一種玉米光周期敏感性候選基因zmCCA1分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種玉米光周期敏感性候選基因zmCCA1分子標(biāo)記及其應(yīng)用，提供了一種與玉米光周期敏感性候選基因zmCCA1共分離的分子標(biāo)記SSRA489；并且提供了可擴(kuò)增分子標(biāo)記SSRA489的引物對(duì)；所述的調(diào)控玉米光周期敏感性候選基因zmCCA1共分離的分子標(biāo)記的方法為：以玉米總DNA為模板，用所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性的6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，將目的條帶的大小與分子標(biāo)記進(jìn)行對(duì)比，從而根據(jù)分子標(biāo)記的有無判斷玉米光周期敏感性。本發(fā)明與玉米光周期敏感性候選基因zmCCA1共分離的分子標(biāo)記可用于對(duì)玉米光周期敏感性進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、構(gòu)建近等基因系、分子標(biāo)記輔助選擇育種。
【專利說明】—種玉米光周期敏感性候選基因zmCCAl分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分子標(biāo)記，具體的說是一種玉米光周期敏感性候選基因zmCCAl分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]開花是高等植物莖尖分生組織從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變過程，是植物生活周期中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在合適的時(shí)間開花是植物的一個(gè)重要的適應(yīng)性性狀。植物的開花時(shí)間受環(huán)境因子(如日照長(zhǎng)度、光質(zhì)和溫度)以及內(nèi)在因素(如發(fā)育狀況和年齡)的共同影響。擬南芥的光周期途徑(photoperiod pathway),是擬南芥開花途徑中最重要、研究最為詳細(xì)的一個(gè)途徑。
[0003]在擬南芥的開花光周期途徑中，光信號(hào)由光受體(隱花色素和光敏色素)感知，并由ELF3、ELF4、PIF3以及ZTL、FKF和LKP2等基因向生物節(jié)律鐘傳遞，使中央振蕩器產(chǎn)生節(jié)律振蕩，通過中央振蕩器的振蕩向下傳遞晝夜節(jié)律變化信號(hào)，進(jìn)一步激活或抑制花分生組織基因和花器官基因的表達(dá)，從而控制擬南芥的開花過程(Sangho等,2005 ；Putterill等，2001)。
[0004]中央振蕩器是生物節(jié)律鐘的核心部分，由兩個(gè)編碼與Myb相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的CCAl (CIRCADIAN CLOCK ASS0CIATED1)、LHY ((LATE ELONGATED HYP0C0TYL)和一類擬南芥?zhèn)螒?yīng)答調(diào)節(jié)蛋白APRRs (Arabidopsis pseudo-response regulators)小家族組成，負(fù)責(zé)生物節(jié)律整體調(diào)控(Schaffer et al., 1998; Makino et al., 2002; Mizoguchi et al., 2002; Maset al., 2003)。
[0005]研究表明，擬南芥的生物鐘由三個(gè)相互作用的生物反饋環(huán)組成，它們之間相互影響共同維持了生物鐘節(jié)律的穩(wěn)定。
[0006]第一個(gè)生物反饋環(huán)由偽應(yīng)答調(diào)節(jié)因子家族基礎(chǔ)成員--ΜΙΝ G OF CAB EXPRESSION I(TOCI)與C CAl和L H Y組成，被稱為核心反饋環(huán)，也是研究最為透徹的反饋環(huán)。TOCl屬于APRRs基因家族，在N端含有一個(gè)receiver-like結(jié)構(gòu)，而C-末端有CCT結(jié)構(gòu)域，其主要功能是負(fù)責(zé)不同蛋白間的相互作用以及核定位，TOCl主要在夜間表達(dá)；CCA1和LHY分別編碼一個(gè)含有MYB功能域的轉(zhuǎn)錄因子，二者編碼的氨基酸序列具有較高的相似性，基因和蛋白表達(dá)水平相似，都表現(xiàn)出晝夜震蕩的節(jié)律，主要在凌晨表達(dá)。LHY/CCA1和TOCl的晝夜節(jié)律正好完全相反，TOCl蛋白在深夜能激活CCAl和LHY的表達(dá)，使CCAl和LHY的表達(dá)水平在黎明時(shí)達(dá)到高峰。由于LHY和CCAl蛋白能和TOCl基因啟動(dòng)子區(qū)域的夜晚組件(theevening element, AAATATCT)結(jié)合，從而抑制TOCl基因的表達(dá)，所以TOCl的表達(dá)量在白天逐漸減少；由于TOCl蛋白是LHY和CCAl基因表達(dá)所必須的促進(jìn)因子，LHY和CCAl基因的表達(dá)量隨著TOCl蛋白的減少而下調(diào)，對(duì)TOCl基因的抑制作用逐漸減小，夜間LHY和CCAl蛋白量減少到最低程度，從而可解除對(duì)TOCl基因表達(dá)的抑制作用。TOCl的表達(dá)量逐漸上升并達(dá)到高峰，TOCl蛋白量逐漸升高，再次啟動(dòng)LHY和CCAl基因的表達(dá)，CCAl和LHY的表達(dá)量重新開始上升，在黎明重新達(dá)到高峰開始新一輪的循環(huán)。在這個(gè)負(fù)反饋環(huán)中，三個(gè)基因共同構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的穩(wěn)定的生物鐘的核心負(fù)反饋環(huán)，負(fù)調(diào)節(jié)因子抑制正調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄活性，正調(diào)節(jié)因子反過來又激活負(fù)調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)周期。正是基于這種轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，擬南芥生物節(jié)律鐘在光受體調(diào)節(jié)下呈晝夜周期性的同步振蕩變化(Strayer et al, 2000)。
[0007]第二個(gè)反饋環(huán)被稱為“evening loop”,在這個(gè)反饋環(huán)中，GI (GIGAN TEA)、ELF3(EARLY FLOWERING 3)、EL F4 (EARLY FLOWERING 4)和 LUX (LUX ARRHYTHMO)等基因，以與TOCl類似的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制參與激活CCAl和LHY的轉(zhuǎn)錄，反過來，隨著CCAl和L H Y蛋白的大量積累，這些基因的表達(dá)又受到抑制(Hazen, et al, 2005 ；Doyle et al, 2002)。LUX編碼的MYB轉(zhuǎn)錄因子在任何光照和突變背景下都和TOCl的轉(zhuǎn)錄節(jié)律相同，其啟動(dòng)子包含一個(gè)與CCAl/ LHY相結(jié)合的EE元件。CCAl可以直接結(jié)合到ELF4的啟動(dòng)子區(qū)域，因而ELF4的表達(dá)也受LHY/CCA1抑制，同樣它對(duì)輸出節(jié)律的維持以及LHY和CCAl的光誘導(dǎo)表達(dá)也是必需的(Putterill et al, 1995; Alabadi et al, 2001)。
[0008]第三個(gè)生物反饋環(huán)被稱為“morning loop”，由TOCl的三個(gè)同源物PRR5、PRR7和PRR9，與CCAl和L H Y形成。PRR家族蛋白在N端有相類似的叫做pseudo-receiver功能區(qū)域(PR功能域)，C端是與下游開花CO基因相類似的CCT功能結(jié)構(gòu)區(qū)，該功能域定位在細(xì)胞核內(nèi)，中間是一段各不相同的中間序列。這些基因可能起著雙重角色，在生物鐘機(jī)制里它們既調(diào)控向生物鐘傳遞光信號(hào)，又對(duì)中央振蕩器的CCAl和LHY起抑制作用，反過來，CCAl通過直接與PRR7和PRR9基因啟動(dòng)子區(qū)域的CBS(CCA1 — binding site)結(jié)合調(diào)控它們的表達(dá)水平(Wang et al, 1998)。PRR7和PRR9在早上被CCAl和LHY激活，相反的PRR5、PRR7和PRR9則反過來抑制CCAl和LHY的表達(dá)(Mizuno，et al, 2005)。CCAl基因是生物節(jié)律鐘的核心部分，在高等植物開花控 制途徑中發(fā)揮重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明目的是為解決上述技術(shù)問題的不足，提供一種玉米光周期敏感性候選基因zmCCAl分子標(biāo)記及其應(yīng)用，可用于玉米光周期敏感性基因精細(xì)定位、檢測(cè)，可用于玉米分子育種。
[0010]本發(fā)明提供了一種與玉米光周期敏感性候選基因zmCCAl共分離的分子標(biāo)記SSRA489 ；，該分子標(biāo)記的核苷酸序列為SEQ ID N0.1.。
[0011]可擴(kuò)增玉米光周期敏感性候選基因zmCCAl共分離的分子標(biāo)記SSRA489的引物對(duì)為:
SSRA489F:5 ; - GGGTTGGGTAGGTATGTGA -3 ;；
SSRA489R:5 ; - CCCCTTTCCTTCTCTCTTC -3 ;；
所述的調(diào)控玉米光周期敏感性候選基因zmCCAl共分離的分子標(biāo)記的方法為:以玉米總DNA為模板，用所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性的6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，將目的條帶的大小與分子標(biāo)記進(jìn)行對(duì)比，從而根據(jù)分子標(biāo)記的有無判斷玉米光周期敏感性。
[0012]本發(fā)明與玉米光周期敏感性候選基因zmCCAl共分離的分子標(biāo)記的用途，可用于對(duì)玉米光周期敏感性進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、構(gòu)建近等基因系、分子標(biāo)記輔助選擇育種。
[0013]有益效果是:
1、本發(fā)明公開了一種玉米光周期敏感性候選基因zmCCAl分子標(biāo)記；利用本發(fā)明的引物對(duì)，以玉米基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以得到與玉米光周期敏感性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，該標(biāo)記在本發(fā)明中命名為SSRA489。分析表明該標(biāo)記的有無直接關(guān)系到玉米光周期敏感性的大小，能夠用于不同玉米種質(zhì)的光周期敏感性的預(yù)測(cè)。該分子標(biāo)記結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)明，使用方便，且利用PCR技術(shù)檢測(cè)快速高效，在短時(shí)間內(nèi)能夠精確鑒定不同來源的親本玉米自交系，效果快捷明顯，有良好的推廣前景。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除了通過上述PCR擴(kuò)增方法獲得本發(fā)明的分子標(biāo)記外，還可以通過化學(xué)合成獲得本發(fā)明的分子標(biāo)記。在玉米育種和資源鑒定或?qū)Σ煌衩撞牧瞎庵芷诿舾行缘脑缙陬A(yù)測(cè)和篩選中，該分子標(biāo)記能克服環(huán)境影響，對(duì)種植材料的早代篩選，淘汰對(duì)光周期具有敏感性不適應(yīng)溫帶環(huán)境的的植株，提高育種和選擇效 率。將其應(yīng)用于玉米光周期敏感性的鑒定中，能對(duì)不同種質(zhì)材料的光周期反應(yīng)進(jìn)行預(yù)測(cè)。
[0014]因此，根據(jù)玉米光周期候選基因序列的這些特點(diǎn)，可以將這些待定的候選基因開發(fā)為依賴于PCR的功能基因分子標(biāo)記。因此，在利用熱帶種質(zhì)進(jìn)行種質(zhì)改良或自交系選育時(shí)、或玉米雜交種商品化制種時(shí)，都可以利用這些標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇育種和指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)際。這對(duì)于充分利用熱帶亞熱帶種質(zhì)解決我國(guó)當(dāng)前玉米生長(zhǎng)上的種質(zhì)資源基礎(chǔ)狹窄問題，解決玉米雜交種的商品化制種區(qū)域局限性，節(jié)約成本，提高雜交種的商品性，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是本發(fā)玉米光周期敏感性候選基因zmCCAl分子標(biāo)記SSRA48的電泳帶型圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0016]本發(fā)明提供了與玉米光周期敏感性候選基因zmCCAl共分離的分子標(biāo)記SSRA489，該分子標(biāo)記的核苷酸序列為SEQ ID N0.1.。
[0017]可擴(kuò)增玉米光周期敏感性候選基因zmCCAl共分離的分子標(biāo)記SSRA489的引物對(duì)為:
SSRA489F:5 ; - GGGTTGGGTAGGTATGTGA -3 ;
SSRA489R:5 ; - CCCCTTTCCTTCTCTCTTC -3 ;；
所述的調(diào)控玉米光周期敏感性候選基因zmCCAl共分離的分子標(biāo)記的方法為:以玉米總DNA為模板，用所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性的6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，將目的條帶的大小與分子標(biāo)記進(jìn)行對(duì)比，從而根據(jù)分子標(biāo)記的有無判斷玉米光周期敏感性。
[0018]下面結(jié)合具體實(shí)施事例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0019]實(shí)施例1、玉米光周期敏感性主效基因CCAl近等基因系的創(chuàng)建
試驗(yàn)所用的基礎(chǔ)群體來源于一個(gè)溫?zé)犭s交組合:黃早4與CML288，黃早4是中國(guó)溫帶玉米自交系，對(duì)光周期反應(yīng)不敏感；CML288是來自墨西哥國(guó)際玉米小麥改良中心，選自Pop24的熱帶硬粒型玉米自交系，在溫帶表現(xiàn)了很強(qiáng)的光周期敏感性。本發(fā)明以對(duì)光周期敏感的熱帶自交系CML288為供體親本，以對(duì)光周期鈍感的溫帶自交系黃早4為輪回親本，通過回交育種程序，采用表型選擇與分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合的方法，通過雜交、回交或自交，選育僅含有玉米光周期敏感性主效基因位點(diǎn)的近等基因系。具體地，首先，在海南短日照環(huán)境下進(jìn)行雜交獲得Fl，并在第二年Fl與黃早4回交；其次，在河南長(zhǎng)日照日環(huán)境下對(duì)回交群體進(jìn)行表型選擇，選擇散粉期和吐絲期極晚的單株，單獨(dú)取花粉，與4-5株黃早4進(jìn)行授粉雜交，同時(shí)自交，并掛牌標(biāo)示好自交單株、回交單株來源。然后，在海南短日照環(huán)境下，用目標(biāo)位點(diǎn)兩側(cè)的標(biāo)記首先進(jìn)行前景選擇，用均勻分布于玉米10條染色體上的232個(gè)多態(tài)性好的SSR標(biāo)記，對(duì)前景選擇篩選出來的單株進(jìn)行遺傳背景選擇。在接下來的世代中，繼續(xù)開發(fā)目標(biāo)區(qū)域內(nèi)新的分子標(biāo)記，選擇交換單株，最終利用本發(fā)明所提供的標(biāo)記SSRA489，篩選出僅含玉米光周期敏感性主效基因位點(diǎn)的近等基因系單株。
[0020]實(shí)施例2、分子標(biāo)記SSR A489在玉米分子育種中的應(yīng)用
用本發(fā)明分子標(biāo)記SSR A489的引物，對(duì)玉米單株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)，檢測(cè)到分子標(biāo)記則表明光周期敏感性較強(qiáng)，未檢測(cè)到則表明光周期敏感性較弱。進(jìn)一步，可將溫帶親本玉米、熱帶親本玉米及溫?zé)犭s合Fl代單株DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為對(duì)照；其中熱帶親本玉米基因組DNA確定含有玉米光周期敏感性基因；溫帶親本玉米基因組DNA不含有玉米光周期敏感性基因；如果所測(cè)的玉米單株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因型與溫帶親本的帶型一致，則該單株適應(yīng)溫帶氣候條件，可以用于進(jìn)一步玉米研究；如果所測(cè)的玉米單株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因型與熱帶親本的帶型一致，則該單株對(duì)溫帶的氣候條件表型敏感，表明該單株不能在溫帶條件下正常生長(zhǎng)發(fā)育，因此該單株沒有進(jìn)一步利用價(jià)值，應(yīng)當(dāng)淘汰；如果所測(cè)的玉米單株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因型與溫?zé)犭s合Fl代單株的帶型一致，則表明該單株為雜合單株，繼續(xù)自交后可以選出對(duì)光周期不敏感的后代，這類單株也有進(jìn)一步利用價(jià)值，應(yīng)當(dāng)留用 。
[0021]具體步驟如下:
(1)提取待測(cè)玉米單株的基因組DNA;同時(shí)提取溫帶親本玉米基因組DNA、熱帶親本玉米基因組DNA和溫?zé)犭s合玉米基因組DNA ；
(2)分別以待測(cè)玉米單株的基因組DNA、溫帶親本玉米基因組DNA、熱帶親本玉米基因組DNA和溫?zé)犭s合玉米基因組DNA為模板用分子標(biāo)記SSR A489的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
(3)用變性的6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
(4)統(tǒng)計(jì)帶型結(jié)果；分析待測(cè)玉米單株DNA擴(kuò)增產(chǎn)物基因型與溫帶親本、熱帶親本還是與溫?zé)犭s合玉米相同。
[0022]實(shí)施例3、分子標(biāo)記SSR A489在不同親本間的多態(tài)性鑒定
提取黃早 4、CML288、CML310、CML10、B73、Mol7、W22、78599、昌七、鄭 58、掖 478、自 330，丹340等86個(gè)不同來源的自交系的基因組DNA，使用本發(fā)明中分子標(biāo)記SSR A489的引物對(duì)上述自交系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明，分子標(biāo)記SSR A489在不同來源的自交系都具有多態(tài)性。此結(jié)果證明，分子標(biāo)記SSR A489能夠在任何育種背景群體中準(zhǔn)確檢測(cè)到CCAl基因的存在。
【權(quán)利要求】
1.一種玉米光周期敏感性候選基因ZmCCAl分子標(biāo)記，其特征在于:該分子標(biāo)記的核苷酸序列為SEQ ID N0.1.。
2.如權(quán)利要求1所述的玉米光周期敏感性候選基因zmCCAl分子標(biāo)記，其特征在于:其引物的核苷酸列如下
SSRA489F:5 ; - GGGTTGGGTAGGTATGTGA -3 ;；
SSRA489R:5 ; - CCCCTTTCCTTCTCTCTTC -3 ;。
3.利用如權(quán)利要求2所述玉米光周期敏感性候選基因zmCCAl分子標(biāo)記進(jìn)行玉米光周期敏感性檢測(cè)的方法，其特征在于:以玉米總DNA為模板，用所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性的6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，將目的條帶的大小與分子標(biāo)記進(jìn)行對(duì)比，從而根據(jù)分子標(biāo)記的有無判斷玉米光周期敏感性。
4.如權(quán)利要求1所述的玉米光周期敏感性候選基因zmCCAl分子標(biāo)記在玉米光周期敏感性的早期預(yù)測(cè)和篩 選中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104004759SQ201410254639
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月10日
【發(fā)明者】王翠玲, 李雪林, 楊敏, 韓贊平, 王彬, 胡文花, 柳雙雙 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)