專利名稱：一種檢測嬰兒痙攣癥患兒對acth藥物敏感性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及嬰兒痙攣癥患兒對ACTH藥物敏感性的檢測試劑盒，具體而言，涉及一 種能快速、有效的檢測出嬰兒痙攣癥患兒基因組MC2R啟動子區(qū)是否含有純和TCCT單體型， 從而快速判斷患兒是否對ACTH藥物治療敏感的試劑盒。
背景技術(shù)：
癲癇是除中風以外的第二位腦部的慢性疾病，是嬰兒期第一位腦部慢性疾病。嬰 兒痙攣癥(Infantile spasms, IS)又稱West綜合征，是嬰兒時期最常見的一種難治性癲 癇綜合征,其患病率較高,約為1/2000活產(chǎn)兒[Baram TZ, Mitchell WG, et al. Infantile Spasms Hypothe sis-Driven Therapy and Pilot HumanInfant Experiments UsingCorticotropin-Releasing Hormone Receptor Antagonists. DevNeurosci 1999 ； 21 :281-289. Lux AL, Osborne JP. A proposal for casedefinitions and outcome measures in studies of infantile spasmsand west syndrome consensus statement of the West DelphiGroup. Epilespia 2004 ；45 (11) :1416_1428]。本病通常在生后第 1 年內(nèi) 出現(xiàn)，多以3 8月齡發(fā)病，發(fā)病高峰年齡為6月，以痙攣成簇發(fā)作、高峰失律腦電圖和精神 發(fā)育遲滯三聯(lián)征為主要表現(xiàn)，預后較差，死亡率較高。大量的研究資料證實下丘腦_垂體_腎上腺(HPA)軸功能紊亂在嬰兒痙攣癥的 發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。目前盡管ACTH已經(jīng)成為短期內(nèi)治療嬰兒痙攣癥的主導藥物， ACTH能成功地控制痙攣的發(fā)作和緩解高峰失律EEG表現(xiàn)，但到目前為止，有關(guān)ACTH治療 嬰兒痙攣的作用機制和耐藥機制尚不清楚。目前研究表明ACTH可通過以下兩種途徑下調(diào) 腦內(nèi)某些區(qū)域促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)的過度分泌和釋放，降低嬰兒痙攣患兒的 神經(jīng)元興奮性發(fā)揮臨床抗驚厥效應(yīng)(1)與MC2R結(jié)合，促進腎上腺皮質(zhì)糖皮質(zhì)激素分泌， 使血漿的皮質(zhì)醇水平穩(wěn)定和持續(xù)升高；(2)通過直接刺激中樞杏仁體(ACe)的黑皮質(zhì)素2 受體(MC2R)發(fā)揮獨立于類固醇激素外的直接效應(yīng)。這兩種途徑均可通過長、短負反饋機 制最終抑制腦內(nèi)致驚厥劑CRH的合成和分泌，有效地控制痙攣發(fā)作和緩解高峰失律EEG表 現(xiàn)[Jaseja H.A plausible explanation for superiority ofadreno-cortico-trophic hormone (ACTH) over oral corticosteroids in management of infantile spasms(West syndrome). Med Hypotheses2006 ；67 :721_724· Brunson KL, Avishai-Eliner S，Baram TZ. ACTHtreatment of infantile spasms :mechanisms of its effects inmodulation of neuronal excitability. Int Rev Neurobiol2002 ；49 185-197. Baram TZ. Treatment of infantile spasms :theideal and the mundane. Epilepsia 2003;44:993-994·]。最新的癲癎藥物遺傳學研究結(jié)果表明，某些藥物受體基因常見突變，尤其是單核 苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNPs)的改變在很大程度上與癲癎發(fā)生、 驚厥結(jié)果、抗癲癎藥物敏感性，抗癲癎藥物耐藥等密切相關(guān)。SNP是指在基因組上單個核苷 酸的變異，包括置換、顛換、缺失和插入。SNP在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁，而且多是C轉(zhuǎn)換 為T，原因是CG中的C常為甲基化的，自發(fā)地脫氨后即成為胸腺嘧啶。一般而言，SNP是指
3變異頻率大于的單核苷酸變異。因此，SNP成為第三代遺傳標志，人體許多表型差異、 對藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關(guān)。SNP將提供一個強有力的工具，用于高危 群體的發(fā)現(xiàn)、疾病相關(guān)基因的鑒定、藥物的設(shè)計和測試以及生物學的基礎(chǔ)研究等。SNP在基 因組中分布相當廣泛，近來的研究表明在人類基因組中每300堿基對就出現(xiàn)一次。大量存 在的SNP位點，使人們有機會發(fā)現(xiàn)與各種疾病，包括腫瘤相關(guān)的基因組突變；從實驗操作來 看，通過SNP發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因突變要比通過家系來得容易；有些SNP并不直接導致疾病 基因的表達，但由于它與某些疾病基因相鄰，而成為重要的標記。[Chen JZ, Xie XD，Wang XX, Tao Μ, Shang YP, Guo XG. Single nucleotide polymorphisms of theSCN5A gene in Han Chinese and their relation with Brugada syndrome. Chin Med J(Engl)2004 ； 117 652-656]。在我們既往研究中，我們發(fā)現(xiàn)MC2R基因啟動子區(qū)的SNPs，rsl893220，rs2186944 和-2T > C的基因型和等位基因頻率分布在嬰兒痙攣病人和對照組之間差異有顯著統(tǒng)計學 意義，隨后構(gòu)件的單體型頻率分析發(fā)現(xiàn)，常見的TCCT單體型與嬰兒痙攣癥患兒的ACTH藥物 反應(yīng)性高度相關(guān)，提示MC2R基因啟動子區(qū)SNPs的改變可能很大程度上參與了嬰兒痙攣癥 的發(fā)病機制和ACTH治療的耐藥反應(yīng)。這些研究結(jié)果可能為嬰兒痙攣癥病人的ACTH治療療 效提供一定的分子生物學方面預測。人類MC2R基因的表達主要通過cAMP信號途徑受配體 ACTH的正向調(diào)控，MC2R基因啟動子活性基礎(chǔ)調(diào)控區(qū)和cAMP反應(yīng)元件(CREs)位點目前已 從功能上在 MC2R 基因上被鑒定[Naville D, Jaillard C, Barjhoux L, Durand P, Begeot M. Genomic structure and promotercharacterization of the human ACTH receptor gene. Biochem BiophysRes Commun 1997;230:7-12.]。MC2R 基因編碼區(qū)突變可導致 cAMP 反應(yīng)受損，對ACTH刺激所引起受體敏感性喪失以及該受體ACTH結(jié)合位點對ACTH高度親 禾口力的喪失等[Penhoat A, Naville D, ElMourabit H, et al. Functional relationships between three novel homozygous mutationsin the ACTH receptor gene and familial glucocorticoid deficiency. J Mol Med 2002 ;80 :406_411]。我們進一步比較了接受ACTH 治療的嬰兒痙攣癥病人TCCT單體型攜帶者和非攜帶者的ACTH治療反應(yīng)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 TCCT單體型頻率分布中嬰兒痙攣癥病人明顯低于對照組，純合子和雜合子攜帶者的ACTH 反應(yīng)性優(yōu)于非攜帶者。此外，與ACTH治療反應(yīng)性相關(guān)的TCCT單體型跨越啟動子區(qū)上游的_2 到-853區(qū)域，該區(qū)域恰好包括影響ACTH療效發(fā)揮的CREs區(qū)域。體外單核苷酸多態(tài)性功 能研究證實MC2R基因啟動子區(qū)的多態(tài)性可使該基因的啟動子活性降低[Slawik M，Reisch N, Zwermann O, et al. Characterization of anadrenocorticotropin(ACTH) receptor promoter polymorphism leadingto decreased adrenal responsiveness to ACTH. J Clin EndocrinolMetab 2004 ；89 :3131_3137]。因此，我們推測MC2R基因啟動子區(qū)TCCT單體型 可能潛在地影響啟動子的活性，使之對細胞內(nèi)cAMP的反應(yīng)性發(fā)生變化，導致受體對ACTH刺 激的敏感性降低，從而最終參與嬰兒痙攣癥患兒ACTH治療的耐藥機制。
核酸探針作為一種序列同源性的檢測技術(shù)已經(jīng)在分子生物學、臨床醫(yī)學、細胞生 物學、分子遺傳學等學科領(lǐng)域中應(yīng)用，得以飛速的發(fā)展[曹軍勝.核酸探針及其應(yīng)用.延 安大學學報(醫(yī)學科學版)2005，(02)]。核酸探針是根據(jù)核酸分子之間的互補配對原則設(shè) 計的一種檢測目標序列是否存在的一段核酸序列，探針與目標序列的這種結(jié)合稱為雜交。 核酸探針不僅是研究核酸結(jié)構(gòu)和功能的重要手段，還為傳染病的診斷、流行性病的調(diào)查、食 品衛(wèi)生檢查、腫瘤和遺傳病的早期診斷等打開了一個新的突破口，并且是法醫(yī)學研究的重要技術(shù)。在遺傳診斷方面，通過檢測某一病毒基因的缺失或堿基突變的情況，疾病基因與 另一非疾病基因的非隨機關(guān)系來確定某一遺傳疾病是否存在[Mercatali L，Valenti V, Calistri D,et al. RT-PCR determination of maspin and mammagIobinB in peripheral blood of healthy donors and breast cancerpatients.Ann Oncol,2006,17 (3) 424-428.]。特別重要的是如果能夠制作一系列遺傳疾病基因的探針，就可以在胎兒出生前 檢測是否帶有某種遺傳疾病，減少患病嬰兒的出生率。各種設(shè)計巧妙、性能優(yōu)良的新型核 酸探針被開發(fā)研制，并在基因分析、疾病診斷、生物工程等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。其中， 基于熒光標記的核酸熒光分子探針具有背景較低、檢測靈敏度高、操作簡易、活體實時分析 等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于基因突變疾病的研究、活細胞中mRNA的檢測、蛋白質(zhì)的檢測及生物 芯片研究等，越來越受到人們的關(guān)注[Nazarenkol，Lowe B, Darfler Μ, etal. Multiplex quantitative PCR using self-quenched primers labeledwith a single fluorophore. Nucleic AcidsRes. 2002,30(9) :e37.]。因此制備一種簡便的試劑盒，來檢測嬰兒痙攣癥患兒的基因組MC2R啟動子區(qū)是 否含有純和TCCT單體型，顯得非常重要，而本發(fā)明恰好解決了這一難題。本發(fā)明用熒光標 記探針，通過雜交檢測痙攣癥患兒MC2R基因啟動子區(qū)是否攜帶純和TCCT單體型，以判斷該 患兒是否對ACTH治療敏感。本發(fā)明所述的檢測患兒痙攣癥患兒對ACTH藥物敏感性的試劑盒能快速、有效的 檢測出嬰兒痙攣癥患兒基因組MC2R啟動子區(qū)是否含有純和TCCT單體型，從而快速判斷患 兒是否對ACTH藥物治療敏感。如果不攜帶此單體型，可較早選用其它抗癲癇藥物，為患兒 減少了不必要的痛苦，抓住治療時機，同時減輕患兒家庭經(jīng)濟負擔。


圖1為CCT單體型攜帶者與非攜帶者ACTH反應(yīng)性結(jié)果比較圖；

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于MC2R基因啟動子區(qū)的單核苷酸多態(tài)性用于評估嬰兒痙攣癥患兒對 ACTH藥物治療敏感的基礎(chǔ)上，提供了一種檢測嬰兒痙攣癥患兒對ACTH藥物敏感性的試劑 盒。本發(fā)明所要解決的關(guān)鍵問題在于，快速的診斷嬰兒痙攣癥患兒是否攜帶TCCT單體型， 進一步判斷患兒是否對ACTH藥物治療敏感，再選擇合適的藥物為患兒醫(yī)治。本試劑盒包括檢測MC2R基因啟動子區(qū)rsl893220號的SNP位點的特異性引物對 以及特異性核酸探針、檢測MC2R基因啟動子區(qū)rs2186944號的SNP位點的特異性引物對以 及特異性核酸探針、檢測MC2R基因啟動子區(qū)-2T > C號的SNP位點的特異性引物對以及特 異性核酸探針、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP混合液、MgCl2溶液、Taq DNA聚合酶、去離 子水。本試劑盒中所述的特異性引物對是指對MC2R基因啟動子區(qū)rs 1893220號、 rs2186944號以及-2T>C號的SNP位點設(shè)計，能特異性擴增出靶位點的DNA片段的引物對。 設(shè)計這類引物對是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO 1 和2所示序列的引物對、SEQ ID NO 3和4所示序列的引物對以及SEQ ID NO 5和6所示 序列的引物對。特異性地引物對可以用常規(guī)地合成技術(shù)進行合成。本領(lǐng)域地技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明地引物不限于這兩對引物。 本試劑盒中所述的特異性熒光探針是指對MC2R基因啟動子區(qū)rs 1893220號、 rs2186944號以及-2T > C號的SNP位點設(shè)計，能通過熒光定量PCR技術(shù)特異性擴增出靶 位點的DNA片段的探針。設(shè)計這類引物對是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易完成的。優(yōu)選地，試劑盒 中包含具有SEQ ID NO :3和4所示序列的探針。特異性地探針可以用常規(guī)地合成技術(shù)進行 合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這兩對引物，所有可用于熒光定量 PCR檢測MC2R基因啟動子區(qū)rsl893220、rs2186944以及_2T > C的SNP位點的探針均在 本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明試劑盒的一人份組分盒含量包括
1.0μ 1IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液
0.2μ 125mM dNTP
0.5 μ 125mM MgCl2 溶液
0.02 μ 15unit/y 1 Taq DNA 聚合酶
0.2μ 125 μ M特異性引物
0.1 μ 125 μ M特異性核酸探針
5.68 μ 1去離子水
本試劑羞[的保存溫度位-20°C
具體實施方案下面結(jié)合具體的實施例，進一步闡述本發(fā)明。下面實施例中未表明具體條件的試 驗方法，通常按照常規(guī)的條件。實施例1檢測試劑盒的使用方法步驟一 DNA模板的抽取抽取嬰兒痙攣癥患兒外周血，提取DNA步驟二 熒光定量PCR試驗使用檢測痙攣癥患兒對ACTH藥物敏感性的試劑盒，其中含有下列引物對和熒光 探針(下述核苷酸序列均為5’ -3’)有義引物1:CATGTTGCGGAGGCACAC(SEQIDNO1)
反義引物1TGCTTCTCCGTCCAAAAACT(SEQIDNO2)
有義引物2:AGAAACAGCCACTGGTTTGG(SEQIDNO2)
反義引物2TGGAATTGTCATCTTGCTCTTTT(SEQIDNO4)
有義引物3TGGGGCTATTCCCTTCTTCT(SEQIDNO5)
反義引物3CAGCTCTGAAGCAGGAACTTT(SEQIDNO6)
熒光探針1CTCAGAAACAGTCGAAGTCTGG(SEQIDNO7)
熒光探針2CCCCAGCCCCAAAAACCCAGG(SEQIDNO8)
熒光探針3CTTCTTAATGAAACTAATGAGC(SEQIDNO9) 其中，有義引物1，反義引物1和熒光探針1特異性針對檢測MC2R基因啟動子區(qū) rsl893220號的SNP位點；有義引物2，反義引物2和熒光探針2特異性針對檢測MC2R基因 啟動子區(qū)rs2186944號的SNP位點；有義引物2，反義引物2和熒光探針2特異性針對檢測MC2R基因啟動子區(qū)-2T > C的SNP位點。熒光定量PCR反應(yīng)體系為總體積10μ 1，包含濃度25ng/l·! 1的DNA模板2μ1、 1. Ομ 1的IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、0. 2 μ 1的25mM dNTP、0. 5μ 1的25mMMgC12溶液、 0.02 μ 1的5unit/y 1 Taq DNA聚合酶、0. 2μ 1的25 μ M特異性引物的0. 1μ 1的25 μ M特 異性核酸探針以及5.68 μ 1的去離子水。在熒光定量PCR擴增儀上進行反應(yīng)，發(fā)應(yīng)條件為 52°C、2分鐘，95°C、10分鐘，進行55個循環(huán)的95°C、45秒，60°C、90秒。反應(yīng)結(jié)束后在熒光 定量PCR儀上讀取樣品熒光量。步驟三SNP基因型分析將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量和正常照相對比，熒光探針1熒光信 號明顯高于正常對照，說明被檢測樣品中MC2R基因啟動子區(qū)rsl893220號的SNP位點為 C型，為ACTH藥物治療敏感；熒光探針2熒光信號明顯高于正常對照，說明被檢測樣品中 MC2R基因啟動子區(qū)rs2186944號的SNP位點為C型，為ACTH藥物治療敏感；熒光探針3熒 光信號明顯高于正常對照，說明被檢測樣品中MC2R基因啟動子區(qū)-2T > C的SNP位點為T 型，為ACTH藥物治療敏感。實施例2 利用本發(fā)明檢測漢族嬰兒對ACTH藥物敏感性本發(fā)明的一種嬰兒痙攣癥患兒對ACTH藥物敏感性的檢測試劑盒的優(yōu)選實施例 為，我們利用檢測試劑盒，對新診斷為嬰兒痙攣癥的患兒進行了用藥前MC2R啟動子區(qū)的篩 選，了解了患兒是否對ACTH治療有反應(yīng)。同時檢測了 ACTH治療不敏感的嬰兒痙攣癥患兒 MC2R啟動子區(qū)是否含有TCCT單體型。我們將所述的嬰兒痙攣癥檢測試劑盒檢測到的基因分型后，再對嬰兒進行針對性 治療。92例患兒中，TCCT攜帶者的46例，均給與ACTH肌肉注射治療，治療4周后評價治療 效果，30例患兒發(fā)作次數(shù)減少75%以上，5例患兒發(fā)作次數(shù)減少50-75%，即有35例患兒對 ACTH治療有反應(yīng)率達76% ；而TCCT/0攜帶者35例，對ACTH治療有反應(yīng)率達71% ；我們也 檢測了非攜帶者患兒對ACTH治療反應(yīng)狀況，發(fā)現(xiàn)在22例中，只有23%病例的發(fā)生了發(fā)應(yīng) (圖 1)。發(fā)作次數(shù)減少75%以上是有效，無明顯減少是無效，50-75%是好轉(zhuǎn)，發(fā)作次數(shù)減 少50%以上即認為對ACTH治療有反應(yīng)。探針檢測結(jié)果與測序結(jié)果一致，說明我們設(shè)計的探 針試劑盒精確度高，產(chǎn)品成形后使用準確、快速、經(jīng)濟；快速的診斷患兒是否攜帶TCCT單體 型，所述的嬰兒痙攣癥檢測試劑盒將為臨床選擇用藥提供了很大幫助。顯而易見，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以通過本發(fā)明方法，用各種類型多肽的制備 特異性的抗體。上述實施例僅供說明本發(fā)明之用，而并非是對本發(fā)明的限制，有關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，還可以作出各種變化和變型，因此所 有等同的技術(shù)方案也應(yīng)屬于本發(fā)明的范疇，本發(fā)明的專利保護范圍應(yīng)由各權(quán)利要求限定。一種檢測嬰兒痙攣癥患兒對ACTH藥物敏感性的試劑盒.txt<110>中國人民解放軍總醫(yī)院<120> 一種檢測嬰兒痙攣癥患兒對ACTH藥物敏感性的試劑盒<160>9<210>1
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
CAGCTCTGAAGCAGGAACTTT
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>7
CAGCTCTGAAGCAGGAACTTT
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>8
CCCCAGCCCCAAAAACCCAGG
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>9
CTTCTTAATGAAACTAATGAGC
權(quán)利要求
一種檢測痙攣癥患兒對ACTH藥物敏感性的試劑盒，包括檢測MC2R基因啟動子區(qū)rs1893220號的SNP位點的特異性引物對以及特異性核酸探針、檢測MC2R基因啟動子區(qū)rs2186944號的SNP位點的特異性引物對以及特異性核酸探針、檢測MC2R基因啟動子區(qū) 2T＞C號的SNP位點的特異性引物對以及特異性核酸探針、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP混合液、MgCl2溶液、Taq DNA聚合酶、去離子水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的異性引物對是指對MC2R基因啟 動子區(qū)rsl893220號、rs2186944號以及-2T > C號的SNP位點設(shè)計，能特異性擴增出靶位 點的DNA片段的引物對。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針是指對MC2R基 因啟動子區(qū)rsl893220號、rs2186944號以及-2T > C號的SNP位點設(shè)計，能通過熒光定量 PCR技術(shù)特異性擴增出靶位點的DNA片段的探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性引物對選自具有SEQID NO :1和2所示序列的引物對、SEQ ID NO 3和4所示序列的引物對以及SEQ ID NO 5和6 所示序列的引物對。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性熒光探針選自具有SEQ ID NO :7、8禾Π 9所示序列的探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括濃度25ng/ μ 1的DNA模板2μ 1、1.0μ 1的IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、0. 2 μ 1的25mM dNTP、 0. 5 μ 1 的 25mMMgC12 溶液、0. 02 μ 1 的 5unit/ μ ITaq DNA 聚合酶、0. 2 μ 1 的 25 μ M 特異性 引物的0. 1 μ 1的25 μ M特異性核酸探針以及5. 68 μ 1的去離子水。試劑盒供一人份檢測 使用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種嬰兒痙攣癥患兒對ACTH藥物敏感性的檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測MC2R基因啟動子區(qū)rs1893220號的SNP位點的特異性引物對以及特異性核酸探針、檢測MC2R基因啟動子區(qū)rs2186944號的SNP位點的特異性引物對以及特異性核酸探針、檢測MC2R基因啟動子區(qū)-2T＞C號的SNP位點的特異性引物對以及特異性核酸探針、用于熒光定量PCR檢測的常規(guī)試劑組件等。本發(fā)明的試劑盒通過同時檢測分析兒童MC2R基因啟動子區(qū)SNP位點來預測嬰兒痙攣癥患兒對ACTH藥物的敏感性，為醫(yī)治嬰兒痙攣癥患兒選擇合適的藥物打下基礎(chǔ)。
文檔編號G01N21/64GK101906468SQ200910223428
公開日2010年12月8日 申請日期2009年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月16日
發(fā)明者丁瑛雪, 劉占利, 鄒麗萍 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院