一種炎性腸病狀態(tài)下藥物敏感性的新檢測(cè)指標(biāo)及其在藥物治療方案設(shè)計(jì)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥物代謝動(dòng)力學(xué)、藥理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域，創(chuàng)新性地揭示了炎性腸病的天然耐藥現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)了一種基于外周血單核細(xì)胞P-gp表達(dá)量的新檢測(cè)指標(biāo)用于炎性腸病狀態(tài)下藥物敏感性的檢測(cè)，并闡明了相關(guān)機(jī)制，同時(shí)提出聯(lián)用P-gp抑制劑的藥物治療方案可能用于逆轉(zhuǎn)炎性腸病天然耐藥。
【背景技術(shù)】
[0002]炎性腸病(IBD)是一種慢性腸道炎癥性疾病，主要包括克羅恩病(⑶)和潰瘍性結(jié)腸炎(UC)兩種。其不僅在美國(guó)及歐洲國(guó)家盛行，在我國(guó)的發(fā)病率也逐年升高。IBD的病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確，可能與飲食習(xí)慣、環(huán)境因素、遺傳因素、微生物感染等多種因素相關(guān)。此外，由于IBD病人常伴有免疫紊亂的現(xiàn)象，其也被視為一種自身免疫性疾病。臨床治療時(shí)常使用免疫抑制劑或抗炎藥以減輕腸道炎癥反應(yīng)，然而反復(fù)發(fā)病及藥物耐受現(xiàn)象的產(chǎn)生常常限制其最終臨床療效。
[0003]自身免疫性疾病治療過程中產(chǎn)生的藥物耐受可以分為天然耐藥和獲得性耐藥兩種，均與外周血單核細(xì)胞P-糖蛋白(P-gp)表達(dá)升高相關(guān)。天然耐藥是指病人在初次給藥時(shí)就出現(xiàn)藥物耐受現(xiàn)象。自身免疫性疾病發(fā)病過程中，過量的炎癥因子通過P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外產(chǎn)生異常炎癥反應(yīng)，并反饋刺激P-gp表達(dá)進(jìn)一步升高。由于多數(shù)免疫抑制劑是P-gp的底物，因此升高的P-gp能夠?qū)⒚庖咭种苿┩馀懦雒庖呒?xì)胞，導(dǎo)致自身免疫性疾病治療可能存在天然耐藥的現(xiàn)象。獲得性耐藥是指病人在多次給藥后逐漸出現(xiàn)對(duì)藥物敏感性下降的現(xiàn)象。大量研宄表明自身免疫性疾病病人長(zhǎng)期使用免疫抑制劑后常出現(xiàn)嚴(yán)重的藥物耐受反應(yīng)，即免疫抑制劑通過誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞P-gp表達(dá)，降低胞內(nèi)藥物濃度，從而產(chǎn)生獲得性耐藥。為控制病程發(fā)展、減輕病理癥狀，IBD病人需服用包括糖皮質(zhì)激素在內(nèi)的多種免疫抑制劑，但臨床研宄證實(shí)長(zhǎng)期用藥可導(dǎo)致外周血單核細(xì)胞P-gp上調(diào)最終造成藥物療效下降。盡管關(guān)于IBD治療過程中產(chǎn)生的獲得性耐藥已被證實(shí)，但I(xiàn)BD病人是否存在天然耐藥卻鮮有研宄。對(duì)天然耐藥的忽視可能導(dǎo)致臨床治療延誤及錯(cuò)誤增加用藥劑量，加速獲得性耐藥的產(chǎn)生。因此，對(duì)IBD病人初次用藥前或多次用藥后的藥物敏感性進(jìn)行科學(xué)評(píng)估非常必要和重要，評(píng)估結(jié)果有助于優(yōu)化IBD的藥物治療方案，提高短期及長(zhǎng)期免疫抑制劑用藥的最終療效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在證實(shí)IBD天然耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生，并闡明這一現(xiàn)象發(fā)生的相關(guān)機(jī)制，即炎性腸病小鼠體內(nèi)過度分泌的細(xì)胞因子TNF- a、IL17及LPS通過STAT3/Nf- κ b途徑，促進(jìn)STAT3磷酸化，進(jìn)而誘導(dǎo)P65磷酸化及核轉(zhuǎn)位促進(jìn)外周血單核細(xì)胞P-gp表達(dá)，降低胞內(nèi)免疫抑制劑的藥物濃度，抑制其治療效果，從而造成天然耐藥的產(chǎn)生。而給予P-gp特異性抑制劑可以逆轉(zhuǎn)這一耐藥現(xiàn)象。定量PCR及LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果表明炎性腸病小鼠體內(nèi)外周血單核細(xì)胞mdrl表達(dá)升高、胞內(nèi)藥物水平較正常小鼠偏低；ELISA檢測(cè)結(jié)果證實(shí)炎性腸病小鼠血漿中TNF-a、IL-|3、IL-6、IL-17、LPS分泌水平升高，且體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明上述炎癥因子及LPS均可誘導(dǎo)mdrl表達(dá)升高；Western Blot實(shí)驗(yàn)表明TNF- a，LPS及IL17是通過誘導(dǎo)Ρ65磷酸化及核轉(zhuǎn)位促進(jìn)外周血單核細(xì)胞P-gp表達(dá)。通過炎癥刺激或轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)?zāi)MIBD病人體內(nèi)外周血淋巴細(xì)胞的生理狀態(tài)，給予特異性P-gp抑制劑后可逆轉(zhuǎn)胞內(nèi)藥物濃度下降的現(xiàn)象。
【附圖說明】
[0005]圖1、TNBS造模小鼠出現(xiàn)天然耐藥現(xiàn)象，外周血單核細(xì)胞P-gp表達(dá)量升高，外排作用增強(qiáng)，胞內(nèi)環(huán)孢素CYSA累積水平降低。
[0006]圖2:TNBS造模小鼠血漿中炎癥因子(TNF-α，IL-β，IL-6，IL-17)及LPS水平顯著升高
[0007]圖3:炎癥因子(TNF-a，IL-β，IL_6，IL-17)及LPS可誘導(dǎo)人源性巨噬細(xì)胞THP_1及人源性淋巴細(xì)胞CCRF-CEM外排轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp表達(dá)升高
[0008]圖4:IL-17可激活STAT3/Nf_ κ b途徑，LPS、TNF- a可激活P65磷酸化及核轉(zhuǎn)位
[0009]圖5:P-gp抑制劑可逆轉(zhuǎn)IBD天然耐藥現(xiàn)象。
【具體實(shí)施方式】
[0010]藥品與試劑
[0011]細(xì)胞培養(yǎng):人源性巨噬細(xì)胞THP-1及人源性淋巴細(xì)胞CCRF-CEM購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(American Type Culture Collect1n，ATCC，Rockville, MD)，于 37°C，5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為RPMI 1640培養(yǎng)基，含10%小牛血清，以及青霉素62.5mg/L，鏈霉素100 mg/L，于組織培養(yǎng)曲頸瓶中培養(yǎng)，每隔2?3天離心換液。RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)于GIBCO (Gland Island, New York)，小牛血清購(gòu)于 Hyclone (Logan，Utah，USA)，細(xì)胞培養(yǎng)耗材購(gòu)于 Costar (Cambridge, MA, USA)。
[0012]動(dòng)物飼養(yǎng):清潔級(jí)BALB/c小鼠，體重18_22g，周齡8_10周，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。適齡BALB/c小鼠在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)，溫度:22-24°C，相對(duì)濕度:60%，光照、黑暗:12h/12h，自由飲食、飲水，適應(yīng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0013]PCR:小鼠mdrla及內(nèi)參actin、人MDRl及內(nèi)參ACTIN引物均購(gòu)自Invitrogen (Gibco-1nvitrogen, USA) ；Trizol 總 RNA 提取試劑、RT-PCR 試劑盒、Real-timePCRMaster Mix (SYBR green)購(gòu)于 Takara(大連寶生物，Japan)。
[0014]LC-MS/MS:甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)購(gòu)自 Sigma-Aldrich (St.Louis，MO)。甲酸及其它分析純化學(xué)試劑均購(gòu)于南京化學(xué)試劑廠(江蘇，中國(guó))。超純水由Mill1-Qsystem(Millipore, Milford, MA, USA)制備。
[0015]Western:RIPA 裂解液、5X 上樣緩沖液、1.5 M Tris-HCl pH 8.8,1 M Tris-HClpH 6.8,10% SDS、一抗二抗去除液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研宄所(江蘇，中國(guó))。苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)購(gòu)自南京生興生物技術(shù)有限公司(江蘇，中國(guó))。Glycine (電泳級(jí))、SDS(電泳級(jí))、Tris base (電泳級(jí))、過硫酸胺(ammonium persulfate，APS)均購(gòu)自 Amerso (USA)。30% Acrylamide/BisSolut1n (29:1)、N，N，N'，Nr -四甲基乙二胺(N，N，Nr，Nr -tetramethyl ethylenediamine，TEMED)均購(gòu)自 B1-Rad。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒(Enhanced Chemiluminescence,ECL)購(gòu)自 Thermo Fisher Scientific (USA)。Stat3、P65、P-P65、Lamin B 單克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗購(gòu)自Cell Signaling Technology (Boston，USA)，GAPDH單克隆抗體購(gòu)自 B1world Technology (MN, USA).。
[0016]具體實(shí)例一 TNBS造模小鼠出現(xiàn)天然耐藥現(xiàn)象，外周血單核細(xì)胞P-gp表達(dá)量升高，外排作用增強(qiáng)，胞內(nèi)環(huán)孢素CYSA累積水平降低。
[0017]TNBS小鼠造模:造模前BALB/c小鼠在動(dòng)物房飼養(yǎng)一周。禁食24小后，苯巴比妥麻醉小鼠，3.5F導(dǎo)管從肛門插入腸道深約5.5cm。造模組以100mg/kg的劑量給予溶于30%乙醇中的TNBS，對(duì)照組以同等給藥體積給予30%乙醇。之后將小鼠倒置3分鐘，于給藥后第3天或第7天眼眶取血于含肝素的無菌試管中并處死老鼠。
[0018]外周血淋巴細(xì)胞提取:外周血淋巴細(xì)胞基于梯度離心的原理通過LympholyteMammal 試劑盒(Cedarlane Laboratories Ltd,Hunby,Ontar1,Canada))提取。向抽取所得的靜脈血中加入等體積RPM1-1640培養(yǎng)基進(jìn)行1:1稀釋、混勻后，沿管壁輕輕加至等體積分離液之上(密度:1.086