP-GDH同工酶(由不同比例的α-和β-亞基組成的雜六聚體)的混合物的胺化和脫氨基活性(圖1)。胺化和脫氨基活性分別顯示20-40分鐘的起始誘導(dǎo)延滯期。胺化活性在前100分鐘迅速上升，在100-140分鐘急劇下降，在140-240分鐘又一次急劇上升。形成對(duì)比的是，脫氨基活性在起始誘導(dǎo)延滯期之后幾乎以線性方式上升。
在29mM銨培養(yǎng)基中的240分鐘誘導(dǎo)期過(guò)程中，還在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳之后利用Western印跡免疫檢測(cè)法檢測(cè)同工酶中Chlorellasorokiniana NADP-GDHα-和β-亞基的積累模式(圖2)。在T0時(shí)刻檢測(cè)到NADP-GDHβ-亞基，前40分鐘內(nèi)上升，然后在剩余的誘導(dǎo)期逐漸下降。α-亞基最初是在第20分鐘測(cè)到的。前80分鐘該亞基以低速率積累，在80-100分鐘顯示出明顯增大，然后在剩余的誘導(dǎo)期內(nèi)以低速率呈線性方式積累。從β-亞基為主要種類到α-亞基為主要種類的轉(zhuǎn)變發(fā)生在60-80分鐘。
計(jì)算胺化∶脫氨基活性比以及α∶β亞基比例，目的是確定在誘導(dǎo)期的時(shí)間過(guò)程中，NADP-GDH同工酶混合物中亞基比例的變化是否與預(yù)期的胺化∶脫氨基活性比相關(guān)。出乎意料的是，在60分鐘觀察到最高的胺化∶脫氨基比，此時(shí)亞基比例顯示出β-亞基為主要的NADP-GDH抗原；而當(dāng)胺化∶脫氨基活性比最低時(shí)，α-亞基為主要形式。后一結(jié)果是事先沒(méi)有預(yù)料到的。
這一發(fā)現(xiàn)之前，根據(jù)對(duì)純化的α-和β-均六聚體的底物動(dòng)力學(xué)研究，人們假設(shè)對(duì)銨具有非常高親和力的α-均六聚體(相對(duì)于β-均六聚體)是具有最高胺化活性(即用于谷氨酸合成的生物合成能力)的同工酶形式。這些結(jié)果預(yù)示著，各亞基胺按其在均-和雜六聚體中的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)獨(dú)立起作用。
通過(guò)比較29mM銨培養(yǎng)基中240分鐘誘導(dǎo)期內(nèi)胺化∶脫氨基活性比與α∶β亞基比例，顯示出這些比例的最大值之間的出乎意料的關(guān)系(表3)。
表3 C.sorokiniaha細(xì)胞中銨誘導(dǎo)期內(nèi)，NADP-GDH胺化∶脫氨基活性和α-亞基∶β-亞基比例。
表3時(shí)間(分鐘)胺化∶脫氨基活性α∶β亞基0 2.870.2820 2.960.5840 3.810.4960 4.510.8080 3.491.571002.738.741401.6111.232401.1334.79在第60分鐘出現(xiàn)胺化∶脫氨基比的峰值，此時(shí)β-亞基是主要的但不是唯一的抗原；而當(dāng)胺化∶脫氨基比最低時(shí)，α-亞基是主要的。令人感興趣的是，當(dāng)兩種亞基都存在時(shí)胺化活性最高，這預(yù)示著由α-和β-亞基組合形成的雜六聚體會(huì)具有比均六聚體更高的胺化活性。根據(jù)純化的α-均六聚體比β-均六聚體對(duì)銨的Km值低得多，以前已有預(yù)測(cè)指出，α-均六聚體比由兩種亞基組成的任何雜六聚體具有更高的胺化活性(Bascomb和Schmidt，1987)。
實(shí)施例2-多肽和多核苷酸測(cè)序成熟亞基的氨基端測(cè)序。用8％(w/v)Tris-Tricine SDS-PAGE對(duì)純化的NADP-GDHα-亞基(120pmol)制品的一個(gè)等分試樣以及NADP-GDHα-亞基(80pmol)和β-亞基(50pmol)的部分純化制品進(jìn)行分離，并如Plough等所述(Plough，M.，A.L.Jensen，V.Barkholt Anal.Biochem.18133-39 )電印跡到PVDF膜(Immobilon-PSQ，Millipore)上。為防止蛋白質(zhì)氨基端殘基的體外?；?，用AG501-X8混合床樹(shù)脂對(duì)PAGE中采用的所有聚丙烯酰胺溶液進(jìn)行處理以除去污染的丙烯酸。用Applied Biosystems，Inc.470A型氣相測(cè)序儀進(jìn)行自動(dòng)Edman降解氨基序列分析。用RP-HPLC鑒定PTH-aa衍生物。由佛羅里達(dá)大學(xué)the Interdisciplinary Center for BiotechnologyResearch Protein Chemistry Core facility提供對(duì)電印跡的蛋白質(zhì)的蛋白序列分析。
測(cè)定出α-亞基的N端序列如下AVSLEEQISAMDATTGDFTA(SEQ ID NO.5)。測(cè)定出β-亞基的N端序列如下DATTGDFTAL(SEQ IN NO.6)。這些序列相同于在兩個(gè)NADP-GDH cDNAs中鑒定的ORF，并指出了被用來(lái)除去葉綠體導(dǎo)向肽序列的內(nèi)部切割位點(diǎn)的位置。葉綠體導(dǎo)向肽序列(或葉綠體-轉(zhuǎn)運(yùn)肽)可與這些和其它氨基酸序列用于細(xì)胞區(qū)室定位。編碼這些葉綠體-轉(zhuǎn)運(yùn)肽的多核苷酸序列可與其它多核苷酸序列一起使用來(lái)編碼葉綠體-轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
cDNA分離和測(cè)序。將-70℃下貯藏的C.sorokiniana細(xì)胞沉淀物按1-10(w/v)重懸于RNA斷裂緩沖液中0.1M Tris(pH8.5)，0.4MLiCl，10mM EGTA，5mM EDTA，100肝素鈉(Sigma，100單位/mg)單位/ml，和1mM金精三羧酸(Sigma)。4℃、7000g下離心細(xì)胞懸浮物5分鐘，棄去上清液。將細(xì)胞沉淀物按1-10(w/v)重懸于RNA斷裂緩沖液中并通過(guò)20,000p.s.i.下的弗氏壓碎器而進(jìn)行破碎。將細(xì)胞勻漿物收集在一次性的50ml錐形管(它含有0.05倍體積20％(w/v)SDS，0.05倍體積0.5M EDTA(pH8)，200μg蛋白酶K/ml)，并使它在室溫下保溫15分鐘。向勻漿物中添加1/2體積的TE緩沖液(Tris 10mMEDTA 1mM，pH8.0)平衡過(guò)的酚，保溫3分鐘之后添加1/2體積的氯仿∶異戊醇(24∶1，v/v)，在擺環(huán)式振蕩器中混合10分鐘。把提取出的均漿物轉(zhuǎn)入30ml硅烷化Corex管中，在4℃、1000g下離心10分鐘。除去上層水相，并如上所述用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1，v/v)反復(fù)提取，直到水界面清晰為止。最終提取之后，合并水相和等體積的2X LiCl-脲緩沖液(4M LiCl，4M脲，2mMEDTA，1mM金精三羧酸；Sigma)，4℃下在冰上沉淀RNA 16小時(shí)。4℃、4000g下離心RNA沉淀物20分鐘，用1X LiCl-脲緩沖液漂洗所得沉淀物一次，再次離心以沉淀RNA。將RNA沉淀物溶于TE(pH7.5)中，用分光光度法在260nm下對(duì)等分試樣進(jìn)行定量。定量后，用oligo(dT)旋柱試劑盒(Spin Column kit)從全部細(xì)胞RNA中分離mRNA級(jí)分。合并每一制備物中的Poly(A)+RNA(50μg)并用于委托λUni-ZAP XRC.sorokiniana cDNA文庫(kù)的商業(yè)生產(chǎn)(Stratagene CloningSystems，Palo Alto，CA)。
將擴(kuò)增的λZAP文庫(kù)(含2×1010pfu/ml)以50,000pfu/板的量鋪于20個(gè)150mm培養(yǎng)板上，共篩選1×106個(gè)pfu。把噬菌斑吸到雙Hybond-N 132mm圓形膜上，并按Amersham的噬斑印跡方案進(jìn)行處理(1985，Amersham International plc.Arlington Heights，IL)。在一個(gè)普通容器中，使膜在40℃下雜交于200ml的2X PIPES(0.8MNaCl，20mM PIPES，pH6.5)，50％(w/v)甲酰胺，0.5％(w/v)SDS，100μg/ml變性剪切的鮭精DNA中。在42℃、10個(gè)熱封袋(4個(gè)膜/袋)中，將封閉的膜雜交于在實(shí)驗(yàn)室搖擺器上的預(yù)雜交緩沖液中，該緩沖液含有1×106cpm/膜的32P-標(biāo)記的NADP-GDH 242bp HCRcDNA探針。50℃下洗滌這些膜三次，每次用200ml的0.1×SSC，0.1％(w/v)SDS洗20分鐘。把雙膜包在塑料紙中，在-70℃下在KodakX-Omat AR膠片中暴露28小時(shí)。從板上取下雙膜上檢測(cè)到的推定NADP-GDH cDNA噬斑，用242bp保守區(qū)探針通過(guò)二級(jí)和三級(jí)篩選純化噬斑。把初級(jí)篩選中選擇的推定NADP-GDH cDNA噬菌體克隆合并，用32P-標(biāo)記的130bp Eco RI/Bgl II cDNA片斷(分離自最完整5′端NADP-GDH cDNA克隆的5′端)進(jìn)行第二次篩選。把10個(gè)噬斑純NADP-GDH克隆亞克隆在pBluescript KS+(Stratagene)中，通過(guò)Stratagene提供的體內(nèi)切除方案轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH 5 αF′(Bethesda Research Laboratories，BRL)。所有質(zhì)粒分離過(guò)程如Kraft等所述(Kraft，R.，J.Tardiff，K.S.Krauter，L.A.LeinwandBiotechniques 6544-547)。序列分析顯示，所有10個(gè)克隆在3′端上是相同的，在5′端因不同程度的截短而有區(qū)別。具有完整3′端、稱為pBGDc 53的最長(zhǎng)cDNA克隆(SEQ ID NO.7)的長(zhǎng)度不足以編碼任一亞基；因此，用RACE PCR測(cè)定5′端序列。
利用用于快速擴(kuò)增cDNA末端的改進(jìn)的錨式PCR方法克隆5′端NADP-GDH cDNA序列(Frohman，M.A.見(jiàn)D.H.Gelford，J.J.Snincky，T.J.White，eds，PCR Protocols，Academic Press，San Diego，CA，pp 28-38；Jain，R.，R.H.Gorner，J.J.MurtaghBiotechniques1258-59)。合成λZAP文庫(kù)中所用的poly(A)+RNA混合物被用來(lái)克隆NADP-GDH mRNA的5′端。把100ng該mRNA混合物和10ng為與NADP-GDH mRNAs的保守區(qū)雜交而設(shè)計(jì)的基因特異性引物(5′-CTCAAAGGCAAGGAACTTCATG-3′，SEQ ID NO.8)混合，加熱5分鐘并在冰上冷卻。按照生產(chǎn)者的方案使用SuperscriptTM逆轉(zhuǎn)錄酶(BRL)進(jìn)行第一鏈DNA合成。終止的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物用1單位的核糖核酸酶在37℃下處理20分鐘，95℃下5分鐘，用氯仿∶異戊醇(24∶1，v/v)提取一次。通過(guò)2000rpm下在Ultrafree-MC filterfuge管(30,000Mw截?cái)嘀?，Millipore)中離心來(lái)除去過(guò)量的引物和dNPs，把保留物在一個(gè)Savant Speedvac上濃縮至10μl。將第一鏈合成產(chǎn)物與10μl加尾混合物(1×加尾緩沖液[Promega Corp.]，0.4mMdATP，10單位的末端脫氧轉(zhuǎn)移酶)混合，37℃下保溫10分鐘。把反應(yīng)混合物加熱至95℃保持5分鐘，用TE(pH8)稀釋至0.5ml，用作cDNA庫(kù)。按Jain等(見(jiàn)上文)所述方法擴(kuò)增一種混合物，該混合物含5μl的cDNA庫(kù)、5μl的VentTM聚合酶10×緩沖液(New EnglandBiolabs)、200μM各種dNTP、25pmol基因特異性引物(SEQ IDNO.8)、5pmol poly(dT)銜接子引物(5′-GGGTCGACATTCTAGACAGAATTCGTGGATCC(T)18-3′；SEQ IDNO.9)、0.2單位PerfectmatchTMDNA聚合酶增強(qiáng)子(Stratagene)、1單位VentTM聚合酶(NEB)，體積為50μl。通過(guò)2,000rpm下在Ultrafree-MC單元離心來(lái)從過(guò)剩引物中純化PCR引物。收集保留物，在每一步利用一種新的嵌套式基因特異性引物(分別為5′-GGACGAGTACTGCACGC-3′，SEQ ID NO.10；5′-GATCTCGGTCAGCAGCTG-3′，SEQ ID NO.11)和一個(gè)銜接子引物(5′-GGGTCGACATTCTAGACAGAA-3′；SEQ IDNO.12)來(lái)進(jìn)行另外兩輪擴(kuò)增。在Model 480熱循環(huán)儀(Perkin-ElmerCetus)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用佛羅里達(dá)大學(xué)的ICBR DNA合成設(shè)施合成所有的委托寡核苷酸。在100μl反應(yīng)體積中，標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)混合物含有10μl的10X VentTM聚合酶緩沖液，100μM每一dNTP，0.4單位PerfectmatchTM，50pmol每一引物，1單位VentTMDNA聚合酶。凝膠純化5′RACE-PCR產(chǎn)物，亞克隆至pUC18的SmaI位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α用于進(jìn)一步鑒定。RACE PCR鑒定了兩個(gè)5′cDNA克隆，它們與以前鑒定的pBGDc53克隆重疊，兩克隆相差42nt的插入片斷，在稱為pRGDc60的一個(gè)克隆(SEQ ID NO.13)中鑒定到該42nt插入片斷，在稱為pRGDc61的第二個(gè)cDNA(SEQ ID NO.14)中則沒(méi)有。
由mRNA通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增來(lái)構(gòu)建缺少RACE PCR多接頭、但具有相應(yīng)于pRGDc60和61的完整5′端的另兩個(gè)cDNA克隆，其中使用前述反應(yīng)條件和基因特異性引物對(duì)(5′-CTTTCTGCTCGCCCTCTC-3′，SEQ ID NO.15，和SEQ IDNO.11，見(jiàn)上述)。把兩個(gè)PCR產(chǎn)物克隆到pBluescript SK+(Stratagene)的SmaI位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α用于進(jìn)一步鑒定。具有該42nt插入片斷的cDNA克隆被稱為pGDc63(SEQ ID NO.16)，而缺少該插入片斷的cDNA稱為pGDc64(SEQ ID NO.17)。
通過(guò)用限制酶處理帶有EcoRI/ApaLI的pGDc63和64、凝膠純化所得(分別為264bp；222bp)片斷來(lái)構(gòu)建全長(zhǎng)NADP-GDH cDNAs。把凝膠純化的片斷連接到pBGDc53的純化的ApaLI/XhoI限制片斷上，對(duì)全長(zhǎng)連接產(chǎn)物(SEQ ID NO.18；SEQ ID NO.19)進(jìn)行凝膠瓊脂糖凝膠純化并用于后繼PCR反應(yīng)中。
α-和β-均六聚體在大腸桿菌中的表達(dá)。使用凝膠純化的產(chǎn)物(SEQ ID NO.18)進(jìn)行PCR誘變，以從全長(zhǎng)cDNA除去葉綠體導(dǎo)向信號(hào)，產(chǎn)生特異性編碼成熟α-和β-亞基的cDNA。設(shè)計(jì)兩套引物對(duì)來(lái)合成α-和β-GDH亞基基因。
設(shè)計(jì)下列引物來(lái)向加工過(guò)的成熟α-NADP-GDH亞基的氨基端(丙氨酸-41)添加一個(gè)蛋氨酸以起始翻譯并產(chǎn)生用于亞克隆目的的5′NdeI位點(diǎn)5′-CATATGGCCGTCTCGCTGGAGGAG-3′(SEQ ID NO.20)。設(shè)計(jì)如下的第二個(gè)引物以在內(nèi)源TAA終止密碼子的3′的20nt處雜交到模板DNA的3′端5′-GTTGGATTGCCGGTGAGCC-3′(SEQ ID NO.21)。
設(shè)計(jì)如下引物來(lái)向加工過(guò)的成熟β-亞基的氨基端(天冬氨酸-38)添加一個(gè)蛋氨酸以起始翻譯并產(chǎn)生用于亞克隆目的的5′NdeI位點(diǎn)5′-CATATGGACGCCACCACCGGC-3′(SEQ IDNO.22)。用于PCR擴(kuò)增的第二個(gè)3′引物是對(duì)α-亞基擴(kuò)增所述的3′端引物(SEQ ID NO.21)。
PCR循環(huán)條件如下95℃，50秒；64℃，1分鐘；72℃，1分鐘35秒(30個(gè)循環(huán))。引物、dNTP、Vent聚合酶和其它反應(yīng)成分的濃度如前所述。對(duì)1506 bp α-NADP-GDH亞基基因(SEQ IDNO.23)和1473bp β-GDH亞基基因(SEQ ID NO.25)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化，通過(guò)把純化的片斷與100μ M dATP和Taq聚合酶在72℃下保溫15分鐘而產(chǎn)生3′腺嘌呤核苷酸突出端。把修飾的PCR產(chǎn)物克隆入PCRII T/A克隆用載體(Invitrogen)并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞。通過(guò)藍(lán)-白篩選來(lái)選擇帶有插入片斷的克隆，進(jìn)行質(zhì)粒純化，用NdeI/BamHI消化以在克隆用載體中選擇正確方向。用NdeI和BamHI(由載體提供的BamHI位點(diǎn))對(duì)選擇的質(zhì)粒進(jìn)行限制處理，在用NdeI/BamHI線性化的pET 11a和pET 15b細(xì)菌表達(dá)載體(Novagen)的IPTG可誘導(dǎo)T7聚合酶啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行定向克隆，并轉(zhuǎn)化入DH5α。通過(guò)NdeI/BamHI限制酶切分析篩選轉(zhuǎn)化體，選擇帶有正確定向的α-和β-亞基cDNAs(SEQ ID NO23；SEQ ID NO.25)的克隆，進(jìn)行質(zhì)粒純化，為進(jìn)行蛋白表達(dá)而轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21(DE3)。
用100mM IPTG誘導(dǎo)用pET 11a-α-cDNA和pET 11a-β-cDNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化過(guò)的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞1小時(shí)。用酶分析法檢測(cè)得自誘導(dǎo)細(xì)胞的蛋白提取物的NADP-GDH活性，用SDS凝膠電泳分離變性蛋白，用考馬斯染色法使之可視化。由成熟α-亞基cDNA(SEQ ID NO.23)和β-亞基cDNA(SEQ ID No.25)表達(dá)的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO.24(α-亞基)和SEQ ID NO.26(β-亞基)中所示的氨基酸序列。通過(guò)與兔抗-小球藻屬NADP-GDH抗體的交叉反應(yīng)性證實(shí)了重組GDH亞基。
在不是為最大誘導(dǎo)而最優(yōu)化過(guò)的條件下，具有α-和β-GDHcDNAs、用IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌細(xì)胞與未誘導(dǎo)的對(duì)照相比，NADP-GDH活性分別提高了60和7,000倍。這時(shí)正在分析重組α-和β-NADP-GDHs，以證實(shí)動(dòng)力學(xué)和生物化學(xué)性質(zhì)。
C.sorokiniana葉綠體GDHs的超量表達(dá)和組裝入活性酶中提供了證據(jù)，即經(jīng)PCR工程化的DNA構(gòu)建物被轉(zhuǎn)錄并被翻譯成真實(shí)的蛋白質(zhì)。然后將前述構(gòu)建物用于藻類GDHs在轉(zhuǎn)基因植物中的胞質(zhì)表達(dá)。
植物的轉(zhuǎn)化。用來(lái)產(chǎn)生表達(dá)高含量特異性GDH的遺傳轉(zhuǎn)化植物的方法需要把雙鏈重組DNA分子導(dǎo)入植物細(xì)胞的核基因組。該DNA分子必須(1)含有被導(dǎo)入植物細(xì)胞的編碼GDH酶的結(jié)構(gòu)DNA；(2)具有一種啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子的作用是在植物中以組成型或組織特異性方式調(diào)節(jié)通過(guò)RNA聚合酶進(jìn)行的RNA序列的產(chǎn)生；(3)具有一個(gè)3′-非翻譯區(qū)，它的作用是導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止和向RNA的3′端添加聚腺苷酸化核苷酸。所得初級(jí)RNA分子隨后在核中被加工，這一加工過(guò)程包括去除內(nèi)含子序列和向mRNA的3′端添加聚腺苷酸化核苷酸。
在本發(fā)明中有用的啟動(dòng)子是那些在需要谷氨酸產(chǎn)生或分解代謝時(shí)能以組成方式或組織特異性方式引起轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。有用的組成型啟動(dòng)子的一個(gè)例子是以組織獨(dú)立性方式指導(dǎo)RNA合成的CaMV增強(qiáng)的35S啟動(dòng)子。能導(dǎo)致在種子、莖、根、葉或者這些組織的特定細(xì)胞類型中特異性地產(chǎn)生GDH的啟動(dòng)子在本發(fā)明中是有用的。例如，種子特異性的Phaseolin啟動(dòng)子是一個(gè)這樣的組織特異性啟動(dòng)子。因此，可以獲得并在本發(fā)明中使用用于玉米、小麥、大麥和大米的天然啟動(dòng)子以及得自其它生物體、以組成型/組織特異性方式起作用的異源啟動(dòng)子。
內(nèi)含子。通常，當(dāng)內(nèi)含子序列插在啟動(dòng)子序列和結(jié)構(gòu)基因序列之間時(shí)可以獲得在單子葉植物中的最優(yōu)表達(dá)。這種內(nèi)含子序列的一個(gè)例子是WO93/19189中描述的HSP 70內(nèi)含子。
聚腺苷酸化信號(hào)。本發(fā)明的DNA構(gòu)建物可以具有一個(gè)3′非翻譯區(qū)，其在植物中的作用是指導(dǎo)把聚腺苷酸化核苷酸添加到RNA的3′端。合適的3′非翻譯區(qū)的一個(gè)例子是農(nóng)桿菌屬根瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒的聚腺苷酸化信號(hào)，即胭脂氨酸合成酶(NOS)基因。
質(zhì)體導(dǎo)向序列。本發(fā)明的DNA構(gòu)建物可任選含有質(zhì)體導(dǎo)向序列。該質(zhì)體導(dǎo)向序列指導(dǎo)蛋白質(zhì)向質(zhì)體中的運(yùn)輸，并在輸入過(guò)程中被去除。該質(zhì)體導(dǎo)向序列可以是但不局限于在編碼前體蛋白的C.sorokinianaNADP-GDH全長(zhǎng)cDNAs中鑒定的天然葉綠體導(dǎo)向肽(CTP)。選擇的質(zhì)體導(dǎo)向序列和成熟α-和β-NADP-GDH亞基序列的融合體可用標(biāo)準(zhǔn)方法制備并用于本發(fā)明。通常在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)缺少這些導(dǎo)向序列的GDH亞基。這種胞質(zhì)定位的酶在捕捉區(qū)室化于細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中的銨或谷氨酸中是有用的。
GDH基因來(lái)源。用于本發(fā)明DNA構(gòu)建物中的GDH基因可以是任何GDH基因。它不局限于上述C.sorokiniana GDH基因，盡管它們是優(yōu)選的。例如，可以使用得自細(xì)菌或真菌的GDH基因。所提供的這些實(shí)施例使用C.sorokiniana的α-和β-GDH基因的應(yīng)用，但不應(yīng)以任何方式解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，可以用各種其它基因以及變化對(duì)本文所述的基因和方法進(jìn)行修改，而不背離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍。例如，可以用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)進(jìn)行誘變和常規(guī)篩選，以產(chǎn)生缺少被輔因子NADPH調(diào)節(jié)的突變變體。
在玉米原生質(zhì)體中的瞬時(shí)表達(dá)。為檢查玉米(Zea mays)細(xì)胞中C.sorokiniana GDH亞基的表達(dá)及其組裝成活性酶的情況，構(gòu)建了載體以包含CaMV E35S啟動(dòng)子，用于成熟α-亞基(pMON21904)或β-亞基(pMON21905)的編碼序列，NOS 3′-非翻譯的聚腺苷酸化區(qū)域，以及用于在大腸桿菌中選擇的卡那霉素抗性基因。該α-和β-亞基基因以分別得自pET 11a-α-cDNA和pET 11a-β-cDNA的XbaI-EcoRI片斷的形式分離到。把該GDH基因連接到XbaI-EcoRI E35S啟動(dòng)子，NOS 3′，pMON 22072的帶卡那霉素抗性基因的區(qū)域上，得到pMON21904和pMON21905。按照Sheen等人的方法(The PlantCell Vol.3，225-245)把該DNA構(gòu)建物電穿孔到玉米和小麥原生質(zhì)體中。
分析轉(zhuǎn)化的玉米原生質(zhì)體。在冰上，把用pMON21904(α-亞基)、pMON 21905(β-亞基)、pMON21709(卡那霉素陰性對(duì)照DNA)和無(wú)DNA轉(zhuǎn)化的沉淀的各種原生質(zhì)體樣品在0.2ml GDH細(xì)胞裂解緩沖液(Yeung等，見(jiàn)上文)中解凍。把每種懸浮液中的細(xì)胞兩次勻漿30秒，在冰上冷卻，在14,000rpm下澄清10分鐘。38.5℃下，按Yeung等人(見(jiàn)上文)方法對(duì)細(xì)胞提取物進(jìn)行脫氨基方向上的分析。采用BioRad微量蛋白質(zhì)分析法按生產(chǎn)商的方案測(cè)定細(xì)胞提取物的總蛋白含量。為在不同制備物之間進(jìn)行比較，把活性對(duì)總蛋白含量進(jìn)行歸一化處理。一個(gè)GDH活性單位定義為38.5℃下、每分鐘還原1μmol NADP所需的酶量。
用對(duì)照載體pMON21709轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體(n＝3)或未轉(zhuǎn)化過(guò)的原生質(zhì)體(n＝3)沒(méi)有可檢測(cè)到的NADP-GDH活性。用pMON 21904轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體(n＝3)表現(xiàn)出3.31GDH活性單位/mg蛋白，而用pMON21905轉(zhuǎn)化過(guò)的原生質(zhì)體(n＝3)為1.96單位/mg蛋白。
用胞質(zhì)表達(dá)的C.sorokiniana α-和β-NADP-GDH基因轉(zhuǎn)化過(guò)的原生質(zhì)體表現(xiàn)出高水平的活性，這提供證據(jù)表明GDH亞基在異源植物系統(tǒng)中得到表達(dá)。另外，表達(dá)水平證明這些亞基被組裝成活性酶。一般而言，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，下列情況應(yīng)視為本發(fā)明的一部分添加到所述序列上的多余序列，或者本文所述核苷酸或氨基酸序列的片斷，這些片斷產(chǎn)生與本文中明確描述的序列功能相似或等同的多核苷酸或氨基酸序列。它們可以用本領(lǐng)域熟知技術(shù)容易而常規(guī)地產(chǎn)生，例如，對(duì)全長(zhǎng)DNA進(jìn)行時(shí)間控制的Bal31外切核酸酶消化，然后如前述實(shí)施例中所述表達(dá)所得片斷并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)篩選。此外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易接受的是，通過(guò)采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和方法把突變插入這些序列可以使所述序列的功能、性質(zhì)或用途無(wú)效。這些突變(通過(guò)暗示，它們可有效地用來(lái)消除所述序列中固有的性質(zhì)或功能)作為本發(fā)明的一部分明確地包括在內(nèi)。例如，C.sorokiniana的α-和β-亞基之間的明確區(qū)別在于α-亞基N端處的11個(gè)氨基酸的多肽序列，但β-亞基中沒(méi)有。這個(gè)序列可以影響酶對(duì)銨化合物的親和力、特異性和調(diào)節(jié)作用。因此，明顯的是，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能輕易地把適當(dāng)?shù)男蛄谢蚱涔δ艿韧锊迦?不存在的話)或去除(存在的話)，以產(chǎn)生其它GDH基因或其產(chǎn)物某些特性方面的差異。
還應(yīng)理解的是，本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅是說(shuō)明性質(zhì)的，本領(lǐng)域技術(shù)人員能根據(jù)它們作多種修飾或變化，這些修飾或變化包括在本申請(qǐng)的實(shí)質(zhì)和范圍之內(nèi)，并包括在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人信息申請(qǐng)人名稱University of Florida街道地址223 Grinter Hall城市Gainesville州/省Florida國(guó)家US郵編32611電話號(hào)碼(352)392-8929 傳真(352)392-6600(ii)發(fā)明名稱有關(guān)谷氨酸脫氫酶α-和β-亞基的新型多肽和多核苷酸及用法(iii)序列數(shù)目26(iv)通訊地址(A)地址Saliwanchik & Saliwanchik(B)街道2421 N.W.41st Street，Suite A-1(C)城市Gainesville(D)州Florida(E)國(guó)家USA(F)郵編32606(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.25(vi)當(dāng)前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S(B)申請(qǐng)日(C)分類(viii)律師/代理人信息
(A)姓名Whitlock，Ted W.
(B)注冊(cè)號(hào)36，965(C)參考/卷號(hào)UF155(ix)電信信息(A)電話(904)375-8100(B)電傳(904)372-5800(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2140個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置33.1610(xi)序列描述SEQ ID NO1CTCCTTTCTG CTCGCCCTCT CTCCGTCCCG CC ATG CAG ACC GCC CTC GTC GCC53Met Gln Thr Ala Leu Val Ala1 5AAG CCT ATC GTG GCC GCC CCG CTG GCG GCA CGC CCG CGC TGC CTC GCG101Lys Pro Ile Val Ala Ala Pro Leu Ala Ala Arg Pro Arg Cys Leu Ala10 15 20CCG TGG CCG TGC GCG TGG GTC CGC TCC GCC AAG CGC GAT GTC CGC GCC149Pro Trp Pro Cys Ala Trp Val Arg Ser Ala Lys Arg Asp Val Arg Ala25 30 35AAG GCC GTC TCG CTG GAG GAG CAG ATC TCC GCG ATG GAC GCC ACC ACC197Lys Ala Val Ser Leu Glu Glu Gln Ile Ser Ala Met Asp Ala Thr Thr40 45 50 55GGC GAC TTC ACG GCG CTG CAG AAG GCG GTG AAG CAG ATG GCC ACC AAG245Gly Asp Phe Thr Ala Leu Gln Lys Ala Val Lys Gln Met Ala Thr Lys60 65 70GCG GGC ACT GAG GGC CTG GTG CAC GGC ATC AAG AAC CCC GAC GTG CGC293Ala Gly Thr Glu Gly Leu Val His Gly Ile Lys Asn Pro Asp Val Arg75 80 85CAG CTG CTG ACC GAG ATC TTC ATG AAG GAC CCG GAG CAG CAG GAG TTC341Gln Leu Leu Thr Glu Ile Phe Met Lys Asp Pro Glu Gln Gln Glu Phe90 95 100ATG CAG GCG GTG CGC GAG GTG GCC GTC TCC CTG CAG CCC GTG TTC GAG389Met Gln Ala Val Arg Glu Val Ala Val Ser Leu Gln Pro Val Phe Glu105 110 115AAG CGC CCC GAG CTG CTG CCC ATC TTC AAG CAG ATC GTT GAG CCT GAG437Lys Arg Pro Glu Leu Leu Pro Ile Phe Lys Gln Ile Val Glu Pro Glu120 125 130 135CGC GTG ATC ACC TTC CGC GTG TCC TGG CTG GAC GAC GCC GGC AAC CTG485Arg Val Ile Thr Phe Arg Val Ser Trp Leu Asp Asp Ala Gly Asn Leu140 145 150CAG GTC AAC CGC GGC TTC CGC GTG CAG TAC TCG TCC GCC ATC GGC CCC533Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg Val Gln Tyr Ser Ser Ala Ile Gly Pro155 160 165TAC AAG GGC GGC CTG CGC TTC CAC CCC TCC GTG AAC CTG TCC ATC ATG581Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Pro Ser Val Asn Leu Ser Ile Met170 175 180AAG TTC CTT GCC TTT GAG CAG ATC TTC AAG AAC AGC CTG ACC ACC CTG629Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Ile Phe Lys Asn Ser Leu Thr Thr Leu185 190 195CCC ATG GGC GGC GGC AAG GGC GGC TCC GAC TTC GAC CCC AAG GGC AAG677Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys200 205 210 215AGC GAC GCG GAG GTG ATG CGC TTC TGC CAG TCC TTC ATG ACC GAG CTG725Ser Asp Ala Glu Val Met Arg Phe Cys Gln Ser Phe Met Thr Glu Leu220 225 230CAG CGC CAC ATC AGC TAC GTG CAG GAC GTG CCC GCC GGC GAC ATC GGC773Gln Arg His Ile Ser Tyr Val Gln Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly235 240 245GTG GGC GCG CGC GAG ATT GGC TAC CTT TTC GGC CAG TAC AAG CGC ATC821Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Tyr Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Ile250 255 260ACC AAG AAC TAC ACC GGC GTG CTG ACC CCG AAG GGC CAG GAG TAT GGC869Thr Lys Asn Tyr Thr Gly Val Leu Thr Pro Lys Gly Gln Glu Tyr Gly265 270 275GGC TCC GAG ATC CGC CCC GAG GCC ACC GGC TAC GGC GCC GTG CTG TTT917Gly Ser Glu Ile Arg Pro Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Ala Val Leu Phe280 285 290 295GTG GAG AAC GTG CTG AAG GAC AAG GGC GAG AGC CTC AAG GGC AAG CGC965Val Glu Asn Val Leu Lys Asp Lys Gly Glu Ser Leu Lys Gly Lys Arg300 305 310TGC CTG GTG TCT GGC GCG GGC AAC GTG GCC CAG TAC TGC GCG GAG CTG1013Cys Leu Val Ser Gly Ala Gly Asn Val Ala Gln Tyr Cys Ala Glu Leu315 320 325CTG CTG GAG AAG GGC GCC ATC GTG CTG TCG CTG TCC GAC TCC CAG GGC1061Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ile Val Leu Ser Leu Ser Asp Ser Gln Gly330 335 340TAC GTG TAC GAG CCC AAC GGC TTC ACG CGC GAG CAG CTG CAG GCG GTG1109Tyr Val Tyr Glu Pro Asn Gly Phe Thr Arg Glu Gln Leu Gln Ala Val345 350 355CAG GAC ATG AAG AAG AAG AAC AAC AGC GCC CGC ATC TCC GAG TAC AAG1157Gln Asp Met Lys Lys Lys Asn Asn Ser Ala Arg Ile Ser Glu Tyr Lys360 365 370 375AGC GAC ACC GCC GTG TAT GTG GGC GAC CGC CGC AAG CCT TGG GAG CTG1205Ser Asp Thr Ala Val Tyr Val Gly Asp Arg Arg Lys Pro Trp Glu Leu380 385 390GAC TGC GAG GTG GAC ATC GCC TTC CCC TGC GCC ACC CAG AAC GAG ATC1253Asp Cys Gln Val Asp Ile Ala Phe Pro Cys Ala Thr Gln Asn Glu Ile395 400 405GAT GAG CAC GAC GCC GAG CTG CTG ATC AAG CAC GGC TGC CAG TAC GTG1301Asp Glu His Asp Ala Glu Leu Leu Ile Lys His Gly Cys Gln Tyr Val410 415 420GTG GAG GGC GCC AAC ATG CCC TCC ACC AAC GAG GCC ATC CAC AAG TAC1349Val Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Thr Asn Glu Ala Ile His Lys Tyr425 430 435AAC AAG GCC GGC ATC ATC TAC TGC CCC GGC AAG GCG GCC AAC GCC GGC1397Asn Lys Ala Gly Ile Ile Tyr Cys Pro Gly Lys Ala Ala Asn Ala Gly440 445 450 455GGC GTG GCG GTC AGC GGC CTG GAG ATG ACC CAG AAC CGC ATG AGC CTG1445Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Thr Gln Asn Arg Met Ser Leu460 465 470AAC TGG ACT CGC GAG GAG GTT CGC GAC AAG CTG GAG CGC ATC ATG AAG1493Asn Trp Thr Arg Glu Glu Val Arg Asp Lys Leu Glu Arg Ile Met Lys475 480 485GAC ATC TAC GAC TCC GCC ATG GGG CCG TCC CGC AGA TAC AAT GTT GAC1541Asp Ile Tyr Asp Ser Ala Met Gly Pro Ser Arg Arg Tyr Asn Val Asp490 495 500CTG GCT GCG GGC GCC AAC ATC GCG GGC TTC ACC AAG GTG GCT GAT GCC1589Leu Ala Ala Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe Thr Lys Val Ala Asp Ala505 510 515GTC AAG GCC CAG GGC GCT GTT TAAGCTGCCC AGGCCCAAGC CACGGCTCAC1640Val Lys Ala Gln Gly Ala Val520 525CGGCAATCCA ACCCAACCAA CTCAACGGCC AGGACCTTTT CGGAAGCGGC GCCTTTTTCC1700CAGCCAGGGC CCTCACCTGC CCTTTCATAA CCCTGCTATT GCCGCCGTGC CCCTGCAATT1760CCACCCCAAG AAGAACTAGC GGCACTTGAC TGCATCAGGA CGGCTATTTT TTTCGCGACG1820CGCGCTCACC CCGAGAGCCT CTCTCCCCCG AGCCCTAAGC GCTGACGTCC GCCCGACTTT1880GCCTCGCACA TCGCTCGGTT TTGACCCCCT CCAGTCTACC CACCCTGTTG TGAAGCCTAC1940CAGCTCAATT GCCTTTTAGT GTATGTGCGC CCCCTCCTGC CCCCGAATTT TCCTGCCATG2000AGACGTGCGG TTCCTAGCCT GGTGACCCCA AGTAGCAGTT AGTGTGCGTG CCTTGCCCTG2060CGCTGCCCGG GATGCGATAC TGTGACCTGA GAGTGCTTGT GTAAACACGA CGAGTCAAAA2120AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA2140(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特性(A)長(zhǎng)度526個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Gln Thr Ala Leu Val Ala Lys Pro Ile Val Ala Ala Pro Leu Ala1 5 10 15Ala Arg Pro Arg Cys Leu Ala Pro Trp Pro Cys Ala Trp Val Arg Ser20 25 30Ala Lys Arg Asp Val Arg Ala Lys Ala Val Ser Leu Glu Glu Gln Ile35 40 45Ser Ala Met Asp Ala Thr Thr Gly Asp Phe Thr Ala Leu Gln Lys Ala50 55 60Val Lys Gln Met Ala Thr Lys Ala Gly Thr Glu Gly Leu Val His Gly65 70 75 80Ile Lys Asn Pro Asp Val Arg Gln Leu Leu Thr Glu Ile Phe Met Lys85 90 95Asp Pro Glu Gln Gln Glu Phe Met Gln Ala Val Arg Glu Val Ala Val100 105 110Ser Leu Gln Pro Val Phe Glu Lys Arg Pro Glu Leu Leu Pro Ile Phe115 120 125Lys Gln Ile Val Glu Pro Glu Arg Val Ile Thr Phe Arg Val Ser Trp130 135 140Leu Asp Asp Ala Gly Asn Leu Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg Val Gln145 150 155 160Tyr Ser Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Pro165 170 175Ser Val Asn Leu Ser Ile Met Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Ile Phe180 185 190Lys Asn Ser Leu Thr Thr Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser195 200 205Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Ala Glu Val Met Arg Phe Cys210 215 220Gln Ser Phe Met Thr Glu Leu Gln Arg His Ile Ser Tyr Val Gln Asp225 230 235 240Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Tyr Leu245 250 255Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Ile Thr Lys Asn Tyr Thr Gly Val Leu Thr260 265 270Pro Lys Gly Gln Glu Tyr Gly Gly Ser Glu Ile Arg Pro Glu Ala Thr275 280 285Gly Tyr Gly Ala Val Leu Phe Val Glu Asn Val Leu Lys Asp Lys Gly290 295 300Glu Ser Leu Lys Gly Lys Arg Cys Leu Val Ser Gly Ala Gly Asn Val305 310 315 320Ala Gln Tyr Cys Ala Glu Leu Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ile Val Leu325 330 335Ser Leu Ser Asp Ser Gln Gly Tyr Val Tyr Glu Pro Asn Gly Phe Thr340 345 350Arg Glu Gln Leu Gln Ala Val Gln Asp Met Lys Lys Lys Asn Asn Ser355 360 365Ala Arg Ile Ser Glu Tyr Lys Ser Asp Thr Ala Val Tyr Val Gly Asp370 375 380Arg Arg Lys Pro Trp Glu Leu Asp Cys Gln Val Asp Ile Ala Phe Pro385 390 395 400Cys Ala Thr Gln Asn Glu Ile Asp Glu His Asp Ala Glu Leu Leu Ile405 410 415Lys His Gly Cys Gln Tyr Val Val Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Thr420 425 430Asn Glu Ala Ile His Lys Tyr Asn Lys Ala Gly Ile Ile Tyr Cys Pro435 440 445Gly Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met450 455 460Thr Gln Asn Arg Met Ser Leu Asn Trp Thr Arg Glu Glu Val Arg Asp465 470 475 480Lys Leu Glu Arg Ile Met Lys Asp Ile Tyr Asp Ser Ala Met Gly Pro485 490 495Ser Arg Arg Tyr Asn Val Asp Leu Ala Ala Gly Ala Asn Ile Ala Gly500 505 510Phe Thr Lys Val Ala Asp Ala Val Lys Ala Gln Gly Ala Val515 520 525(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2099個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置33..1568(xi)序列描述SEQ ID NO3CTCCTTTCTG CTCGCCCTCT CTCCGTCCCG CC ATG CAG ACC GCC CTC GTC GCC53Met Gln Thr Ala Leu Val Ala1 5AAG CCT ATC GTG GCC TGC GCG TGG GTC CGC TCC GCC AAG CGC GAT GTC101Lys Pro Ile Val Ala Cys Ala Trp Val Arg Ser Ala Lys Arg Asp Val10 15 20CGC GCC AAG GCC GTC TCG CTG GAG GAG CAG ATC TCC GCG ATG GAC GCC149Arg Ala Lys Ala Val Ser Leu Glu Glu Gln Ile Ser Ala Met Asp Ala25 30 35ACC ACC GGC GAC TTC ACG GCG CTG CAG AAG GCG GTG AAG CAG ATG GCC197Thr Thr Gly Asp Phe Thr Ala Leu Gln Lys Ala Val Lys Gln Met Ala40 45 50 55ACC AAG GCG GGC ACT GAG GGC CTG GTG CAC GGC ATC AAG AAC CCC GAC245Thr Lys Ala Gly Thr Glu Gly Leu Val His Gly Ile Lys Asn Pro Asp60 65 70GTG CGC CAG CTG CTG ACC GAG ATC TTC ATG AAG GAC CCG GAG CAG CAG293Val Arg Gln Leu Leu Thr Glu Ile Phe Met Lys Asp Pro Glu Gln Gln75 80 85GAG TTC ATG CAG GCG GTG CGC GAG GTG GCC GTC TCC CTG CAG CCC GTG341Glu Phe Met Gln Ala Val Arg Glu Val Ala Val Ser Leu Gln Pro Val90 95 100TTC GAG AAG CGC CCC GAG CTG CTG CCC ATC TTC AAG CAG ATC GTT GAG389Phe Glu Lys Arg Pro Glu Leu Leu Pro Ile Phe Lys Gln Ile Val Glu105 110 115CCT GAG CGC GTG ATC ACC TTC CGC GTG TCC TGG CTG GAC GAC GCC GGC437Pro Glu Arg Val Ile Thr Phe Arg Val Ser Trp Leu Asp Asp Ala Gly120 125 130 135AAC CTG CAG GTC AAC CGC GGC TTC CGC GTG CAG TAC TCG TCC GCC ATC485Asn Leu Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg Val Gln Tyr Ser Ser Ala lle140 145 150GGC CCC TAC AAG GGC GGC CTG CGC TTC CAC CCC TCC GTG AAC CTG TCC533Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Pro Ser Val Asn Leu Ser155 160 165ATC ATG AAG TTC CTT GCC TTT GAG CAG ATC TTC AAG AAC AGC CTG ACC581Ile Met Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Ile Phe Lys Asn Ser Leu Thr170 175 180ACC CTG CCC ATG GGC GGC GGC AAG GGC GGC TCC GAC TTC GAC CCC AAG629Thr Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys185 190 195GGC AAG AGC GAC GCG GAG GTG ATG CGC TTC TGC CAG TCC TTC ATG ACC677Gly Lys Ser Asp Ala Glu Val Met Arg Phe Cys Gln Ser Phe Met Thr200 205 210 215GAG CTG CAG CGC CAC ATC AGC TAC GTG CAG GAC GTG CCC GCC GGC GAC725Glu Leu Gln Arg His Ile Ser Tyr Val Gln Asp Val Pro Ala Gly Asp220 225 230ATC GGC GTG GGC GCG CGC GAG ATT GGC TAC CTT TTC GGC CAG TAC AAG773Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Tyr Leu Phe Gly Gln Tyr Lys235 240 245CGC ATC ACC AAG AAC TAC ACC GGC GTG CTG ACC CCG AAG GGC CAG GAG821Arg Ile Thr Lys Asn Tyr Thr Gly Val Leu Thr Pro Lys Gly Gln Glu250 255 260TAT GGC GGC TCC GAG ATC CGC CCC GAG GCC ACC GGC TAC GGC GCC GTG869Tyr Gly Gly Ser Glu Ile Arg Pro Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Ala Val265 270 275CTG TTT GTG GAG AAC GTG CTG AAG GAC AAG GGC GAG AGC CTC AAG GGC917Leu Phe Val Glu Asn Val Leu Lys Asp Lys Gly Glu Ser Leu Lys Gly280 285 290 295AAG CGC TGC CTG GTG TCT GGC GCG GGC AAC GTG GCC CAG TAC TGC GCG965Lys Arg Cys Leu Val Ser Gly Ala Gly Asn Val Ala Gln Tyr Cys Ala300 305 310GAG CTG CTG CTG GAG AAG GGC GCC ATC GTG CTG TCG CTG TCC GAC TCC1013Glu Leu Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ile Val Leu Ser Leu Ser Asp Ser315 320 325CAG GGC TAC GTG TAC GAG CCC AAC GGC TTC ACG CGC GAG CAG CTG CAG1061Gln Gly Tyr Val Tyr Glu Pro Asn Gly Phe Thr Arg Glu Gln Leu Gln330 335 340GCG GTG CAG GAC ATG AAG AAG AAG AAC AAC AGC GCC CGC ATC TCC GAG1109Ala Val Gln Asp Met Lys Lys Lys Asn Asn Ser Ala Arg Ile Ser Glu345 350 355TAC AAG AGC GAC ACC GCC GTG TAT GTG GGC GAC CGC CGC AAG CCT TGG1157Tyr Lys Ser Asp Thr Ala Val Tyr Val Gly Asp Arg Arg Lys Pro Trp360 365 370 375GAG CTG GAC TGC CAG GTG GAC ATC GCC TTC CCC TGC GCC ACC CAG AAC1205Glu Leu Asp Cys Gln Val Asp Ile Ala Phe Pro Cys Ala Thr Gln Asn380 385 390GAG ATC GAT GAG CAC GAC GCC GAG CTG CTG ATCAAG CAC GGC TGC CAG1253Glu Ile Asp Glu His Asp Ala Glu Leu Leu Ile Lys His Gly Cys Gln395 400 405TAC GTG GTG GAG GGC GCC AAC ATG CCC TCC ACC AAC GAG GCC ATC CAC1301Tyr Val Val Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Thr Asn Glu Ala Ile His410 415 420AAG TAC AAC AAG GCC GGC ATC ATC TAC TGC CCC GGC AAG GCG GCC AAC1349Lys Tyr Asn Lys Ala Gly Ile Ile Tyr Cys Pro Gly Lys Ala Ala Asn425 430 435GCC GGC GGC GTG GCG GTC AGC GGC CTG GAG ATG ACC CAG AAC CGC ATG1397Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Thr Gln Asn Arg Met440 445 450 455AGC CTG AAC TGG ACT CGC GAG GAGGTT CGC GAC AAG CTG GAG CGC ATC1445Ser Leu Asn Trp Thr Arg Glu Glu Val Arg Asp Lys Leu Glu Arg Ile460 465 470ATG AAG GAC ATC TAC GAC TCC GCC ATG GGG CCG TCC CGC AGA TAC AAT1493Met Lys Asp Ile Tyr Asp Ser Ala Met Gly Pro Ser Arg Arg Tyr Asn475 480 485GTT GAC CTG GCT GCG GGC GCC AAC ATC GCG GGC TTC ACC AAG GTG GCT1541Val Asp Leu Ala Ala Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe Thr Lys Val Ala490 495 500GAT GCC GTC AAG GCC CAG GGC GCT GTT TAAGCTGCCC AGGCCCAAGC1588Asp Ala Val Lys Ala Gln Gly Ala Val505 510CACGGCTCAC CGGCAATCCA ACCCAACCAA CTCAACGGCC AGGACCTTTT CGGAAGCGGC1648GCCTTTTTCC CAGCCAGGGC CCTCACCTGC CCTTTCATAA CCCTGCTATT GCCGCCGTGC1708CCCTGCAATT CCACCCCAAG AAGAACTAGC GGCACTTGAC TGCATCAGGA CGGCTATTTT1768TTTCGCGACG CGCGCTCACC CCGAGAGCCT CTCTCCCCCG AGCCCTAAGC GCTGACGTCC1828GCCCGACTTT GCCTCGCACA TCGCTCGGTT TTGACCCCCT CCAGTCTACC CACCCTGTTG1888TGAAGCCTAC CAGCTCAATT GCCTTTTAGT GTATGTGCGC CCCCTCCTGC CCCCGAATTT1948TCCTGCCATG AGACGTGCGG TTCCTAGCCT GGTGACCCCA AGTAGCAGTT AGTGTGCGTG2008CCTTGCCCTG CGCTGCCCGG GATGCGATAC TGTGACCTGA GAGTGCTTGT GTAAACACGA2068CGAGTCAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A2099(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度512個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Gln Thr Ala Leu Val Ala Lys Pro Ile Val Ala Cys Ala Trp Val1 5 10 15Arg Ser Ala Lys Arg Asp Val Arg Ala Lys Ala Val Ser Leu Glu Glu20 25 30Gln Ile Ser Ala Met Asp Ala Thr Thr Gly Asp Phe Thr Ala Leu Gln35 40 45Lys Ala Val Lys Gln Met Ala Thr Lys Ala Gly Thr Glu Gly Leu Val50 55 60His Gly Ile Lys Asn Pro Asp Val Arg Gln Leu Leu Thr Glu Ile Phe65 70 75 80Met Lys Asp Pro Glu Gln Gln Glu Phe Met Gln Ala Val Arg Glu Val85 90 95Ala Val Ser Leu Gln Pro Val Phe Glu Lys Arg Pro Glu Leu Leu Pro100 105 110Ile Phe Lys Gln Ile Val Glu Pro Glu Arg Val Ile Thr Phe Arg Val115 120 125Ser Trp Leu Asp Asp Ala Gly Asn Leu Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg130 135 140Val Gln Tyr Ser Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe145 150 155 160His Pro Ser Val Asn Leu Ser Ile Met Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln165 170 175Ile Phe Lys Asn Ser Leu Thr Thr Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly180 185 190Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Ala Glu Val Met Arg195 200 205Phe Cys Gln Ser Phe Met Thr Glu Leu Gln Arg His Ile Ser Tyr Val210 215 220Gln Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly225 230 235 240Tyr Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Ile Thr Lys Asn Tyr Thr Gly Val245 250 255Leu Thr Pro Lys Gly Gln Glu Tyr Gly Gly Ser Glu Ile Arg Pro Glu260 265 270Ala Thr Gly Tyr Gly Ala Val Leu Phe Val Glu Asn Val Leu Lys Asp275 280 285Lys Gly Glu Ser Leu Lys Gly Lys Arg Cys Leu Val Ser Gly Ala Gly290 295 300Asn Val Ala Gln Tyr Cys Ala Glu Leu Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ile305 310 315 320Val Leu Ser Leu Ser Asp Ser Gln Gly 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TTC GGC CAG TAC AAG CGC672Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Tyr Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg720 725 730 735ATC ACC AAG AAC TAC ACC GGC GTG CTG ACC CCG AAG GGC CAG GAG TAT720Ile Thr Lys Asn Tyr Thr Gly Val Leu Thr Pro Lys Gly Gln Glu Tyr740 745 750GGC GGC TCC GAG ATC CGC CCC GAG GCC ACC GGC TAC GGC GCC GTG CTG768Gly Gly Ser Glu Ile Arg Pro Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Ala Val Leu755 760 765TTT GTG GAG AAC GTG CTG AAG GAC AAG GGC GAG AGC CTC AAG GGC AAG816Phe Val Glu Asn Val Leu Lys Asp Lys Gly Glu Ser Leu Lys Gly Lys770 775 780CGC TGC CTG GTG TCT GGC GCG GGC AAC GTG GCC CAG TAC TGC GCG GAG864Arg Cys Leu Val Ser Gly Ala Gly Asn Val Ala Gln Tyr Cys Ala Glu785 790 795CTG CTG CTG GAG AAG GGC GCC ATC GTG CTG TCG CTG TCC GAC TCC CAG912Leu Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ile Val Leu Ser Leu Ser Asp Ser Gln800 805 810 815GGC TAC GTG TAC GAG CCC AAC GGC TTC ACG CGC GAG CAG CTG CAG GCG960Gly Tyr Val Tyr Glu Pro Asn Gly Phe Thr Arg Glu Gln Leu Gln Ala820 825 830GTG CAG GAC ATG AAG AAG AAG AAC AAC AGC GCC CGC ATC TCC GAG TAC1008Val Gln Asp Met Lys Lys Lys Asn Asn Ser Ala Arg Ile Ser Glu Tyr835 840 845AAG AGC GAC ACC GCC GTG TAT GTG GGC GAC CGC CGC AAG CCT TGG GAG1056Lys Ser Asp Thr Ala Val Tyr Val Gly Asp Arg Arg Lys Pro Trp Glu850 855 860CTG GAC TGC CAG GTG GAC ATC GCC TTC CCC TGC GCC ACC CAG AAC GAG1104Leu Asp Cys Gln Val Asp Ile Ala Phe Pro Cys Ala Thr Gln Asn Glu865 870 875ATC GAT GAG CAC GAC GCC GAG CTG CTG ATC AAG CAC GGC TGC GAG TAC1152Ile Asp Glu His Asp Ala Glu Leu Leu Ile Lys His Gly Cys Gln Tyr880 885 890 895GTG GTG GAG GGC GCC AAC ATG CCC TCC ACC AAC GAG GCC ATC CAC AAG1200Val Val Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Thr Asn Glu Ala Ile His Lys900 905 910TAC AAC AAG GCC GGC ATC ATC TAC TGC CCC GGC AAG GCG GCC AAC GCC1248Tyr Asn Lys Ala Gly Ile Ile Tyr Cys Pro Gly Lys Ala Ala Asn Ala915 920 925GGC GGC GTG GCG GTC AGC GGC CTG GAG ATG ACC CAG AAC CGC ATG AGC1296Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Thr Gln Asn Arg Met Ser930 935 940CTG AAC TGG ACT CGC GAG GAG GTT CGC GAC AAG CTG GAG CGC ATC ATG1344Leu Asn Trp Thr Arg Glu Glu Val Arg Asp Lys Leu Glu Arg Ile Met945 950 955AAG GAC ATC TAC GAC TCC GCC ATG GGG CCG TCC CGC AGA TAC AAT GTT1392Lys Asp Ile Tyr Asp Ser Ala Met Gly Pro Ser Arg Arg Tyr Asn Val960 965 970 975GAC CTG GCT GCG GGC GCC AAC ATC GCG GGC TTC ACC AAG GTG GCT GAT1440Asp Leu Ala Ala Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe Thr Lys Val Ala Asp980 985 990GCC GTC AAG GCC CAG GGC GCT GTT TAAGCTGCCC AGGCCCAAGC CACGGCTCAC1494Ala Val Lys Ala Gln Gly Ala Val995CGGCAATCCA AC1506(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度487個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO24Met Ala Val Ser Leu Glu Glu Gln Ile Ser Ala Met Asp Ala Thr Thr1 5 10 15Gly Asp Phe Thr Ala Leu Gln Lys Ala Val Lys Gln Met Ala Thr Lys20 25 30Ala Gly Thr Glu Gly Leu Val His Gly Ile Lys Asn Pro Asp Val Arg35 40 45Gln Leu Leu Thr Glu Ile Phe Met Lys Asp Pro Glu Gln Gln Glu Phe50 55 60Met Gln Ala Val Arg Glu Val Ala Val Ser Leu Gln Pro Val Phe Glu65 70 75 80Lys Arg Pro Glu Leu Leu Pro Ile Phe Lys Gln Ile Val Glu Pro Glu85 90 95Arg Val Ile Thr Phe Arg Val Ser Trp Leu Asp Asp Ala Gly Asn Leu100 105 110Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg Val Gln Tyr Ser Ser Ala Ile Gly Pro115 120 125Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Pro Ser Val Asn Leu Ser Ile Met130 135 140Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Ile Phe Lys Asn Ser Leu Thr Thr Leu145 150 155 160Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys165 170 175Ser Asp Ala Glu Val Met Arg Phe Cys Gln Ser Phe Met Thr Glu Leu180 185 190Gln Arg His Ile Ser Tyr Val Gln Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly195 200 205Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Tyr Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Ile210 215 220Thr Lys Asn Tyr Thr Gly Val Leu Thr Pro Lys Gly Gln Glu Tyr Gly225 230 235 240Gly Ser Glu Ile Arg Pro Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Ala Val Leu Phe245 250 255Val Glu Asn Val Leu Lys Asp Lys Gly Glu Ser Leu Lys Gly Lys Arg260 265 270Cys Leu Val Ser Gly Ala Gly Asn Val Ala Gln Tyr Cys Ala Glu Leu275 280 285Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ile Val Leu Ser Leu Ser Asp Ser Gln Gly290 295 300Tyr Val Tyr Glu Pro Asn Gly Phe Thr Arg Glu Gln Leu Gln Ala Val305 310 315 320Gln Asp Met Lys Lys Lys Asn Asn Ser Ala Arg Ile Ser Glu Tyr Lys325 330 335Ser Asp Thr Ala Val Tyr Val Gly Asp Arg Arg Lys Pro Trp Glu Leu340 345 350Asp Cys Gln Val Asp Ile Ala Phe Pro Cys Ala Thr Gln Asn Glu Ile355 360 365Asp Glu His Asp Ala Glu Leu Leu Ile Lys His Gly Cys Gln Tyr Val370 375 380Val Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Thr Asn Glu Ala Ile His Lys Tyr385 390 395 400Asn Lys Ala Gly Ile Ile Tyr Cys Pro Gly Lys Ala Ala Asn Ala Gly405 410 415Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Thr Gln Asn Arg Met Ser Leu420 425 430Asn Trp Thr Arg Glu Glu Val Arg Asp Lys Leu Glu Arg Ile Met Lys435 440 445Asp Ile Tyr Asp Ser Ala Met Gly Pro Ser Arg Arg Tyr Asn Val Asp450 455 460Leu Ala Ala Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe Thr Lys Val Ala Asp Ala465 470 475 480Val Lys Ala Gln Gly Ala Val485(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1473個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置4..1431(xi)序列描述SEQ ID NO25CAT ATG GAC GCC ACC ACC GGC GAC TTC ACG GCG CTG CAG AAG GCG GTG48Met Asp Ala Thr Thr Gly Asp Phe Thr Ala Leu Gln Lys Ala Val490 495 500AAG CAG ATG GCC ACC AAG GCG GGC ACT GAG GGC CTG GTG CAC GGC ATC96Lys Gln Met Ala Thr Lys Ala Gly Thr Glu Gly Leu Val His Gly Ile505 510 515AAG AAC CCC GAC GTG CGC CAG CTG CTG ACC GAG ATC TTC ATG AAG GAC144Lys Asn Pro Asp Val Arg Gln Leu Leu Thr Glu Ile Phe Met Lys Asp520 525 530CCG GAG CAG CAG GAG TTC ATG CAG GCG GTG CGC GAG GTG GCC GTC TCC192Pro Glu Gln Gln Glu Phe Met Gln Ala Val Arg Glu Val Ala Val Ser535 540 545 550CTG CAG CCC GTG TTC GAG AAG CGC CCC GAG CTG CTG CCC ATC TTC AAG240Leu Gln Pro Val Phe Glu Lys Arg Pro Glu Leu Leu Pro Ile Phe Lys555 560 565CAG ATC GTT GAG CCT GAG CGC GTG ATC ACC TTC CGC GTG TCC TGG CTG288Gln Ile Val Glu Pro Glu Arg Val Ile Thr Phe Arg Val Ser Trp Leu570 575 580GAC GAC GCC GGC AAC CTG CAG GTC AAC CGC GGC TTC CGC GTG CAG TAC336Asp Asp Ala Gly Asn Leu Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg Val Gln Tyr585 590 595TCG TCC GCC ATC GGC CCC TAC AAG GGC GGC CTG CGC TTC CAC CCC TCC384Ser Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Pro Ser600 605 610GTG AAC CTG TCC ATC ATG AAG TTC CTT GCC TTT GAG CAG ATC TTC AAG432Val Asn Leu Ser Ile Met Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Ile Phe Lys615 620 625 630AAC AGC CTG ACC ACC CTG CCC ATG GGC GGC GGC AAG GGC GGC TCC GAC480Asn Ser Leu Thr Thr Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp635 640 645TTC GAC CCC AAG GGC AAG AGC GAC GCG GAG GTG ATG CGC TTC TGC CAG528Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Ala Glu Val Met Arg Phe Cys Gln650 655 660TCC TTC ATG ACC GAG CTG CAG CGC CAC ATC AGC TAC GTG CAG GAC GTG576Ser Phe Met Thr Glu Leu Gln Arg His Ile Ser Tyr Val Gln Asp Val665 670 675CCC GCC GGC GAC ATC GGC GTG GGC GCG CGC GAG ATT GGC TAC CTT TTC624Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Tyr Leu Phe680 685 690GGC CAG TAC AAG CGC ATC ACC AAG AAC TAC ACC GGC GTG CTG ACC CCG672Gly Gln Tyr Lys Arg Ile Thr Lys Asn Tyr Thr Gly Val Leu Thr Pro695 700 705 710AAG GGC CAG GAG TAT GGC GGC TCC GAG ATC CGC CCC GAG GCC ACC GGC720Lys Gly Gln Glu Tyr Gly Gly Ser Glu Ile Arg Pro Glu Ala Thr Gly715 720 725TAC GGC GCC GTG CTG TTT GTG GAG AAC GTG CTG AAG GAC AAG GGC GAG768Tyr Gly Ala Val Leu Phe Val Glu Asn Val Leu Lys Asp Lys Gly Glu730 735 740AGC CTC AAG GGC AAG CGC TGC CTG GTG TCT GGC GCG GGC AAC GTG GCC816Ser Leu Lys Gly Lys Arg Cys Leu Val Ser Gly Ala Gly Asn Val Ala745 750 755CAG TAC TGC GCG GAG CTG CTG CTG GAG AAG GGC GCC ATC GTG CTG TCG864Gln Tyr Cys Ala Glu Leu Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ile Val Leu Ser760 765 770CTG TCC GAC TCC CAG GGC TAC GTG TAC GAG CCC AAC GGC TTC ACG CGC912Leu Ser Asp Ser Gln Gly Tyr Val Tyr Glu Pro Asn Gly Phe Thr Arg775 780 785 790GAG CAG CTG CAG GCG GTG CAG GAC ATG AAG AAG AAG AAC AAC AGC GCC960Glu Gln Leu Gln Ala Val Gln Asp Met Lys Lys Lys Asn Asn Ser Ala795 800 805CGC ATC TCC GAG TAC AAG AGC GAC ACC GCC GTG TAT GTG GGC GAC CGC1008Arg Ile Ser Glu Tyr Lys Ser Asp Thr Ala Val Tyr Val Gly Asp Arg810 815 820CGC AAG CCT TGG GAG CTG GAC TGC CAG GTG GAC ATC GCC TTC CCC TGC1056Arg Lys Pro Trp Glu Leu Asp Cys Gln Val Asp Ile Ala Phe Pro Cys825 830 835GCC ACC CAG AAC GAG ATC GAT GAG CAC GAC GCC GAG CTG CTG ATC AAG1104Ala Thr Gln Asn Glu Ile Asp Glu His Asp Ala Glu Leu Leu Ile Lys840 845 850CAC GGC TGC CAG TAC GTG GTG GAG GGC GCC AAC ATG CCC TCC ACC AAC1152His Gly Cys Gln Tyr Val Val Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Thr Asn855 860 865 870GAG GCC ATC CAC AAG TAC AAC AAG GCC GGC ATC ATC TAC TGC CCC GGC1200Glu Ala Ile His Lys Tyr Asn Lys Ala Gly Ile Ile Tyr Cys Pro Gly875 880 885AAG GCG GCC AAC GCC GGC GGC GTG GCG GTC AGC GGC CTG GAG ATG ACC1248Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Thr890 895 900CAG AAC CGC ATG AGC CTG AAC TGG ACT CGC GAG GAG GTT CGC GAC AAG1296Gln Asn Arg Met Ser Leu Asn Trp Thr Arg Glu Glu Val Arg Asp Lys905 910 915CTG GAG CGC ATC ATG AAG GAC ATC TAC GAC TCC GCC ATG GGG CCG TCC1344Leu Glu Arg Ile Met Lys Asp Ile Tyr Asp Ser Ala Met Gly Pro Ser920 925 930CGC AGA TAC AAT GTT GAC CTG GCT GCG GGC GCC AAC ATC GCG GGC TTC1392Arg Arg Tyr Asn Val Asp Leu Ala Ala Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe935 940 945 950ACC AAG GTG GCT GAT GCC GTC AAG GCC CAG GGC GCT GTT TAAGCTGCCC1441Thr Lys Val Ala Asp Ala Val Lys Ala Gln Gly Ala Val955 960AGGCCCAAGC CACGGCTCAC CGGCAATCCA AC1473(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度476個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO26Met Asp Ala Thr Thr Gly Asp Phe Thr Ala Leu Gln Lys Ala Val Lys1 5 10 15Gln Met Ala Thr Lys Ala Gly Thr Glu Gly Leu Val His Gly Ile Lys20 25 30Asn Pro Asp Val Arg Gln Leu Leu Thr Glu Ile Phe Met Lys Asp Pro35 40 45Glu Gln Gln Glu Phe Met Gln Ala Val Arg Glu Val Ala Val Ser Leu50 55 60Gln Pro Val Phe Glu Lys Arg Pro Glu Leu Leu Pro Ile Phe Lys Gln65 70 75 80Ile Val Glu Pro Glu Arg Val Ile Thr Phe Arg Val Ser Trp Leu Asp85 90 95Asp Ala Gly Asn Leu Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg Val Gln Tyr Ser100 105 110Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Pro Ser Val115 120 125Asn Leu Ser Ile Met Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Ile Phe Lys Asn130 135 140Ser Leu Thr Thr Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe145 150 155 160Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Ala Glu Val Met Arg Phe Cys Gln Ser165 170 175Phe Met Thr Glu Leu Gln Arg His Ile Ser Tyr Val Gln Asp Val Pro180 185 190Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Tyr Leu Phe Gly195 200 205Gln Tyr Lys Arg Ile Thr Lys Asn Tyr Thr Gly Val Leu Thr Pro Lys210 215 220Gly Gln Glu Tyr Gly Gly Ser Glu Ile Arg Pro Glu Ala Thr Gly Tyr225 230 235 240Gly Ala Val Leu Phe Val Glu Asn Val Leu Lys Asp Lys Gly Glu Ser245 250 255Leu Lys Gly Lys Arg Cys Leu Val Ser Gly Ala Gly Asn Val Ala Gln260 265 270Tyr Cys Ala Glu Leu Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ile Val Leu Ser Leu275 280 285Ser Asp Ser Gln Gly Tyr Val Tyr Glu Pro Asn Gly Phe Thr Arg Glu290 295 300Gln Leu Gln Ala Val Gln Asp Met Lys Lys Lys Asn Asn Ser Ala Arg305 310 315 320Ile Ser Glu Tyr Lys Ser Asp Thr Ala Val Tyr Val Gly Asp Arg Arg325 330 335Lys Pro Trp Glu Leu Asp Cys Gln Val Asp Ile Ala Phe Pro Cys Ala340 345 350Thr Gln Asn Glu Ile Asp Glu His Asp Ala Glu Leu Leu Ile Lys His355 360 365Gly Cys Gln Tyr Val Val Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Thr Asn Glu370 375 380Ala Ile His Lys Tyr Asn Lys Ala Gly Ile Ile Tyr Cys Pro Gly Lys385 390 395 400Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Thr Gln405 410 415Asn Arg Met Ser Leu Asn Trp Thr Arg Glu Glu Val Arg Asp Lys Leu420 425 430Glu Arg Ile Met Lys Asp Ile Tyr Asp Ser Ala Met Gly Pro Ser Arg435 440 445Arg Tyr Asn Val Asp Leu Ala Ala Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe Thr450 455 460Lys Val Ala Asp Ala Val Lys Ala Gln Gly Ala Val465 470 47權(quán)利要求
1.一種多核苷酸，它包括編碼選自SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.26的氨基酸序列的核苷酸序列，或者其片斷或突變體。
2.一種多核苷酸，它包括選自SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.3，SEQID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10，SEQ IDNO.11，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14，SEQ IDNO.15，SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.17，SEQ ID NO.18，SEQ IDNO.19，SEQ ID NO.20，SEQ ID NO.21，SEQ ID NO.22，SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.25的核苷酸序列，或者其片斷或突變體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的多核苷酸，它包括選自SEQ ID NO.1，SEQ IDNO.3，SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.25中所示核苷酸序列的核苷酸序列，或者其片斷或突變體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的多核苷酸，它形成一種能在植物細(xì)胞中表達(dá)的嵌合基因，該基因包括與該多核苷酸可操作地連接的植物可表達(dá)啟動(dòng)子。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的多核苷酸，其中該多核苷酸與一種植物聚腺苷酸化序列可操作地連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的多核苷酸，它包括至少一個(gè)編碼NADP-GDHα-亞基的核苷酸序列和至少一個(gè)編碼NADP-GDHβ-亞基的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的多核苷酸，其中所述多核苷酸進(jìn)一步包括一個(gè)用于所述編碼NADP-GDHα-亞基和NADP-GDHβ-亞基的多核苷酸的啟動(dòng)子。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的多核苷酸，其中該啟動(dòng)子對(duì)α-亞基和β-亞基有所不同。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的多核苷酸，其中所述啟動(dòng)子對(duì)α-和β-亞基具有不同的活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求6的多核苷酸，它包括一個(gè)選自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.23的核苷酸序列以及一個(gè)選自SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.25的核苷酸序列。
11.一種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它包括編碼選自SEQ ID NO.2，SEQ IDNO.4，SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.26的氨基酸序列的多核苷酸，或者其片斷或突變體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述多核苷酸編碼一個(gè)選自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.24的氨基酸序列以及一個(gè)選SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.26的氨基酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中所述多核苷酸包括一個(gè)選自SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.23和SEQ IDNO.25中所示核苷酸序列的核苷酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它包括一個(gè)選自SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.23的核苷酸序列以及一個(gè)選自SEQ ID NO.3和SEQID NO.25的核苷酸序列。
15.調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中氮代謝的方法，該方法包括轉(zhuǎn)化所述植物細(xì)胞以包括一種多核苷酸，所述多核苷酸具有選自SEQ ID NO.1，SEQ IDNO.3，SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.25的核苷酸序列，或者其片斷或突變體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述多核苷酸具有一個(gè)編碼至少一個(gè)NADP-GDHα-亞基的核苷酸序列和至少一個(gè)編碼NADP-GDHβ-亞基的核苷酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述多核苷酸包括一個(gè)選自SEQID NO.1和SEQ ID NO.23的核苷酸序列以及一個(gè)選自SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.25的核苷酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述氮調(diào)節(jié)包括提高無(wú)機(jī)氮到有機(jī)氮的同化作用。
19.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述多核苷酸與一種植物可表達(dá)啟動(dòng)子可操作地連接。
20.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述多核苷酸與一種植物聚腺苷酸化序列可操作地連接。
21.一種調(diào)節(jié)植物性質(zhì)的方法，該方法包括在所述植物中表達(dá)編碼選自SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.26的氨基酸序列的多核苷酸，或者其片斷或突變體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述多核苷酸編碼一種多肽，該多肽包括一個(gè)選自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.24的氨基酸序列以及一個(gè)選自SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.26的氨基酸序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述調(diào)節(jié)包括提高作物產(chǎn)量，改變銨的同化，改變滲透應(yīng)力耐受性，或改變植物的組成。
24.一種表達(dá)具有NADP-GDH六聚體動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的GDH的方法，該方法包括使用所述六聚體的一個(gè)亞基的氨基端序列，其中所述氨基端序列選自SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。
25.一種多肽，它包括選自SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.4，SEQ IDNO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.26的氨基酸序列，或者其片斷或突變體。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的多肽，它包括選自SEQ ID NO.2，SEQ IDNO.4，SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.26的氨基酸序列，或者其片斷或突變體。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO.2的氨基酸序列或者其片斷或突變體。
28.根據(jù)權(quán)利要求26的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO.4的氨基酸序列或者其片斷或突變體。
29.根據(jù)權(quán)利要求26的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO.24的氨基酸序列。
30.根據(jù)權(quán)利要求26的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO.26的氨基酸序列。
31.根據(jù)權(quán)利要求25的多肽，它形成β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-谷氨酸脫氫酶亞基的一個(gè)氨基端，該氨基端包括選自SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的氨基酸序列。
32.一種包括多個(gè)亞基的多肽，所述多肽具有至少一個(gè)NADP-GDHα-亞基和至少一個(gè)NADP-GDHβ-亞基。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的多肽，其中所述α-亞基包括具有選自SEQID NO.2和SEQ ID NO.24的氨基酸序列或者其片斷或突變體的多肽。
34.根據(jù)權(quán)利要求32的多肽，其中所述β-亞基包括選自SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.26的多肽。
35.根據(jù)權(quán)利要求32的多肽，其中該多肽是雜六聚體。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的多肽，其中該多肽包括至少兩個(gè)β-亞基。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的多肽，其中該多肽包括2-5個(gè)β-亞基。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的多肽，其中該多肽包括3個(gè)β-亞基。
39.一種葉綠體-轉(zhuǎn)運(yùn)肽，它具有一種氨基酸序列或其片斷，所述氨基酸序列包括選自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的氨基酸末端。
40.一種編碼葉綠體-轉(zhuǎn)運(yùn)肽的多核苷酸序列，所述核苷酸序列包括選自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3的5′端序列。
全文摘要
公開(kāi)了有關(guān)谷氨酸脫氫酶(GDH)的氨基酸和核苷酸序列。所述GDH酶是以七種不同的誘導(dǎo)同工酶形式發(fā)現(xiàn)于Chlorella sorokiniana這種藻類中。這些同工酶以由α－和β－亞基組成的葉綠體定位的六聚體形式存在于藻類中。用編碼該酶的α－或β－亞基的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的植物表現(xiàn)出改善的性質(zhì),例如,生長(zhǎng)提高和應(yīng)力耐受性的改善。具有α－亞基和β－亞基二者的雜六聚體可以比α－均六聚體或β－均六聚體具有更高的胺化:脫氨基活性比。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1198777SQ96197441
公開(kāi)日1998年11月11日 申請(qǐng)日期1996年10月3日 優(yōu)先權(quán)日1995年10月6日
發(fā)明者R·R·施密德, P·米勒 申請(qǐng)人:佛羅里達(dá)大學(xué)