專利名稱：用于確定腫瘤對(duì)抗腫瘤藥劑的治療的敏感性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及確定腫瘤對(duì)抗腫瘤藥劑治療的敏感性的方法，在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中具有用途。
背景技術(shù)：
術(shù)語“癌癥(cancer)”通常是指一類由異常細(xì)胞的不受控制的生長(zhǎng)和播散引起的超過100種的疾病中的一種，它可以是實(shí)體瘤(solid tumors)、淋巴瘤和非實(shí)體癌(non-solid cancers)如白血病的形式。治療癌癥患者的醫(yī)生有各種各樣的藥物療法和非藥物療法供選擇。然而，在對(duì)具體的患者確定適當(dāng)?shù)寞煼〞r(shí)，卻是有問題的，原因是，雖然某些治療可以匹配于某些癌癥類型，但是患者對(duì)一特定治療的反應(yīng)卻是不一致的。
許多有希望的抗癌藥劑包含葡萄糖或者葡萄糖樣部分(glucose-likemoiety)，并且因此可以是協(xié)助細(xì)胞攝取葡萄糖的膜蛋白——葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物。例子包括抗癌藥鏈脲菌素(STZ)、glucofosfamide和2gluSNAP，其它的含葡萄糖或者含葡萄糖類似物的藥物正在開發(fā)之中。這些藥物的葡萄糖樣部分介導(dǎo)向癌細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，因此這里利用了這樣一個(gè)事實(shí)相對(duì)于正常細(xì)胞，許多癌細(xì)胞顯示出增加的葡萄糖代謝，這被認(rèn)為是部分地歸因于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白數(shù)量的增加(參見Medina et al.，2002，Biol Res.359-26)。然而，不是所有的患者(或者癌癥)對(duì)藥物治療例如鏈脲霉素、glucofosfamide和2gluSNAP都起反應(yīng)。幫助預(yù)測(cè)哪些患者最可能受益于采用特定的抗癌藥劑和特定類型的藥劑的特定治療的方法，可以使醫(yī)生更有效地治療癌癥和對(duì)患者提供顯著的益處。本發(fā)明便提供了這樣的方法。
發(fā)明概述 本發(fā)明包括多個(gè)方面，但是一般地，提供了方法和試劑，它們用于篩選癌癥患者，以確定他們所患有的癌癥對(duì)采用含葡萄糖或葡萄糖類似物的抗癌藥劑的治療是否敏感。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了方法，用于將癌細(xì)胞中一種或者多種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平與所述細(xì)胞對(duì)抗癌藥劑的敏感性相關(guān)聯(lián)，其中所述抗癌藥劑是由所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)送的，例如含葡萄糖或者葡萄糖類似物的抗腫瘤藥劑。在一種實(shí)施方案中，藥劑含有葡萄糖部分(moiety)；在其它的實(shí)施方案中，藥劑含有2-脫氧葡萄糖部分或者果糖部分。
在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了方法，用于確定癌癥對(duì)抗腫瘤藥劑治療是否敏感，通過下列步驟實(shí)施(a)獲取癌癥樣品；(b)測(cè)定該樣品中至少一種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平；(c)將該水平與預(yù)先確定的值比較；(d)如果測(cè)定的水平比預(yù)先確定的值高，則確定該癌癥對(duì)該抗腫瘤藥劑治療是敏感的。在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了方法，用于確定人類癌癥對(duì)抗癌藥劑治療是否敏感，其中所述抗癌藥劑含有葡萄糖或者葡萄糖類似物，并由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，所述方法包括獲取所述癌癥的樣品；測(cè)定所述樣品中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的量；將所述樣品中的所述量與預(yù)先確定的值相比較；如果所述量比預(yù)先確定的值高，則確定，所述癌癥對(duì)所述抗癌藥劑敏感并且可以用該藥劑治療，或者，如果所述量比所述預(yù)先確定的值低，則確定，所述癌癥對(duì)所述抗癌藥劑不敏感或者具有降低的敏感性。
在一種實(shí)施方案中，癌癥樣品中多于一種的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平被測(cè)定。在一種實(shí)施方案中，I類和/或II類和/或III類GLUT葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平被測(cè)定。各種方法可以被用來測(cè)定樣品中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平。一種方法是免疫學(xué)分析。另一種合適的方法涉及RNA擴(kuò)增或者cDNA擴(kuò)增。在一種實(shí)施方案中，處理所述的人類癌癥樣品，它可以是例如，新鮮的、冷凍的、固定化的或者固定化并用石蠟包埋的腫瘤細(xì)胞樣品，從所述樣品分離出總蛋白，用特異于所述葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的一種或者多種的抗體接觸分離物，通過檢測(cè)抗體和所述葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間形成的復(fù)合物，確定所述分離物中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平。在其它的實(shí)施方案中，通過用有別于抗體的試劑檢測(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，例如，通過測(cè)定新鮮組織樣品中的葡萄糖攝取，或者通過測(cè)定一個(gè)或者多個(gè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的信使RNA，或者，通過測(cè)定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其相應(yīng)基因的活性，確定樣品中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平或者含量。
在本方法的一種實(shí)施方案中，癌癥樣品中的GLUT2水平被測(cè)定。在本方法的另一種實(shí)施方案中，抗癌藥劑是鏈脲菌素治療。在另一種實(shí)施方案中，癌癥是胰腺癌或者胰島細(xì)胞癌。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，GLUT2水平被測(cè)定，抗癌藥劑是鏈脲菌素、glucofosfamide或者gluSNAP化合物，癌癥是胰腺癌或者胰島細(xì)胞癌。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在本發(fā)明的實(shí)踐中有用的試劑盒。在一種實(shí)施方案中，試劑盒包括本方法的診斷篩查試劑及其使用說明書。在另一種實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包括含有葡萄糖或者葡萄糖類似物的抗腫瘤治療藥劑。
下面的詳細(xì)描述、實(shí)施例和權(quán)利要求，更加詳細(xì)地描述了本發(fā)明的這些方面和其它方面以及實(shí)施方案。
發(fā)明詳述1.引言
本發(fā)明提供了方法、試劑和設(shè)備，它們?cè)谠u(píng)價(jià)癌癥對(duì)抗癌藥劑治療是否敏感，或者癌癥對(duì)抗癌藥劑的敏感程度方面，是有用的。在一個(gè)方面，抗癌藥劑是由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)送的藥物，例如包含葡萄糖或者葡萄糖類似物部分的藥物，其是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物。如本文所應(yīng)用，如果確定了一種癌癥對(duì)藥物治療“敏感”，這便意味著，與被確定為對(duì)該藥劑不“敏感”的腫瘤相比，對(duì)該藥劑“敏感”的腫瘤被該藥物有效地在治療上抵抗的可能性更高。因此，癌癥對(duì)一種藥物或者一類藥物的治療是否敏感的判斷，提供了確定用于治療患者的化學(xué)治療方案的方法。
在本發(fā)明的一些方法中，從患者獲得癌癥樣品并進(jìn)行檢測(cè)，以確定一種或者多種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平；將表達(dá)高水平的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的癌癥確定為，對(duì)抗癌藥劑的化學(xué)治療敏感，其中所述的抗癌藥劑含有葡萄糖或者葡萄糖部分并且由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸。相反地，將表達(dá)低水平的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的癌癥確定為，對(duì)這樣的化學(xué)治療不敏感(或者較不敏感)。根據(jù)本發(fā)明方法的治療前篩選(pre-therapy screening)使醫(yī)生可以更有效地治療癌癥，因?yàn)槠涮峁┙o了醫(yī)生一種方法，用以確定抗癌藥劑治療是否會(huì)有效，如果不是有效的，則應(yīng)用可能更有效的化合物治療該癌癥，如果是有效的，則應(yīng)用該藥劑進(jìn)行治療。
術(shù)語“葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白”以兩種相關(guān)但略微不同的意義，被用在醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中。在第一種意義中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是轉(zhuǎn)運(yùn)化合物(不論是葡萄糖、葡萄糖類似物、其它糖類例如果糖或者肌醇，或者非糖類例如抗壞血酸)穿過細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)，并且基于結(jié)構(gòu)相似性(例如，與其它葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的同源性)，它們歸為葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白“家族”成員。然而，相信一些“葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白”的主要底物是不同于葡萄糖的物質(zhì)。例如，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT5主要是果糖的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，據(jù)報(bào)道，它以低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖本身。類似地，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HMIT的主要底物是肌-肌醇(myo-inositol，一種糖醇)。如本文所應(yīng)用，除非另有指明，術(shù)語“葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白”包括果糖和肌醇的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在一個(gè)方面，本發(fā)明預(yù)期了，測(cè)定任何葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平，以評(píng)價(jià)腫瘤對(duì)抗癌藥劑的敏感性，其中所述的抗癌藥劑由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(包括但不限于，選自GLUT1-12、HMIT和SGLT1-6轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明預(yù)期了，測(cè)定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平，該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以高于果糖、肌醇、H+-肌肌醇或者非糖類例如抗壞血酸的親和力轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖，以評(píng)價(jià)腫瘤對(duì)抗癌藥劑的敏感性，其中所述抗癌藥劑包含葡萄糖或者葡萄糖類似物部分，由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，測(cè)定癌癥樣品中一種或者多種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平，并與參照值(多個(gè)值)相比較。相對(duì)于所述參照值，癌癥細(xì)胞中高的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平提示，腫瘤對(duì)含有葡萄糖或者葡萄糖類似物部分的一類抗癌藥劑中的成員的治療敏感。
因此，在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明包含了用于確定癌癥對(duì)抗腫瘤藥劑治療是否敏感的方法，其中所述藥劑包含由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入癌癥細(xì)胞的葡萄糖或者葡萄糖類似物，所述方法包括下列步驟(a)獲取所述癌癥的樣品；(b)測(cè)定所述樣品中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的量或者活性；(c)將步驟(b)中測(cè)定的所述量或者活性與預(yù)先確定的量或者活性相比較；和(d)如果所述的測(cè)定量或者測(cè)定活性大于所述預(yù)先確定的量或者活性，則確定所述癌癥對(duì)所述治療敏感，如果所述的測(cè)定量小于所述預(yù)先確定的量或者活性，則確定所述癌癥對(duì)所述治療不敏感或者較不敏感。
在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明包含了用于確定患者對(duì)抗腫瘤藥劑治療是否敏感的方法，其中所述的藥劑包含由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入癌癥細(xì)胞的葡萄糖或者葡萄糖類似物，所述方法包括下列步驟(a)診斷患者患有癌癥；(b)從所述患者獲取所述癌癥的樣品；(c)測(cè)定所述樣品中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的量或者活性；(d)將步驟(c)中測(cè)定的所述量或者活性與預(yù)先確定的量或者活性相比較；和(e)如果所述的測(cè)定量或者測(cè)定活性大于所述預(yù)先確定的量或者活性，則確定所述患者對(duì)所述治療敏感，如果所述的測(cè)定量或者測(cè)定活性小于所述預(yù)先確定的量或者活性，則確定所述患者對(duì)所述治療不敏感。
在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明包含了用抗腫瘤藥劑治療癌癥患者的方法，其中所述的抗腫瘤藥劑包含由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入癌癥細(xì)胞的葡萄糖或者葡萄糖類似物，所述方法包括下列步驟(a)從所述患者獲取所述癌癥的樣品；(b)測(cè)定所述樣品中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的量或者活性；(c)將步驟(b)中測(cè)定的所述量或者活性與預(yù)先確定的量或者活性相比較；和(d)如果所述的測(cè)定量或者測(cè)定活性大于所述的預(yù)先確定的量或者活性，則確定所述癌癥對(duì)所述治療敏感，如果所述的測(cè)定量或者測(cè)定活性小于所述預(yù)先確定的量或者活性，則確定所述癌癥對(duì)所述治療不敏感；和如果所述的測(cè)定量或者測(cè)定活性大于所述預(yù)先確定的量或者活性，則(e)用該抗腫瘤藥劑治療癌癥患者。
在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明包含了用抗腫瘤藥劑治療患者的方法，其中所述的抗腫瘤藥劑包含由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入癌癥細(xì)胞的葡萄糖或者葡萄糖類似物，所述方法包括下列步驟(a)診斷患者患有癌癥；(b)從所述患者獲取所述癌癥的樣品；(c)測(cè)定所述樣品中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的量或者活性；(d)將步驟(c)中測(cè)定的所述量或者活性與預(yù)先確定的量或者活性相比較；(e)如果所述的測(cè)定量或者測(cè)定活性大于所述的預(yù)先確定的量或者活性，則確定所述癌癥對(duì)所述治療敏感，如果所述的測(cè)定量或者測(cè)定活性小于所述的預(yù)先確定的量或者活性，則確定所述癌癥對(duì)所述治療不敏感；和如果所述的測(cè)定量或者測(cè)定活性大于所述的預(yù)先確定的量或者活性，則(f)用該抗腫瘤藥劑治療癌癥患者。
2.“抗癌藥劑(ANTI-CANCER AGENTS)”和“抗腫瘤藥劑(ANTI-NEOPLASTICAGENTS)”
抗癌藥劑是預(yù)防或者阻止患者癌細(xì)胞生長(zhǎng)和/或播散的化合物。給予抗癌藥劑可以引起疾病進(jìn)程的延遲或者減慢、疾病狀態(tài)的改善或者減輕、好轉(zhuǎn)(不論部分地或者完全地)，和/或延長(zhǎng)存活(與沒有接受治療的情形下的期望存活相比)。目前正在應(yīng)用或者在開發(fā)中的抗癌藥劑包括但不限于，烷化劑、蒽環(huán)類藥物、抗生素、代謝毒物、放射性核苷酸、金屬毒物、酶抑制劑、芳香化酶抑制劑、雙磷酸脂、環(huán)加氧酶抑制劑、雌激素受體調(diào)節(jié)劑、葉酸拮抗劑、無機(jī)砷酸鹽、微管抑制劑、修正劑(modifiers)、亞硝基脲、核苷類似物、正長(zhǎng)石抑制劑(orthoclaseinhibitors)、含鉑化合物、類視色素(retinoid)、拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶2抑制劑和酪氨酸激酶抑制劑。
本發(fā)明的主要興趣在于，由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入癌細(xì)胞的抗癌藥劑。就此而言，術(shù)語“抗腫瘤藥劑”被用來指代這樣的抗癌藥劑，從而將它們與不由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入癌細(xì)胞的抗癌藥劑(例如，順鉑、Bevacizumab、Pemetrexed和類似藥劑)區(qū)分開來?？鼓[瘤藥劑包括含有葡萄糖部分或者葡萄糖類似物部分的分子，所述的葡萄糖部分或者葡萄糖類似物部分有助于通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，或者否則，允許通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞。在一種實(shí)施方案中，葡萄糖類似物本身是抗腫瘤藥劑。這樣的藥劑的例子是2-脫氧葡萄糖(2-DG)。其它的例子包括2-氟-2-脫氧葡萄糖(2-FDG)和放射標(biāo)記的2-FDG化合物如2-18FDG。在另一種實(shí)施方案中，將葡萄糖部分或者葡萄糖樣部分連接到(conjugated to)另一部分，該另一部分例如是細(xì)胞毒性化合物，其本身(即，當(dāng)不與葡萄糖部分或者葡萄糖樣部分相連接時(shí))可以是如上面列舉的那些抗癌藥劑。例如，葡萄糖或者葡萄糖類似物部分可以僅僅起靶分子的作用，將附著在其上的細(xì)胞毒性藥劑帶入細(xì)胞。PCT出版物WO03/082301中描述了含有連接于毒性部分的葡萄糖或者葡萄糖類似物的抗腫瘤藥劑。在一種實(shí)施方案中，當(dāng)以非連接的形式被給予時(shí)，葡萄糖樣部分和其它部分均是無毒性的。在一種可選擇的實(shí)施方案中，當(dāng)被獨(dú)立地給予時(shí)，葡萄糖樣部分和其它部分均是有毒性的。
對(duì)于含有連接于葡萄糖或者葡萄糖類似物的部分的抗腫瘤藥劑，可以應(yīng)用任何鏈接，只要其與葡萄糖或者葡萄糖類似物部分以及非葡萄糖部分相容；例如，在WO03/082301或者在美國(guó)專利5,622,936中描述的任何鏈接?？鼓[瘤藥劑可以在任何功能位點(diǎn)附著于葡萄糖或者葡萄糖類似物，例如，在葡萄糖或者葡萄糖類似物的1位、2位、3位或者4位上。
作為可適用本發(fā)明篩選方法的抗腫瘤藥劑或者其一部分的葡萄糖類似物，在本領(lǐng)域中是已知的，包括但不限于，葡萄糖衍生物如D-(+)-2-脫氧葡萄糖、D-(+)-2-氨基-2-脫氧葡萄糖或者N-乙酰D-(+)-2-氨基-2-脫氧葡萄糖；D-甘露糖和甘露糖衍生物；D-葡萄糖和D-葡萄糖衍生物，包括但不限于D-3-氨基-3-脫氧-葡萄糖和D-2-氨基-2-脫氧-葡萄糖；以及D-半乳糖和半乳糖衍生物包括但不限于D-2-脫氧-D-半乳糖、D-4-氨基-4-脫氧-半乳糖和D-2-氨基-2-脫氧-半乳糖。因此，葡萄糖或者葡萄糖部分與D-葡萄糖或者衍生物如2-DG和2-葡糖胺的不同之處可以在于，它是其差向異構(gòu)體。此外，葡萄糖或者葡萄糖類似物部分可以是前述化合物中任意一個(gè)的氟化衍生物。而且，前述化合物中任意一個(gè)的環(huán)中的氧，可以用選自S、砜和類似物的電子等排物(isostere)所取代。例如，葡萄糖類似物可以是5-硫代-D-葡萄糖或者其衍生物。術(shù)語“葡萄糖類似物”也包括葡萄糖衍生物，包括但不限于，具有(C1-C12)?；蛘?C1-C12)烷基基團(tuán)的衍生物，其中所述的?；鶊F(tuán)或者烷基基團(tuán)通過-O-或-NH-基團(tuán)連接于葡萄糖分子的3位或者4位。另外，葡萄糖衍生物可以具有連接于1-、3-或者4-位的溶解或分配效應(yīng)物或者成分(solubility or partitioning effector or component)。
在一些實(shí)施方案中，葡萄糖類似物是果糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、肌醇(例如，肌-肌醇(myo-inositol)、scillo-inositol、muco-inositol和chiro-inositol)或者可作為葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物的其它糖醇(sugar alcohol)，或者可作為葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物的其衍生物，如表1中所列舉的那些。
包含葡萄糖或者葡萄糖類似物的大量抗腫瘤藥劑是已知的，而其它的正在實(shí)驗(yàn)或者開發(fā)中，以便用于將來的臨床用途。出于說明而非限制的目的，這樣的抗腫瘤藥劑的例子包括鏈脲菌素(streptozotocin)、glucofosfamide、糖基-S-亞硝基硫醇(glyco-S-nitrosothiol)(包括2gluSNAP)、單質(zhì)子發(fā)射放射性示蹤劑(singleproton-emitting radio tracers)(包括2-O-(3′-碘苯甲基)-D-葡萄糖和N-(4′-碘苯甲基)-D-葡糖胺)、WO03/082301中描述的2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)和2-DG結(jié)合物(conjugates)、WO02/058741中描述的結(jié)合物、WO99/20316中描述的結(jié)合物、美國(guó)專利6,489,302中描述的結(jié)合物、美國(guó)專利5,622,396中描述的結(jié)合物，和它們的衍生物和類似物。
鏈脲菌素[2-脫氧-2-(3-甲基-3-亞硝基-脲基)-D-葡萄糖；N-甲基亞硝基氨基甲酰-D-葡糖胺；STZ；ZanosarTM]是一種抗有絲分裂的烷化劑，其中具有細(xì)胞毒性的N-亞硝基脲基團(tuán)附著于葡萄糖胺的2位。FDA已經(jīng)證實(shí)，鏈脲菌素治療胰島細(xì)胞癌和類癌瘤。與其它的亞硝基脲類似物相比，鏈脲菌素選擇性地靶向于胰腺的β-細(xì)胞，這歸因于該化合物中存在葡萄糖部分，其似乎介導(dǎo)了被表達(dá)GLUT2的細(xì)胞攝入的過程(參見，Schnedl et al.，Nov.1994，Diabetes 431326-33；Elsner etal.，Dec.2000，Diabetologia 431528-33；Hosokawa et al.，Dec.2001，Biochem.Biophys.Res.Commun.2891114-17；Wang et al.，Jan.1998，Diabetes 4750-56；andWang et al.，1995，Exp.Clin.Endocrinol.Diabetes 103 Suppl.283-97)。參見，例如，美國(guó)專利3,694,428和3,940,383。
抗腫瘤藥劑glucofosfamide(β-D-葡糖基-異環(huán)磷酰胺芥；glc-IPM)含有細(xì)胞毒劑異環(huán)磷酰胺，它通過在葡萄糖1位的氧原子處的酯鍵和葡萄糖相連接(參見美國(guó)專利5,622,936和美國(guó)專利6,489,302)。已經(jīng)測(cè)試了glucofosfamide對(duì)接受一線治療的胰腺癌患者，和接受二線化學(xué)療法的非小細(xì)胞肺癌患者，以及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌和結(jié)腸癌患者的治療。參見，Niculescu-Duvaz，2002，Curer.Opin.Investit.Drug 31527-32。Briasoulis et al.，2000，J.Clin.Oncol.183535-44報(bào)道了，glucofosfamide的細(xì)胞攝取是由Na+-依賴型葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的。
糖基-S-亞硝基硫醇化合物可以被描述為與糖連接的細(xì)胞毒劑，已有報(bào)道稱，它優(yōu)選地靶向于過量表達(dá)GLUT1的腫瘤細(xì)胞(參見，Ramirez et al.，1996，Bioorg.Med.Chem.Lett.62575-80和Cantuaria et al.，2000，Cancer 88381-88)。代表性的糖基-S-亞硝基硫醇，2gluSNAP具有的結(jié)構(gòu)是，其中供給一氧化氮的細(xì)胞毒性部分(S-亞硝基-N-乙酰青霉胺)通過酰胺鍵在2位連接于2-脫氧葡糖胺。已經(jīng)報(bào)道，這些化合物靶向于過量表達(dá)GLUT1的腫瘤細(xì)胞(參見Ramirez et al.，supra，andCantuaria et al.，supra)。
對(duì)其而言本發(fā)明的篩選方法可以被應(yīng)用的其它抗腫瘤藥劑，是含有葡萄糖部分的化合物，其中所述的葡萄糖部分通過雜環(huán)基團(tuán)、烴基團(tuán)或者芳香族基團(tuán)連接于單光子發(fā)射部分，如PCT出版物WO99/20316中描述。這些化合物包括，例如，2-O-(3’-碘苯甲基)-D-葡萄糖和N-(4’-碘苯甲基)-D-葡糖胺?？梢赃B接于上面描述的葡萄糖或者葡萄糖類似物的抗腫瘤藥劑的其它例子包括，例如，釔-90、碘-125、碘-131、磷-32、羥基脲、triapine、5-HP、喜樹堿和其類似物、卡鉑及其類似物、DOTA和其它的radiomethal離子螯合劑、甲氨蝶呤及其類似物、米托蒽醌和相關(guān)的蒽醌結(jié)構(gòu)、小的激酶抑制劑、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)或者丙卡巴肼(Procarbazine)，和絲裂霉素。
不同于葡萄糖和葡萄糖類似物的化合物由一種或者多種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。例如，也已報(bào)道，抗壞血酸以脫氫抗壞血酸的形式通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞。參見，Vera et al.，1004，Blood 841628-34和Agus et al.，1997，JClin.Invest.1002842-48。質(zhì)子/肌肌醇共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HMIT)是葡萄糖易化擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類別(facilitative glucose transporter class)的一個(gè)成員，其對(duì)于myo-、scillo-、muco-和chiro-inositol是具有選擇性的。轉(zhuǎn)運(yùn)是高親和力的(Km＝100uM)，并且在低pH時(shí)會(huì)增加，在pH＝5.0時(shí)達(dá)到最大速率。
本文所描述的抗腫瘤藥劑可以作為基本的、單一藥劑治療而用于癌癥治療，也可以與放射療法、手術(shù)或其它的抗癌藥劑以及這些療法的組合進(jìn)行聯(lián)合治療。
3.葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白
如上面所指出，在本發(fā)明的一個(gè)方面，癌癥樣品中的一種或者多種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平被測(cè)定。因此，了解葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的性質(zhì)及類型，可以提供給實(shí)踐者有關(guān)本發(fā)明的指導(dǎo)。
葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括葡萄糖易化擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員(GLUT/SLC2A)、鈉依賴性葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SGLT/SLC5A)、H+/肌-肌醇共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HMIT1)，以及前述的人或哺乳動(dòng)物同源物(homologs)和直向同源物(orthologs)。出于說明而非限制的目的，代表性的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，包括表1中列舉的那些。
表1

*對(duì)具體序列的引用是為了說明的目的，而不是要以任何方式限制本發(fā)明。例如，對(duì)于第1欄中列舉的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以存在其它的或者可選擇的序列，包括但不限于，多態(tài)序列和其它的變異體。
**EMBL序列編號(hào)1.Mueckler et al.1985，Science 229941-5；2.Gould et al.1991，Biochem.305139-45；3.Fukumoto et al.1988，PNAS 855434-8；4.Kayano et al.1988，J.of Biol.Chem.26315245-8；5.Fukumoto et al.1989，J.of Biol.Chem.2647776-9；6.Jameset al.1989，Nature 33883-7；7.Kayano et al.1990，J.of Biol.Chem.26513276-82；8.Davidson et al.1992，Am.J.of Physiol.262C795-C800；9.Doege et al.2000a，Biochem.J.350771-6；10.Lisinski et al.，2001，Biochem.J.358517-22；11.Joost &Thorens，2001，Mol.Membrane Biol.18247-56；12.Carayannopoulos et al.2000，PNAS 977313-8；13.Doege et al.2000b，J.of Biol.Chem.27516275-80；14.Ibberson et al.2000，J.of Biol.Chem.2754607-12；15.Phay et al.2000，Surgery 128946-51；16.Dawson et al.2001，Mol.Genetics and Metabol.74186-99；17.McVie-Wylie et al.2001，Genomics 72113-7；18.Doege et al.2001，Biochem.1 J 359443-9；19.Wu et al.2002，Mol.Genetics and Metabol.7637-45；20.Sasaki et al.2001，Biochem.and Biophys.Res.Comm.2891218-24；21.Rogers et al.2002，Am.J.ofPhysiol.282E733-8；22.Udry et al.2001，EMBO J.204467-7；23.Hediger et al.1989，PNAS，86(5)5748-52；24.Wells et al.，1992，Am.J.Physiol.263(3)F459-65；25.Kanai et al.，1994，J Clin Invest.93(1)397-404；26.Diez-Sampedro，2003，PNAS，100(20)11753-8；27.Wood & Trayhurn，2003，British J.Nutr.893-9；28.Wu et al.，2002，Genomics 80553-7；29.美國(guó)專利申請(qǐng)20030228592。
3.1GLUTs
在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是非Na+依賴型易化擴(kuò)散糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或者葡萄糖易化擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白?！捌咸烟且谆瘮U(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(facilitative glucosetransporter)”或者“非Na+依賴型易化擴(kuò)散糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(facilitative Na+independentsugar transporter)”或者“GLUT”是指葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其利用底物如葡萄糖的跨細(xì)胞質(zhì)膜的擴(kuò)散梯度來轉(zhuǎn)運(yùn)底物。葡萄糖易化擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括但不限于，GLUT1、GLUT2、GLUT3、GLUT4、GLUT6、GLUT7、GLUT8、GLUT9、GLUT10、GLUT11、GLUT12、H+-偶聯(lián)的肌肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HMIT1。GLUT14與GLUT3具有94.5％的同一性，并且也包括在GLUT家族中。
葡萄糖易化擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通常具有12個(gè)跨膜螺旋。該蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域可以含有由水填充的通路，底物可以移動(dòng)通過該通路，在一些情況下，該蛋白的胞漿外結(jié)構(gòu)域可以含有帶有N連接寡糖部分的大環(huán)。該環(huán)可以在任何兩個(gè)連續(xù)的跨膜螺旋之間形成，例如，在第一個(gè)和第二個(gè)跨膜螺旋之間，或者在第九個(gè)和第十個(gè)跨膜螺旋之間形成。
在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括一種或者多種“葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白標(biāo)志(glucose transporter signature)”。如本文所應(yīng)用，“葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白標(biāo)志”是指兩種或者更多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上的保守殘基，其參與了該蛋白作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白標(biāo)志是跨膜螺旋1、2、4、5、7、8和10中7個(gè)甘氨酸殘基的存在。在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白標(biāo)志是該蛋白的細(xì)胞質(zhì)一面上的一個(gè)或者多個(gè)帶電殘基，它們?cè)谝阎腉LUTs中是保守的。參見Joost et al.，2001，Mol.Membrane Biol.18247-256。在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白標(biāo)志是下列中的一個(gè)或者多個(gè)螺旋6中的色氨酸、螺旋11中的色氨酸、螺旋4中的酪氨酸、螺旋7中的酪氨酸。在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白標(biāo)志是螺旋6之后的PXXPR基序。在其它的實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不包括這樣的PXXPR基序。
在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白標(biāo)志是緊接著螺旋10保守GXXPXP基序的色氨酸殘基(當(dāng)序列是與GLUT1比對(duì)時(shí)，則對(duì)應(yīng)于GLUT1中的色氨酸388)。在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白標(biāo)志是螺旋10中的色氨酸殘基(當(dāng)序列是與GLUT1比對(duì)時(shí)，則對(duì)應(yīng)于GLUT1中的色氨酸412)。已經(jīng)顯示，這些色氨酸殘基對(duì)于配體細(xì)胞松弛素B和弗司可林(forskolin)的結(jié)合是重要的，并賦予了葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)細(xì)胞松弛素B或弗司可林的敏感性。Garcia et al.，1992，J.Biol.Chem.2677770-76；Schurmann et al.，1993，Biochem.J.290497-501.因此，本發(fā)明的一些實(shí)施方案包含對(duì)細(xì)胞松弛素B或者弗司可林治療敏感的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分析。在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)細(xì)胞松弛素B或者弗司可林的結(jié)合親和力低。在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)細(xì)胞松弛素B或者弗司可林的結(jié)合親和力高。
在本發(fā)明的實(shí)踐中分析的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)葡萄糖或者葡萄糖類似物具有不同的親和力。因此，在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白顯示了對(duì)葡萄糖的高親和力。如文中所應(yīng)用，對(duì)于GLUTs，“高親和力”意味著，應(yīng)用Burant et al.，1992，J.Biol.Chem.26714523-26中描述的非洲爪蟾卵母細(xì)胞分析，KM小于5mM；對(duì)于SGLTs，“高親和力”意味著K0.5值小于1mM，優(yōu)選地小于0.5mM，這是應(yīng)用Panayotova-Heiermann et al.，1996，J.Biol.Chem.27110029-34中描述的雙微電極鉗分析(two-microelectrode clamp assay)測(cè)定的。在其它的實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白顯示了對(duì)葡萄糖的低親和力。在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)葡萄糖/葡萄糖類似物的結(jié)合親和力在不同的組織中是不同的，或者在不同的生理?xiàng)l件下，例如在疾病狀態(tài)如癌癥時(shí)，是不同的。
根據(jù)序列相似性和特征性元件，可以將已知的GLUT蛋白組分為三個(gè)更小的亞組，即I類(GLUT1-4)、II類(GLUT5、GLUT7、GLUT9和GLUT11)和III類(GLUT6、8、10、12和HMIT1)。參見Joost et al.，2001，Mol.Membr.Biol.18247-56。在一些腫瘤組織中觀察到GLUT的異常和/或過量表達(dá)(參見綜述Smith，1999，Br.J.Biomed.Sci.564285-92；Bell et al.，1990，Diabetes Care 13198-206)。
3.1.1 I類GLUTs
I類葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以含有序列基序(葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白標(biāo)志)例如螺旋5處的谷氨酰胺(當(dāng)序列與GLUT1比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于GLUT1中的Q161)。在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白含有在細(xì)胞外的環(huán)7(即，在跨膜螺旋7和跨膜螺旋8之間的環(huán))中的STSIF基序。在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白含有在螺旋7處的QLS基序。據(jù)報(bào)道，I類葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在各種實(shí)體腫瘤中表達(dá)，例如乳腺癌、腎細(xì)胞癌、腦腫瘤、胃腸惡性瘤和宮頸癌。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，I類葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平被測(cè)定。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，GLUT1水平被測(cè)定。已經(jīng)報(bào)道，GLUT1在各種惡性組織中被過量表達(dá)，包括膀胱、乳腺、宮頸、結(jié)直腸、胃、食道、頭和頸部的腫瘤、平滑肌肉瘤、肺、卵巢、胰腺、陰莖、甲狀腺、子宮、脈管的腫瘤和青少年的血管瘤。Medina et al.，2002，Biol.Res.359-26.也已顯示，GLUT1的表達(dá)與腫瘤缺氧有關(guān)。Airley et al.，2001，Clin.Cancer Res.7928-34；Chen et al.2001，J.Biol.Chem.129519-25。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，GLUT2水平被測(cè)定。已經(jīng)報(bào)道，GLUT2在胃癌中被過量表達(dá)。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，GLUT3水平被測(cè)定。已經(jīng)報(bào)道，GLUT3在腦癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、頭部和頸部癌癥、腦脊膜瘤和卵巢癌中被過量表達(dá)。GLUT3對(duì)葡萄糖有高親和力，并且被認(rèn)為在對(duì)作為養(yǎng)料的葡萄糖具有強(qiáng)烈需求的組織中例如腦中對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)負(fù)有責(zé)任。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，GLUT4水平被測(cè)定。已經(jīng)報(bào)道，GLUT4在乳腺癌、胃癌、肺癌和胰腺癌中被過量表達(dá)。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，GLUT14水平被測(cè)定。已經(jīng)報(bào)道，GLUT14有兩種剪接形式GLUT14的較短的形式是497個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，與GLUT3有94.5％的一致性。長(zhǎng)的形式是520個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，僅在N末端不同于短的形式。據(jù)報(bào)道，兩種異構(gòu)體在睪丸中均特異地表達(dá)。
3.1.2II類GLUTs
在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是II類GLUT。在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺乏鄰接螺旋10保守GXXPXP基序的色氨酸殘基(當(dāng)序列與GLUT1比對(duì)時(shí)，對(duì)應(yīng)于GLUT1中的色氨酸388)，該殘基賦予了葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)細(xì)胞松弛素B的敏感性。II類葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)細(xì)胞松弛素B的抑制不敏感(參見Joost et al.，2001，Mol.Mern.Biol.18247-56)。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，II類葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平被測(cè)定。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，GLUT5水平被測(cè)定。已經(jīng)報(bào)道，GLUT5在肺癌和乳腺癌中被過量表達(dá)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，GLUT7水平被測(cè)定。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，GLUT9水平被測(cè)定。最近鑒定出了GLUT9的一種另外的剪接形式，它僅在N末端與GLUT9不同。Auguatin et al.，2004，January22，J.Biol.Chem。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，GLUT11的水平被測(cè)定。對(duì)于GLUT11，已經(jīng)描述了兩種剪接變異體，一種長(zhǎng)的形式(503個(gè)氨基酸)和一種短的形式(493個(gè)氨基酸)。Doege et al.，2001，Biol.J.359443-49；Sasaki et al.，2001，Biochem.Biophys.Res.Comm.2891218-24。已經(jīng)報(bào)道，短形式的GLUT11介導(dǎo)低親和力的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，已經(jīng)顯示，短形式的GLUT11主要在心臟和骨骼肌中表達(dá)。已經(jīng)報(bào)道，長(zhǎng)形式的GLUT11在肝臟、肺、氣管和腦中表達(dá)，已經(jīng)顯示，長(zhǎng)形式的GLUT11增加果糖轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是GLUT11的長(zhǎng)的形式。在其它的實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是GLUT11的短的形式。在別的實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是GLUT11的衍生物、變異體或者密切的同源物(close homologue)。
3.1.3III類GLUTs
在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是III類GLUT。在一些III類GLUT中發(fā)現(xiàn)的基序包括，環(huán)9(即，跨膜螺旋9和跨膜螺旋10之間的環(huán))上的糖基化位點(diǎn)和靶基序(targeting motifs)。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，III類葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平被測(cè)定。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，GLUT6的水平被測(cè)定。據(jù)報(bào)道，GLUT6主要在腦、脾臟和外周白細(xì)胞中表達(dá)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，GLUT8的水平被測(cè)定。GLUT8在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，GLUT10的水平被測(cè)定。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，GLUT12的水平被測(cè)定。已發(fā)現(xiàn)，GLUT12在乳腺腫瘤中表達(dá)。參見Rogers et al.，2003，Cancer Letters，93225-33；Rogers et al.，2002，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.282(3)E733-8。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，HMIT1的水平被測(cè)定。
3.2SGLTs
在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是Na+依賴型葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na+-dependent glucose co-transporter)。“Na+依賴型葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白”或者“Na+/葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白”是指葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其以能量依賴的方式主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖或者葡萄糖類似物。一些Na+依賴型葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白利用Na+沿電化學(xué)梯度的運(yùn)動(dòng)來驅(qū)動(dòng)葡萄糖或者葡萄糖類似物的攝取。Na+依賴型葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括但不限于，SGLT1、SGLT2、SGLT3、SGLT4、SGLT5和SGLT6。參見表1；也參見Coady et al.，2002，″Identification of a novel Na+/myo-inositol cotransporter.″J BiolChem.27735219-24。在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是高親和力、低容量(capacity)的Na+依賴型葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是低親和力、高容量的Na+依賴型葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
在一些實(shí)施方案中，Na+依賴型葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括14個(gè)跨膜螺旋。在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)一步包括位于螺旋6和螺旋7之間的N-鏈接糖基化位點(diǎn)，并且已經(jīng)顯示，該位點(diǎn)在幾種已知的SGLT間保守。參見，Wright，Am.J.Physiol.Renal Physiol.2001，280(1)F10-8。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，SGLT1水平被測(cè)定。SGLT1具有高的葡萄糖親和力，報(bào)道的Na+/葡萄糖結(jié)合比是2∶1。據(jù)報(bào)道，SGLT1在幾種腸腫瘤細(xì)胞系和原發(fā)肺癌中表達(dá)。Bissonette et al.，1996，Am.J.Physiol.，270G833-G843；Delezay et al.，1995，J Cell Playsiol.163120-128；Ishikawa et al.，2001，Jpn.J CancerRes.92874-79。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，SGLT2的水平被測(cè)定。已經(jīng)報(bào)道，SGLT2是低親和力、高容量的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，報(bào)道的Na+/葡萄糖結(jié)合比是1∶1。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，SGLT3的水平被測(cè)定。已經(jīng)報(bào)道，SGLT3(原來的名稱是SAAT1)介導(dǎo)化療劑β-D-葡糖苷異磷酰胺芥(glucosyllisophosphoramide mustard)(D-19575)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。Vehyl et al.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，952914-19。最近，已有人提出，SGLT3不是Na+/葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，而是膽堿能神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)膜、骨骼肌和其它組織中的葡萄糖感受器(Diez-Sampedro et al.，2003，″A glucose sensor hiding in a family oftransporters″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 10011753-8)。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，水平被測(cè)定的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不是SGLT3，或者不包括SGLT3。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，SGLT4的水平被測(cè)定。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，SGLT5的水平被測(cè)定。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，SGLT6的水平被測(cè)定。
明顯的是，除表1中描述的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之外的其它葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平，可以在本發(fā)明的實(shí)踐中被測(cè)定。例如，表1中列舉的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的任意一種的衍生物、同工型、變異體、突變體和同源物，包括在其它哺乳動(dòng)物中的同源物，可以被測(cè)定，或者它們的水平或者活性被測(cè)定。進(jìn)一步地，本發(fā)明的方法適用于將來可能被發(fā)現(xiàn)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，例如具有已知的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)特征或者序列特征的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(包括，例如，與表1中列舉的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列相似性為至少28％、至少30％、至少50％、至少60％、至少80％、至少90％的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)。
4.確定癌癥對(duì)抗腫瘤藥劑治療的敏感性
在一方面，本發(fā)明的方法涉及，測(cè)定患者的癌癥樣品中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平。將該水平與參照值(reference value)相比較，以確定該癌癥是否由于表達(dá)高水平的一種或者多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而對(duì)抗腫瘤藥劑治療敏感。如下面更詳細(xì)的解釋，在本發(fā)明的不同方面，癌癥樣品中單一的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平被測(cè)定，癌癥樣品中多種不同的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平被獨(dú)立地測(cè)定(即，對(duì)于每一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平，不同的值被測(cè)定)，和/或用聯(lián)合的測(cè)定方法測(cè)定癌癥樣品中兩種或者更多種不同的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(例如，通過應(yīng)用識(shí)別多于一種的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的探針的分析，或者通過應(yīng)用多個(gè)探針的分析)。
如此處所應(yīng)用，詞語“水平(level)”是指可以反映癌癥樣品中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的數(shù)目的任何量度，在不同的實(shí)施方案中，它可以是定量的、半定量的或者是相對(duì)的(例如，僅僅被確定為“多于”或者“少于”另一個(gè)類似地測(cè)定的水平)。此數(shù)目可以從各種各樣的不同量度中推斷出來。例如，此數(shù)目可以從葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的含量、信使RNA的豐度，或者從樣品中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性被推斷出來。下面描述了可以在本發(fā)明中應(yīng)用的許多分析方法，并且，對(duì)于實(shí)施者來說，經(jīng)本公開指導(dǎo)后，其它的分析方法將是顯然的。
在一些實(shí)施方案中，將樣品中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的測(cè)定值標(biāo)準(zhǔn)化為，每個(gè)細(xì)胞、每克組織、每mm3組織或者類似標(biāo)準(zhǔn)中的量(或者數(shù)目)。如同本領(lǐng)域中所知，也可以通過參考在樣品中的第二種蛋白的豐度，將癌癥樣品中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平標(biāo)準(zhǔn)化，將轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平表示為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與第二種蛋白的數(shù)量比值。這種方法的優(yōu)勢(shì)在于，通過選擇一種在不同條件下以相對(duì)恒定的水平表達(dá)的蛋白，可以使蛋白質(zhì)合成的普遍抑制、細(xì)胞凋亡或者分析過程中的物質(zhì)丟失所造成的影響最小化。合適的“第二種蛋白”包括但不限于，結(jié)構(gòu)蛋白，如肌動(dòng)蛋白、微管蛋白和甘油醛-3-磷酸脫氫酶。當(dāng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)NA水平被測(cè)定時(shí)，可以應(yīng)用比較的標(biāo)準(zhǔn)化(例如，通過將轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)NA水平和核糖體RNA或者編碼結(jié)構(gòu)蛋白的mRNA相比較)。在一個(gè)方面，腫瘤中的葡萄糖-6-磷酸酶活性也被測(cè)定，并且將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平表示為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(蛋白、RNA或者活性)與葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)蛋白、RNA或者活性的比值。高比值提示，對(duì)抗腫瘤藥劑治療的敏感性增加。葡萄糖和一些葡萄糖類似物在進(jìn)入細(xì)胞后被磷酸化，導(dǎo)致累積，并且在某些類似物的情形下，由于細(xì)胞中磷酸化形式的累積，導(dǎo)致了增加的毒性。對(duì)葡萄糖-6-磷酸酶的表達(dá)分析和活性分析是已知的(參見，例如，Schmoll et al.，2001，Cancer Letters，16785-90；Taketa et al.，1998，Cancer Res.48467-74)。在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平對(duì)葡萄糖-6-磷酸酶水平的比率被測(cè)定。比率越高，患者的癌癥對(duì)含有葡萄糖或者葡萄糖類似物的抗腫瘤藥劑的治療越敏感。
在另一種實(shí)施方案中，癌癥樣品中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平被表示為，癌癥樣品中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平與同一患者的匹配的非腫瘤組織中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平的比值?！捌ヅ涞姆悄[瘤組織(matching non-tumor tissue)”是指非癌組織的樣品，優(yōu)選地，匹配的非腫瘤樣品或者非惡性樣品來源于，與腫瘤樣品的來源器官相同的器官。最優(yōu)選地，匹配的非腫瘤樣品來源于，與腫瘤樣品的來源相同的器官組織層。而且，優(yōu)選的是，在對(duì)腫瘤樣品進(jìn)行活組織檢查的同時(shí)，獲取匹配的非腫瘤組織樣品。例如，當(dāng)從胰腺腫瘤獲取組織以用于本發(fā)明用途時(shí)，實(shí)施者也可以從遠(yuǎn)離腫瘤的位置獲取非惡性的胰腺組織。然后，測(cè)定每一樣品中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平，如果腫瘤樣品中的測(cè)定水平超過正常樣品中的水平，則確定該腫瘤對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抗癌藥劑治療是敏感的。
在一種相關(guān)的實(shí)施方案中，將癌癥樣品中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平表示為，癌癥樣品中的癌(惡性轉(zhuǎn)化的)細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平與來自相同樣品的非癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平的比。此比值可以被方便地測(cè)定，因?yàn)楫?dāng)從對(duì)象獲取癌癥樣品(例如，通過活組織檢查)時(shí)，該樣品通常也包括非癌細(xì)胞，非癌細(xì)胞可以通過觀察或者應(yīng)用組織學(xué)方法，或者通過檢測(cè)癌癥特異性分子標(biāo)記物的缺失而被鑒定。
盡管轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平最通常地是在來自對(duì)象的單個(gè)癌癥樣品(和可任選的單個(gè)非癌癥樣品)中被測(cè)定；但在一些實(shí)施方案中，該癌組織和/或正常組織的幾份生物樣品可以從單個(gè)對(duì)象中獲得，以便得到針對(duì)該對(duì)象的平均值。
4.1.參照值
將癌癥樣品中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平與參照值比較，以確定對(duì)抗腫瘤藥劑治療的相對(duì)敏感性。對(duì)于特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，將被理解的是，對(duì)于不同的癌癥，用于確定對(duì)治療的敏感性的參照值可以不同?？梢詰?yīng)用各種方法來確定具體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參照值。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，一種癌癥類型的參照值是通過評(píng)價(jià)癌癥樣品中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平(多個(gè)水平)而被確定的，所述癌癥樣品來自許多不同的患者，此處被稱為“調(diào)查人群(survey population)”。通常地，調(diào)查人群中的患者和癌癥樣品的來源對(duì)象，均患有相同類型的癌癥。例如，在一種實(shí)施方案中，分析來自10、50、100、200、500或者1000或者更多個(gè)患者的胰腺癌樣品的GLUT2水平。癌癥的“類型(type)”分類，在實(shí)踐者掌握的技能范圍內(nèi)和判斷能力范圍內(nèi)。通常地，癌癥“類型”是基于起源的組織(例如，胰腺癌、乳腺癌)，但是也可以基于階段、轉(zhuǎn)移、缺氧程度、預(yù)后標(biāo)志物的存在和類似的因素。用于將癌癥按類型分類的另一個(gè)參數(shù)是，某種抗癌藥劑或者某類抗癌藥劑(包括某些抗腫瘤藥劑或者某種特異性的抗腫瘤藥劑)在患有該癌癥“類型”的患者中所顯示出的效應(yīng)。如文中所應(yīng)用，“效應(yīng)(effect)”包括對(duì)抗癌藥劑(多種藥劑)治療的反應(yīng)(或缺乏反應(yīng))、被治療的患者增加的存活時(shí)間長(zhǎng)度，以及類似的效應(yīng)。除了匹配于癌癥類型之外，也可以根據(jù)患者特征例如性別、年齡和種族以及其它標(biāo)準(zhǔn)而匹配于調(diào)查人群和對(duì)象。
調(diào)查人群的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平(即，此處被稱為“調(diào)查值(survey values)”)將形成一種分布，它可以是單峰的、雙峰的或者多峰的。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，應(yīng)用此分布來確定合適的參照值，如前面所討論，將轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平高于參照值的癌癥鑒定為，對(duì)抗腫瘤藥劑治療敏感。參照值可以是單個(gè)截止值(cut-off value)，例如調(diào)查值分布的中位數(shù)或者均值，其中，將轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白值高于均值或者中位數(shù)的患者樣品鑒定為，對(duì)抗腫瘤藥劑治療敏感。在一種相關(guān)的實(shí)施方案中，參照值是調(diào)查值分布的百分位數(shù)，如60th百分位數(shù)、75th百分位數(shù)、90th百分位數(shù)和類似的數(shù)值。或者，參照值是一個(gè)范圍，例如，調(diào)查值的分布被劃分為相等的(或者不等的)部分，如象限，每一象限與對(duì)治療的敏感性水平相關(guān)聯(lián)(例如，最低的象限被關(guān)聯(lián)于最小的敏感性，最高的象限被關(guān)聯(lián)于最高的敏感性)。在一些情形下，調(diào)查值的分布是雙峰的(具有一個(gè)低范圍和一個(gè)高范圍)。在這樣的情形下，將具有在較高范圍內(nèi)的或者高于較高范圍的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平的癌癥樣品鑒定為，起源于對(duì)抗腫瘤藥劑治療敏感的癌癥。在一些情形下，調(diào)查值的分布是多峰的(帶有一個(gè)低范圍和多于一個(gè)的較高范圍)。在這種情形下，將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平大于低范圍的癌癥樣品，優(yōu)選地，將在較高范圍中又較高的范圍內(nèi)的癌癥樣品鑒定為，起源于對(duì)抗腫瘤藥劑治療敏感的癌癥。
在一些情形下，參照值可以是零或者接近零，例如當(dāng)一種癌癥類型(為了討論的目的，此處稱為“組織x”的癌癥)包括不表達(dá)指定的一種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或者多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一些腫瘤，又包括表達(dá)該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或者多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的其它腫瘤時(shí)。在這種情形下，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)的任何可檢測(cè)到的表達(dá)足以提示，患者是抗腫瘤藥劑治療的候選者。
將被理解的是，只要調(diào)查值(以及參照值)的單位與用于表示在癌癥樣品中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平的單位相同或者相似(或者，調(diào)查值和癌癥樣品水平可以被比較)，那么描述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平的具體方法就不是嚴(yán)格限定的，它將取決于癌癥的性質(zhì)、應(yīng)用的分析方法和實(shí)施者的優(yōu)先選擇。
在另一種實(shí)施方案中，調(diào)查人群是由不患有癌癥的對(duì)象(例如，健康的個(gè)體)組成的，并且對(duì)于一種癌癥類型，參照值是通過評(píng)價(jià)正常(非惡性)樣品中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平(多個(gè)水平)而確定的，所述樣品來自未被診斷為患有癌癥的對(duì)象(例如，健康對(duì)象)的匹配組織，所述的未被診斷為患有癌癥的對(duì)象構(gòu)成“調(diào)查人群”。由于正常樣品來自與腫瘤樣品的來源器官相同的器官，優(yōu)選地，來自相同的組織層，所以可以將正常樣品匹配于癌癥類型。參照值是大于正常值的中位數(shù)或者平均數(shù)的值，優(yōu)選地，是比正常樣品的75％的值大的值，常常是比正常樣品的90％的值大的值，有時(shí)比95％的大或者甚至比99％的大。
因此，可以應(yīng)用常規(guī)方法確定參照值，例如，收集癌癥樣品(或者正常樣品)并測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平。經(jīng)本公開的指導(dǎo)后，用于評(píng)價(jià)腫瘤對(duì)治療敏感性的具體閾水平的確定，合適范圍、患者類型、癌癥類型和類似因素的選擇，在醫(yī)學(xué)人員的技能范圍內(nèi)。將被理解的是，在作出這樣的確定時(shí)，實(shí)踐者可以應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。參見，例如，Marcello Pagano等的Principles of Biostatistics(BrookCole；2000)；Bernard Rosner的Fundamentals of Biostatistics(Duxbury Press，5th Ed，1999)；Wayne W.Daniels的Biostatisticsa Foundation for Analysis in the HealthScience(John Wiley & Sons，3rd Ed.；1983)；以及Knapp和Miller的ClinicalEpidemiology and Biostatistics(William and Wilkins，Harual Publishing Co.Malvern，PA 1992)。
如下面更詳細(xì)的討論，可以確定單一的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平。選擇性地，可以確定幾種不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平(例如，同時(shí)和/或總計(jì)，而不區(qū)分每一轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平)。在一種不同的實(shí)施方案中，針對(duì)細(xì)胞運(yùn)送化合物(例如指定的抗腫瘤藥劑或者化合物，所述化合物應(yīng)該由運(yùn)送所述指定抗腫瘤藥劑的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相同的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)送)的能力，對(duì)樣品中的所有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行分析。
4.2.分析
測(cè)定生物樣品中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平的方法在本領(lǐng)域中是已知的，僅僅是出于說明的目的和為了方便實(shí)踐者，此處進(jìn)一步描述了這樣的分析。合適的方法包括，例如，對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白分析、對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)NA的分析，以及對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的分析。
在下面以及在實(shí)施例中描述了分析方法。如無另外的指明，分析方法應(yīng)用的是傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)技術(shù)、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)、生物化學(xué)技術(shù)、核酸化學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)，所有技術(shù)均在普通技術(shù)人員的技能范圍之內(nèi)。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中被充分解釋，例如，MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL，第二版(Sambrook et al.，1989)和MOLECULARCLONINGA LABORATORY MANUAL，第三版(Sambrook and Russel，2001)(前面引用的兩份文獻(xiàn)在此被統(tǒng)稱為″Sambrook″)；CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987，包括2003全年的增刊和修訂本)；PCRTHE POLYMERASE CHAIN REACTION(Mullis et al.，eds.，1994)；Harlow and Lane，1988，ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，Cold SpringHarbor Publications，New York和Harlow and Lane，1999，USING ANTIBODIESALABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(此處被統(tǒng)稱為″Harlow and Lane″)，METHODS IN CELL BIOLOGY VOLUME37ANTIBODIES IN CELL BIOLOGY，Asai，ed.Academic Press，Inc.New York(1993)；BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY 7th Edition，Stites & Terr，eds.(1991)；Hames et al.，ed.，NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION，A PRACTICALAPPROACH IRL Press，(1985)；和Beaucage et al.，eds.，CURRENT PROTOCOLS INNUCLEIC ACID CHEMISTRY，2000，John Wiley & Sons，Inc.，New York)。
考慮到本文中的公開內(nèi)容，針對(duì)給定的患者，對(duì)具體分析方法進(jìn)行選擇是在實(shí)踐者的技術(shù)范圍內(nèi)，其依賴于許多因素，包括癌癥的類型和階段、是否進(jìn)行了切除術(shù)、癌癥樣品的可利用性，以及樣品的類型，樣品的類型可以是，例如，組織樣品或者組織提取物或者細(xì)胞或者細(xì)胞裂解物或者細(xì)胞提取物或者來自上述樣品類型的上清液，還依賴于實(shí)施者的方便和試劑是否可獲得以及花費(fèi)。
4.2.1生物樣品
通過從對(duì)象獲取生物樣品并檢測(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白、mRNA、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的其它標(biāo)志物的存在或者含量，可以確定癌癥樣品中或者非癌組織中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平。為了方便起見，術(shù)語“癌癥樣品(cancersample)”被用來表示其中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被測(cè)定的物質(zhì)(或是細(xì)胞的或是細(xì)胞衍生的)。通常地，癌癥樣品來源于人。應(yīng)用本領(lǐng)域中的已知方法，可以測(cè)定在組織樣品、組織提取物、細(xì)胞、細(xì)胞裂解物、細(xì)胞提取物、體液、腫瘤前細(xì)胞裂解物的上清液或者瘤裂解物的上清液中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平。
可以從任何癌癥獲得癌癥樣品，并且本發(fā)明的方法適用于任何癌癥，所述的癌癥包括但不限于白血病、乳腺癌、皮膚癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、腦癌、喉癌、膽囊癌、直腸癌、甲狀旁腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、神經(jīng)組織癌、頭頸部癌癥、結(jié)腸癌、胃癌、支氣管癌和腎癌；基底細(xì)胞癌、潰瘍型鱗狀細(xì)胞癌和乳頭型鱗狀細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性皮膚癌、骨肉瘤、尤因肉瘤(Ewing′s sarcoma)、網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤、骨髓瘤、巨細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺腫瘤、胰島細(xì)胞癌、原發(fā)性腦腫瘤、急性和慢性淋巴細(xì)胞瘤和粒細(xì)胞瘤、毛細(xì)胞瘤、腺瘤、過度增生、髓樣癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、粘膜神經(jīng)瘤、腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤(intestinal ganglloneuromas)、增生性角膜神經(jīng)瘤、類馬伐氏癥候群腫瘤(marfanoid habitus tumor)、腎母細(xì)胞瘤、精原細(xì)胞瘤、卵巢腫瘤、平滑肌腫瘤(leiomyomater tumor)、子宮頸發(fā)育不良和原位癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、軟組織肉瘤、惡性類癌、局部皮膚病損、蕈樣肉芽腫病、橫紋肌肉瘤、卡波西肉瘤、骨源性肉瘤和其它肉瘤、惡性高鈣血癥、腎細(xì)胞瘤、真性紅細(xì)胞增多癥、腺癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、白血病、淋巴瘤、惡性黑素瘤和表皮癌。
獲取組織樣品的方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且將根據(jù)腫瘤的類型和定位以及醫(yī)生的偏好而不同。在一種實(shí)施方案中，樣品是從手術(shù)切除的組織中獲得的。組織樣品和細(xì)胞樣品也可以不經(jīng)侵入性手術(shù)而獲得，例如，通過用細(xì)針插入胸壁或者腹壁或者從乳房塊、甲狀腺塊或者其它位點(diǎn)插入，并抽出細(xì)胞物質(zhì)(細(xì)針吸引活組織檢查)。
在另一種實(shí)施方案中，生物樣品是可能含有癌細(xì)胞的體液，其可以是，例如，血液、乳腺滲出液(例如，乳頭抽吸液)、糞便懸浮液、痰、粘液、尿液、淋巴液、胞液、腹水、胸膜滲出液、羊水或者膀胱清洗液。
獲得的生物樣品可以以新鮮的、冷凍的或者固定化的(例如，石蠟包埋)形式被使用，這取決于樣品的性質(zhì)、使用的分析和實(shí)施者的便利。盡管新鮮材料、冷凍材料和固定化材料均適合于各種RNA分析和蛋白分析，但是通常地，新鮮組織對(duì)于體外活性測(cè)定將是優(yōu)選的。
也可以應(yīng)用固定化的組織樣品。通過活體組織檢查獲得的組織常常被固定，通常是通過應(yīng)用例如，福爾馬林、甲醛或者戊二醛，或者通過酒精浸沒。通常將固定化的生物樣品脫水并在石蠟或者其它固相支持物中包埋，如本領(lǐng)域中所已知。參見參考文獻(xiàn)Plenat et al.，2001，Ann.Pathol.2129-47。未包埋的、固定化的組織，以及固定化并包埋的組織，都可以被用于本發(fā)明中。用于包埋固定化組織的固相支持物可以用有機(jī)溶劑除去，以便被保存的組織能夠隨后再水化。
在一些情形下，對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平的分析包括細(xì)胞或組織培養(yǎng)的步驟。培養(yǎng)方法在本領(lǐng)域是公知的。例如，可以用酶(如膠原酶和透明質(zhì)酸酶)將來自活組織檢查樣品的細(xì)胞離解，和/或使用物理破裂方法(例如，使其重復(fù)通過25號(hào)針(25-gauge needel))來解散細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)離心收集，在所需的緩沖液或者培養(yǎng)液中重懸浮，它們可以用于培養(yǎng)、即刻的分析或者進(jìn)一步的處理。
4.2.2基于蛋白的檢測(cè)
在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白本身來確定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平。最方便地，這是應(yīng)用免疫分析來進(jìn)行(例如但不限于，蛋白質(zhì)印跡(Western)分析、流式細(xì)胞分析、EIA、ELISA、RIA、競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析、雙抗體夾心分析、免疫化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫組織化學(xué)方法、凝聚分析和免疫沉淀)。
用于免疫分析用途的抗體可以很容易地得到。應(yīng)用常規(guī)的方法，可以制備得到特異于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的抗體(包括單克隆抗體和多克隆抗體、Fab和F(ab′)2片段、重組生產(chǎn)的等效物)。參見，例如，Harlow and Lane，supra；Kohlerand Milstein，1975，Nature 256495。
可以應(yīng)用純化的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或者其一部分(不論是從組織純化的還是重組表達(dá)的)，來產(chǎn)生抗體。選擇性地，可以應(yīng)用合成的肽或多肽序列來生產(chǎn)或者選擇感興趣的抗體。參見，Huse et al.，1989，Science 2461275-81；和Ward et al.，1989，Nature 341544-46。對(duì)于一些分析，可以優(yōu)選地應(yīng)用與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)的細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合的抗體，可以通過在抗體的生產(chǎn)或者選擇過程中應(yīng)用細(xì)胞外表位而獲得這種特異性。同樣地，可以選擇識(shí)別在多于一個(gè)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中發(fā)現(xiàn)的表位(例如，保守序列)的抗體，以便允許對(duì)多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同時(shí)進(jìn)行分析。表1提供了有所選擇的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和基因的DNA序列和蛋白質(zhì)序列的編號(hào)(accessionnumbers)，其可以被用于表達(dá)或者合成抗原。
葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體已在科學(xué)文獻(xiàn)中有所描述(參見，Bukhard et al.，2004，Oral Oncology，4028-35[抗-SGLT1]，Hasper et al.，1988，J.Biol.Chem.263398-403[描述了用對(duì)應(yīng)于GLUT1的C末端的13個(gè)氨基酸的肽培育出的兔抗血清]；Rogers er al.，2003，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab..282E733-738[描述了兔多克隆抗GLUT12抗體，R1396，其特異于人GLUT12獨(dú)特的16個(gè)C末端氨基酸]，并且可以從各種廣泛的商業(yè)渠道獲得[例如，ResearchDiagnostics Inc.，Alpha Diagnostics，Inc.，East Acres Biologicals，DAKO，Hamburg，Germany，Chemicon International，Inc.，Temecula，CA，(參見表2)。
表2示例性的可經(jīng)商業(yè)途徑得到的抗體的特征
存在著多種基于蛋白的方法可以用來檢測(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平。例如，來自樣品的的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以被純化(例如，通過色譜法或者電泳法)或者被富集(例如，通過細(xì)胞分級(jí)分離)，并通過Western分析被測(cè)定，或者可以應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析或者非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析(如ELISA或者其它的夾心分析)，其伴有或者不伴有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的純化或者富集。在下列文獻(xiàn)中提供了關(guān)于各種抗體分析方法的方法學(xué)和步驟的進(jìn)一步指導(dǎo)，例如，授予Greene的美國(guó)專利4,376,110；ANTIBODIESA LABORATORY MANUAL，COLD SPRING HARBORLABORATORY，CHAP.14(1988)中的“Immunometric Assays Using MonoclonalAntibodies”；Blackwell Scientific Publications于1986年出版的HANDBOOK OFEXPERIMENTAL IMMUNOLOGY(D.M.Weir，ed.)，第1卷第26章中，Bolton和Hunter所著的“Radioimmunoassay and Related Methods”；Blackwell ScientificPublications于1986年出版的HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY(D.M.Weir，ed.)，第1卷第27章中，Nakamura等人所著的“Enzyme ImmunoassaysHeterogeneous and Homogenous Systems”；和Coligan，supra。
例如，蛋白印跡(免疫印跡)分析可以被用來檢測(cè)并定量樣品中存在的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。蛋白印跡對(duì)于檢測(cè)同質(zhì)的組織樣品和體液樣品中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是有用的。蛋白印跡技術(shù)在本領(lǐng)域中被常規(guī)地用于確定樣品中的蛋白水平。參見，Sambrook，supra。通常地，應(yīng)用去污劑如Triton-100，將樣品均質(zhì)化并裂解細(xì)胞。然后，通過凝膠電泳分離物質(zhì)，轉(zhuǎn)移至合適的固相支持物(如硝酸纖維素膜、尼龍膜或者衍生的尼龍膜)上，并與特異地結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抗體溫育。這些抗體可以被直接標(biāo)記，或者可選擇地，可以應(yīng)用特異地結(jié)合于抗轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抗體的標(biāo)記抗體在隨后被檢測(cè)出來(例如，標(biāo)記的羊抗鼠抗體)。
在另一種方法中，應(yīng)用免疫組織學(xué)方法或者免疫細(xì)胞學(xué)方法，分析葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平。組織樣品制備方法在本領(lǐng)域中是已知的(參見，例如，Harlow，supra)，并且在實(shí)施例中有所描述。典型地，從活組織檢查得到的組織被固定化，在石蠟或者其它固相支持物中包埋，或者不包埋而將其放置在固相支持物上。也可以應(yīng)用冷凍切片。參見Plenat et al.，2001，Ann.Pathol.21(1)29-47。在免疫染色之前、其間或者之后，可以對(duì)組織切片進(jìn)行進(jìn)一步處理；例如，表位修復(fù)方法，例如可以在檸檬酸鹽緩沖液中加熱組織樣品。參見，例如，Leong et al.，1996，Appl.Immunohistochem.4201。在可任選的封閉步驟之后，在合適的條件下，將組織切片暴露于一抗(如上面描述的那些抗體，優(yōu)選地是那些與細(xì)胞外表位結(jié)合的抗體)，持續(xù)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以便一抗和組織樣品中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合?？梢酝ㄟ^常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法來確定用于獲得這樣結(jié)果的合適條件?？贵w和樣品結(jié)合的程度可以被直接或者間接地分析。例如，在一種實(shí)施方案中，一抗或者二抗被熒光標(biāo)記，應(yīng)用免疫熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)合情況。
在另一種方法中，讓抗葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抗體直接與細(xì)胞(例如，表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的細(xì)胞)結(jié)合，并直接(例如，應(yīng)用熒光標(biāo)簽或者酶標(biāo)記的一抗)或間接(例如，應(yīng)用標(biāo)記的二抗)測(cè)定抗體。這種結(jié)合分析的例子是流式細(xì)胞分析如熒光活化細(xì)胞分析(參見，例如，Salih et al.，2000，J.Immunology 1652903-10)。在FASC分析之前，可以先使腫瘤組織樣品解離開。具體地，將腫瘤切除并在緩沖液中切碎。通過加入酶(例如膠原酶和透明質(zhì)酸酶)來分離細(xì)胞，獲得腫瘤細(xì)胞懸液。然后，在清洗緩沖液中清洗細(xì)胞，并使之通過25號(hào)針數(shù)次。離心之后，將細(xì)胞重懸于緩沖溶液中。在一種實(shí)施方案中，流式細(xì)胞分析結(jié)果被顯示為，細(xì)胞數(shù)目對(duì)染色強(qiáng)度(例如，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白數(shù)目)，以及相對(duì)于調(diào)查人群中的分布情況的樣品中分布情況。
可以應(yīng)用與分析方法相適應(yīng)的任何合適方法，對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量。例如，對(duì)于蛋白質(zhì)印跡分析，可以掃描條帶的密度并加以定量。對(duì)于腫瘤活組織檢查的免疫組織化學(xué)分析，可以根據(jù)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白染色的強(qiáng)度，對(duì)活組織檢查切片進(jìn)行評(píng)分，例如，0分是指無染色，1分是指輕度染色，2分是指中度染色，3分是指重度染色。在一些實(shí)施方案中，區(qū)分膜染色和細(xì)胞質(zhì)染色是可能的。在那些實(shí)施方案中，可以對(duì)膜染色進(jìn)行評(píng)分。對(duì)于定量的方法，也參見，例如，Raleigh et al.，2001，″Semiquantitative immunohistochemical analysis forhypoxia in human tumors″Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.，2001 Feb 1，49(2)569-74和Hatanaka et al.，2001，″Quantitative immunohistochemical evaluation of HER2/neuexpression with HercepTestTMin breast carcinoma by image analysis″Pathol.Int.5133-6。
如上面所討論，在一些實(shí)施方案中，也測(cè)定參照蛋白的水平，參照蛋白對(duì)于癌癥狀態(tài)來說是相對(duì)不變的。合適的參照蛋白包括肌動(dòng)蛋白、微管蛋白和甘油醛-3-磷酸脫氫酶。應(yīng)用參照蛋白時(shí)，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平可以相對(duì)于參照蛋白被“標(biāo)準(zhǔn)化”，這是通過用葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白除以參照蛋白實(shí)現(xiàn)的。如本文所描述，將得到的比值與預(yù)先確定的比值相比較。
4.2.3基于RNA的檢測(cè)
在另一種實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平是通過測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA水平而被測(cè)定的。對(duì)樣品中一種或者多種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白信使RNA水平的分析包括Northern分析，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)包括定量PCR，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、RNase保護(hù)分析、原位雜交、基因表達(dá)系列分析(SAGE)、差異顯示(DD)分析、RNA隨機(jī)引物(RAP)-PCR、差異表達(dá)序列的限制性內(nèi)切酶分析(READS)、擴(kuò)增限制性片段長(zhǎng)度多肽性(AFLP)、總基因表達(dá)分析(TOGA)、內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)模板引物(CTs)在定量多重RT-PCR方法中的應(yīng)用[StaRT-(PCR)]、高密度cDNA濾膜雜交(HDFCA)分析、抑制性扣除雜交(SSH)、差異篩選(DS)、高密度cDNA陣列或寡核苷酸陣列。對(duì)于綜述，參見Ahmed，2002，″Moleculartechniques for studying gene expression in carcinogenesis″J.Environ.Sci.Health PartC Environ.Carcinog.Ecotoxicol.Rev.2077-116。也參見Lipshutz et al.Nat.Genet.1999，2120-4；美國(guó)專利5,445,934；5,578,832；5,556,752和5,510,270；Schena et al.，1995，Science 270467-70(高密度cDNA陣列)；Lynn et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.802656；Zinn et al.，1983，Cell 34865；和Sambrook and Ausubel，supra(核糖核酸酶保護(hù)分析)。
用于從組織中分離RNA的方法是已知的(參見，例如，Ausubel，supra；Rapley et al.，″RNA Isolation and Characterization Protocols″1998.Humana Press，Inc.Totowa，New Jersey；Farrell et al.，″RNA Methodologies″1993.Academic Press，Inc.San Diego，California)。也可以從固定化的和/或石蠟包埋的組織切片中分離出用于擴(kuò)增的RNA。參見Stanta et al.，″RNA Extracted from Paraffin-Embedded HumanTissues is Amenable to Analysis by PCR Amplification″Bio Techniques 11(3)304-308.1991；Finke et al.，″An Improved Strategy and a Useful Housekeeping Gene for RNAAnalysis from Formalin-Fixed，Paraffin-Embedded Tissues by PCR″Bio Techniques 14(3)448-453.1993；De Andres et al.，″Improved Method for mRNA Extraction fromParaffin-Embedded Tissues.BioTechniques 18(1)42-43.1995″；Rupp et al.，″Purification and Analysis of RNA from Paraffin-Embedded Tissues″.BioTechniques6(1)56-60.1988；Sorg et al.，″Detection of Borna Disease Virus RNA inFormalin-Fixed，Paraffin-embedded Brain Tissues by Nested PCR″.Journal of ClinicalMicrobiology 33(4)821-823.1995；Werner et al.，″Effect of formalin tissue fixationand processing on immunohistochemisty″American Journal of Surgical Pathology 24(7)1016-1019.2000。也參見美國(guó)專利6,602,670和在其說明書和“references cited”中引用的出版物。
出于說明的目的，在一種實(shí)施方案中，應(yīng)用定量PCR，測(cè)定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平。定量PCR是指能夠定量cDNA的方法，cDNA是來自源于組織樣品的細(xì)胞中的mRNA的反轉(zhuǎn)錄?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中的已知方法，對(duì)源于組織樣品的細(xì)胞中的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，這包括例如，Sambrook，supra和Ausubel，supra中的方法。定量PCR可以這樣來進(jìn)行，例如根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的PCR方法來擴(kuò)增RNA，其中所應(yīng)用的引物被修飾以便能夠在固體表面上捕獲得到的產(chǎn)物。例如，可以分別將5’引物或者3’引物在5’末端或者3’末端生物素化，以便能夠在抗生物素蛋白包被的微量反應(yīng)板上捕獲得到的產(chǎn)物。然后，對(duì)附著在固體表面上的產(chǎn)物進(jìn)行定量，例如，通過與附著有可定量的標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交來實(shí)施。“可定量的標(biāo)記”可以是，例如，放射性原子或者放射性基團(tuán)。然后，通過測(cè)定樣品中的放射活性的水平，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA表達(dá)的水平。選擇性地，“可定量標(biāo)記”是基團(tuán)或者部分(moiety)例如地高辛。在該實(shí)施方案中，通過加入1)與堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗地高辛抗體和2)堿性磷酸酶的生色底物，之后進(jìn)行吸光度分析，來定量PCR產(chǎn)物?？扇芜x地，可以根據(jù)cDNA標(biāo)準(zhǔn)曲線將結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。
也可以應(yīng)用被稱為“實(shí)時(shí)擴(kuò)增”方法或者“實(shí)時(shí)定量PCR”的各種方法，來確定樣品中存在的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA的量。這樣的方法涉及，在擴(kuò)增過程的期間測(cè)定形成的擴(kuò)增產(chǎn)物的量。產(chǎn)熒光核酸酶分析是可以被用來檢測(cè)和定量葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)錄子的實(shí)時(shí)定量方法學(xué)的一個(gè)具體例子?？傊?，此類分析方法應(yīng)用雙重標(biāo)記的產(chǎn)熒光寡核苷酸探針，持續(xù)測(cè)定PCR產(chǎn)物累積量，這樣的方法在文獻(xiàn)中通常被簡(jiǎn)單地稱為“TaqMan”方法。用于這樣的分析的探針典型地是短的(大約20-25個(gè)堿基)多核苷酸，用兩種不同的熒光染料標(biāo)記。盡管染料也可以附著在探針上的其它位置，但探針的5’末端典型地被附著報(bào)告染料(reporter dye)，3’末端附著淬滅染料(quenching dye)。為了測(cè)定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)錄子，將探針設(shè)計(jì)為，具有與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)錄子上的探針結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)的至少大部分序列。與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼序列兩側(cè)的區(qū)域結(jié)合的PCR上游引物和下游引物也被加入反應(yīng)混合物，以用于擴(kuò)增葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多核苷酸。當(dāng)探針完整無損時(shí)，在兩種熒光團(tuán)之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，淬滅染料使來自報(bào)告染料的發(fā)射淬滅。在PCR的引物延伸期間，探針被核酸聚合酶例如Taq聚合酶的5’核酸酶活性切割，從而從多核苷酸-淬滅染料復(fù)合物中釋放出報(bào)告染料，這導(dǎo)致報(bào)告染料的發(fā)射強(qiáng)度增加，報(bào)告染料的發(fā)射強(qiáng)度可以由合適的檢測(cè)系統(tǒng)來測(cè)定。
在一種實(shí)施方案中，應(yīng)用原位雜交來檢測(cè)樣品中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列。原位雜交分析方法是已知的，在Angerer et al.，METHODS ENZYMOL.152649-660(1987)中被一般性地描述。例如，可以按Ruglowski et al.，2003，Am.J.Clin.Pathol.120691-698中的描述進(jìn)行原位雜交。可以應(yīng)用石蠟包埋的組織樣品。簡(jiǎn)言之，將載片用蛋白酶K和乙?；噭╊A(yù)處理，并與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)NA的33P-標(biāo)記的正義和反義cRNA核糖探針溫育。溫育之后，將載片在洗滌液中清洗，用RNase A消化，再次清洗，并進(jìn)行脫水。脫水后，用銀乳劑包被載片并暴露一定時(shí)間(例如，8-10天)。可以用本領(lǐng)域中已知的方法，例如，應(yīng)用暗視場(chǎng)顯微鏡，來測(cè)定銀染料的強(qiáng)度。也可以檢查數(shù)字化的圖像。原位雜交方法也在Harris，1996，Anal.Biochem.243249-256；Singer et al.，1986，Biotechniques 4230-250；Haase etal.，1984，METHODS IN VIROLOGY，vol.VII，pp.189-226；和NUCLEIC ACIDHYBRIDIZATIONA PRACTICAL APPROACH(Hames et al.，eds.，1987)中被描述。
可以應(yīng)用與分析的方法相容的任何方法，對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量。
基于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核苷酸序列，應(yīng)用常規(guī)的方法，可以容易地獲得或制備出對(duì)于檢測(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)NA有用的探針和引物。根據(jù)對(duì)靶序列(欲被檢測(cè)的序列)的了解，可以容易地設(shè)計(jì)出對(duì)基于擴(kuò)增的檢測(cè)有用的引物。對(duì)于一些分析來說，特別合適的引物具有接近60℃的TM，長(zhǎng)度在100bp至600bp之間[這似乎更像是探針長(zhǎng)度，而不是引物長(zhǎng)度]，并且它對(duì)于欲擴(kuò)增的區(qū)域是特異的(這可以通過GenBank的BLAST分析和預(yù)期的引物來確定，例如應(yīng)用軟件如Oligo 6.0(Molecular Biology Insights，Inc.；http//www.oligo.net)。優(yōu)選的引物跨越外顯子/內(nèi)含子剪接接頭處，這樣，可以容易地將所需RNA/cDNA的擴(kuò)增與污染的基因組DNA的擴(kuò)增分離開來。已知的是，選擇的引物應(yīng)滿足，引物自身不形成二聚體，也不與用于擴(kuò)增的引物對(duì)中的其它引物(如果存在的話)形成二聚體。探針和引物在文獻(xiàn)中有所描述，參見，例如，Helmke et al.，2004，Oral Oncology，4028-35(SGLT1、SGLT2)；美國(guó)專利申請(qǐng)20030228592(GLUT8)；Rogers，2003，CancerLetters 193225-33(GLUT12、GLUT4)；Brukhard et al.，2004，Oral Oncology 4028-35(SGLT1和SGLT2)和Auguatin et al.，Jan 22，2004，J Biol.C′hem.(GLUT9)。在科學(xué)文獻(xiàn)中描述了許多其它的引物和探針。其它的引物和探針顯示在表3中，這是為了說明而非限制的目的?？梢杂贸Ｒ?guī)方法制備其它的探針，例如，可以用表3中列舉的引物擴(kuò)增出它們。
表3






4.2.4.功能分析
在一種實(shí)施方案中，通過測(cè)定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，例如，在體外或者體內(nèi)對(duì)葡萄糖或者葡萄糖類似物的攝取，確定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平。例如，可以用葡萄糖攝取分析在體外測(cè)定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。葡萄糖攝取分析在本領(lǐng)域是已知的(參見，例如，Gnudi et al.，1997，Mol.Endocrinol.1167-76；也參見PCT出版物WO03/082301)。在一種情形中——為了說明而不是限制——葡萄糖攝取分析是測(cè)定標(biāo)記的已糖的攝取。如上所述，細(xì)胞是通過使腫瘤組織樣品解離而獲得的。可任選地，細(xì)胞被培養(yǎng)，并且可任選地，細(xì)胞被傳代培養(yǎng)至匯合，隨后被分離并重懸浮。然后，在細(xì)胞松弛素B(用于GLUTs)或者根皮甙(phlorizin)(用于SGLTs)存在或者不存在的條件下，放射標(biāo)記(例如，14C-標(biāo)記或者3H-標(biāo)記)的葡萄糖或者葡萄糖類似物(如2-脫氧葡萄糖)與細(xì)胞溫育。溫育后，洗滌細(xì)胞并分析其放射性。細(xì)胞松弛素B抑制I類和III類葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因此，評(píng)價(jià)此類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性是有用的。根皮甙抑制SGLTs，因此，對(duì)評(píng)價(jià)此類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性是有用的。
在一些實(shí)施方案中，測(cè)定SGLTs的水平，葡萄糖類似物a-甲基-D-葡萄糖苷(a-MDG)被使用。a-MDG可以以鈉依賴的方式被運(yùn)輸，表觀親和力(K0.5)是0.4(SGLT1)和2mM(SGLT2和SGLT3)。在一些實(shí)施方案中，葡萄糖類似物僅由一種或者少數(shù)的特異葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸，因此，葡萄糖示蹤劑的攝取與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平直接相關(guān)。例如，已報(bào)道，宮頸癌細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取的增加與GLUT1的獨(dú)有的跨膜過量表達(dá)相關(guān)。因此，在葡萄糖攝取分析中，增加的葡萄糖攝取提示，GLUT1的表達(dá)增加。
在一些實(shí)施方案中，葡萄糖類似物是由多于一種的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸?shù)?。因此，總葡萄糖攝取量將和該細(xì)胞表達(dá)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的總體水平相關(guān)。
用于評(píng)價(jià)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平的另一種分析是，細(xì)胞松弛素B結(jié)合分析(參見，Ogura et al.，1999，J.Endocrinology，160443-452；Ozaki et al.，1996，Mech Ageing Dev.88149-158；and Gorga & Lienhard，1981，Biochem.205108-13)。簡(jiǎn)言之，從組織樣品或者細(xì)胞樣品制備膜提取物，并和放射標(biāo)記(如，3H-標(biāo)記)的細(xì)胞松弛素B混合。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，將膜結(jié)合的細(xì)胞松弛素B和游離的細(xì)胞松弛素B分離(例如，通過過濾或者離心)。計(jì)算膜部分的放射性。細(xì)胞松弛素B結(jié)合的水平和GLUTs的水平相關(guān)。
在另一種實(shí)施方案中，通過在體內(nèi)測(cè)定葡萄糖攝取，確定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平。在此方法中，在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)和葡萄糖攝取之間形成關(guān)聯(lián)。例如，Kato et al.，2003，Anti-Cancer Res.233263-72，報(bào)道了在食道鱗狀細(xì)胞癌中，18-F-氟脫氧葡萄糖累積和GLUT1表達(dá)的關(guān)聯(lián)。葡萄糖攝取分析在本領(lǐng)域中是已知的。參見，例如，Reske et al.，1997，J.Nucl.Med.，381344-48。通常地，用不可代謝的葡萄糖類似物，如2-氟脫氧葡萄糖(2-FDG)、2-脫氧葡萄糖(2-DG)和3-O-甲基葡萄糖，評(píng)價(jià)葡萄糖攝取。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性可以被測(cè)定，例如，應(yīng)用熒光標(biāo)記的葡萄糖類似物，通過正電子放射X線體層攝影術(shù)來實(shí)施。
5.抗腫瘤藥劑的選擇
某些抗腫瘤藥劑是由某些葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白優(yōu)選地運(yùn)輸?shù)?。例如，藥物鏈脲菌素通過GLUT2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被運(yùn)輸進(jìn)入胰腺癌細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的方法，癌組織中高水平GLUT2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的檢測(cè)，為預(yù)測(cè)該腫瘤對(duì)鏈脲菌素治療敏感提供了基礎(chǔ)。通常地，特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平越高，該腫瘤對(duì)由該特定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸?shù)目鼓[瘤藥劑的治療越敏感。
因此，在一些實(shí)施方案中，在選擇抗腫瘤藥劑進(jìn)行治療之前，確定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的量。一旦發(fā)現(xiàn)，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平大于預(yù)先確定的量，則確定，該癌癥對(duì)特定抗腫瘤藥劑的治療是敏感的。抗腫瘤藥劑的選擇可以基于許多因素，包括但不限于，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析或者葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物特異性。
在一些實(shí)施方案中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已經(jīng)被知道是特異性地運(yùn)輸某抗腫瘤藥劑。則葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的更大的量和對(duì)該抗腫瘤藥劑的敏感性之間的關(guān)聯(lián)立即形成。例如，已經(jīng)報(bào)道，glucofosfamide，也被稱為glufosfamide，是由SGLT1運(yùn)輸?shù)?。那么，根?jù)本發(fā)明的方法，SGLT1的量比預(yù)先確定的量多，則提示，該癌癥對(duì)glucofosfamide的治療是敏感的。在另一種實(shí)施方案中，已知葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸某一類型的抗腫瘤藥劑。例如，已知GLUT2運(yùn)輸2位不被修飾的葡萄糖類似物。
在一些實(shí)施方案中，抗腫瘤藥劑被預(yù)先選出，并確定該藥劑是其底物的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平，從而觀察患者患有的癌癥是否是對(duì)此治療敏感的類型。如果來自患者的癌癥樣品中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平高于參照值，則用該抗腫瘤藥劑治療患者。
應(yīng)用本領(lǐng)域已知的方法(如下面所描述)，可以將一種藥劑鑒定為一種具體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物。選擇性地，可以通過鑒定一群患者，已證明藥劑對(duì)該群體是有效的，并確定什么樣的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被表達(dá)，從而建立轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平和對(duì)該藥劑的敏感性之間的關(guān)聯(lián)。然后，將具體患者的水平或表達(dá)情況與已證明該治療對(duì)其有效的群體的參照情況相比較。
可以應(yīng)用各種底物分析。例如，利用原代細(xì)胞培養(yǎng)物或者爪蟾卵母細(xì)胞進(jìn)行的已糖攝取和競(jìng)爭(zhēng)性分析，已經(jīng)被習(xí)慣地用于確定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是否運(yùn)輸特定的底物。參見，例如，Garcia et al.，2003，J Neurochemistry，86709；Burant et al.，J.Biol.Chem.，1992，26714523-6；和Veyhl et al.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA952914-29?？梢灾苽鋪碜云咸烟寝D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的正義cRNA，如Veyhl等人所描述，并注射入去卵泡爪蟾卵母細(xì)胞。在細(xì)胞松弛素B(用于GLUTs)或者根皮甙(用于SGLTs)存在或者不存在的條件下，溫育卵細(xì)胞，其中含有欲檢測(cè)的各種放射標(biāo)記的(14C、3H等)葡萄糖或者葡萄糖類似物。溫育之后，分析卵細(xì)胞中的放射活性。對(duì)于SGLTs，可以通過應(yīng)用雙微電極電壓鉗技術(shù)，來分析葡萄糖或者葡萄糖類似物的攝取。
其它的分析利用原代細(xì)胞例如人癌細(xì)胞進(jìn)行，已知其表達(dá)特定的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。讓細(xì)胞生長(zhǎng)并傳代培養(yǎng)至匯合，然后分離和重懸浮。然后，在細(xì)胞松弛素B(用于GLUTs)或者根皮甙(用于SGLTs)存在或者不存在的條件下，將細(xì)胞與各種欲檢測(cè)的放射標(biāo)記的(例如，14C-或者3H-標(biāo)記)葡萄糖或者葡萄糖類似物溫育。溫育之后，洗滌細(xì)胞并分析其放射活性。
在本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)方面，應(yīng)用體外活性分析，來確定具體腫瘤(或者腫瘤類型)對(duì)具體抗腫瘤藥劑的敏感性。根據(jù)該方法，將來自所述腫瘤的細(xì)胞和多種濃度的所述抗腫瘤藥劑溫育，所述抗腫瘤藥劑的濃度包括了當(dāng)該藥劑被給予人類患者時(shí)估計(jì)的體內(nèi)濃度。在一個(gè)或多個(gè)時(shí)間間隔(例如，10分鐘、30分鐘、1小時(shí)和3小時(shí))之后，測(cè)定藥劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和存活能力的影響，并將該影響與不加入藥劑的對(duì)照和/或加入了不同的抗腫瘤藥劑或者不同的抗癌藥劑的對(duì)照比較。相對(duì)于對(duì)照的細(xì)胞生長(zhǎng)減少(例如，通過測(cè)定細(xì)胞數(shù)目或者替代指標(biāo)如DNA含量而得以評(píng)價(jià))或者存活能力降低(例如，通過監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物中的凋亡而得以評(píng)價(jià))提示，該腫瘤對(duì)該藥劑敏感。在一種實(shí)施方案中，根據(jù)該方法，篩選一系列的幾種(例如，至少2、至少3、至少4、至少5或者至少10)不同藥劑，以鑒定可用于給予患者的最有希望的候選藥劑。
6.用于測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白——包括多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白——的水平的設(shè)備和方法
本文描述了許多用于確定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平的方法，并且，在考慮了本公開內(nèi)容之后，對(duì)于相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，其它的方法將是顯而易見的。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，僅僅采用分析方法中的一種，來確定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平。在其它的實(shí)施方案中，聯(lián)合采用兩種或者更多種方法，來確定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平。例如，可以將在免疫組織化學(xué)分析中顯示為高的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平的樣品作進(jìn)一步的處理，以便通過蛋白質(zhì)印跡(Western blot)分析對(duì)蛋白水平進(jìn)行定量，如果該信息對(duì)于實(shí)施者來說是有用的話。類似地，可以對(duì)顯示出高的葡萄糖攝取的樣品作進(jìn)一步的檢測(cè)，測(cè)定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白水平或者mRNA水平。
在一些實(shí)施方案中，僅測(cè)定一種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平。在其它的實(shí)施方案中，測(cè)定兩種或者更多種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平。對(duì)兩種或者更多種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的測(cè)定，可以相繼進(jìn)行或者同時(shí)進(jìn)行。
在一些實(shí)施方案中，測(cè)定多于一種的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。這在多種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被表達(dá)于同一樣品時(shí)，是特別有意義的。實(shí)施者可以(1)通過分析數(shù)種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，確定該組織中哪些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平高于參照值；(2)基于哪些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)送哪些藥物的知識(shí)，選擇抗腫瘤藥劑。
例如，已經(jīng)顯示，多種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，包括GLUT1、GLUT4、GLUT5、GLUT8、GLUT12和HMIT均在脂肪細(xì)胞中表達(dá)?？梢越柚谠试S檢測(cè)或者測(cè)量多種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的方法，不論是相繼的或者是同時(shí)的，對(duì)多種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
同時(shí)測(cè)定多于一種的蛋白的表達(dá)水平的方法，在本領(lǐng)域中是已知的，此處提供的進(jìn)一步描述僅僅是為了說明目的。例如，微陣列分析既可以被用在測(cè)定蛋白水平中，又可以被用在測(cè)定RNA水平中，包括用于測(cè)定多于一種的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或者RNA的水平。
用于測(cè)定細(xì)胞或者組織中表達(dá)的多種RNA的水平的方法，是本領(lǐng)域中已知的，包括高密度多核苷酸陣列或者寡核苷酸陣列(Lipshutz et al.，Nat.Genet.，1999，2120-4；美國(guó)專利5,445,934；5,578,832；5,556,752；和5,510,270)、高密度cDNA陣列(參見，例如，Schena et al.，1995，Science 270467-7)、斑點(diǎn)印跡和狹線印跡(dot and slot blots)、蘸棒(dip sticks)、針(pins)、芯片或者珠子(beads)。所有這些技術(shù)和設(shè)備在本領(lǐng)域中是已知的，并且是許多可經(jīng)商業(yè)渠道得到的診斷試劑盒的基礎(chǔ)。通過本公開內(nèi)容的指導(dǎo)，這些技術(shù)可以容易地被采用，以測(cè)定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平。
在一些實(shí)施方案中，應(yīng)用蛋白質(zhì)陣列確定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)的表達(dá)。“蛋白質(zhì)陣列”含有不同的捕獲試劑，捕獲試劑被固定在固相支持物的不同位置上，允許每一捕獲試劑與其分別的靶蛋白之間獨(dú)立地相互作用。捕獲試劑可以是選擇性地結(jié)合于靶蛋白的任意分子，如抗體、重組蛋白和小的化學(xué)物質(zhì)。蛋白質(zhì)陣列可以用于確定樣品中特定蛋白的量。參見，Von Eggeling et al.，2000，BioTechniques 291066-70；Haab，Proteomics，32116-22；Wiesner，2003，J.Lab.Medicine 2785-91；Kodadek，2002，Trends Biochem.Sci.27295-300。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，測(cè)定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的僅一種或者少量幾種的水平。在一些情形下，例如，已知患者的癌癥和特定的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過量表達(dá)在一定的頻率上相關(guān)聯(lián)。例如，已經(jīng)報(bào)道，GLUT1過量表達(dá)與膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、直腸癌、食道癌、胃癌、頭部和頸部癌癥、平滑肌肉瘤、卵巢癌和甲狀腺癌相關(guān)。因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，測(cè)定來自對(duì)象的癌癥樣品中的GLUT1水平，所述對(duì)象患有膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、直腸癌、食道癌、胃癌、頭部和頸部癌癥、平滑肌肉瘤、卵巢癌或者甲狀腺癌。
已經(jīng)報(bào)道，GLUT2過量表達(dá)與胰腺癌或者胃癌相關(guān)聯(lián)。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，測(cè)定來自對(duì)象的癌癥樣品中的GLUT2水平，所述對(duì)象患有胰腺癌或者胃癌。在一種實(shí)施方案中，癌癥是胰腺癌，癌癥樣品中的GLUT2的水平被測(cè)定，抗癌藥劑選自鏈脲菌素、glucofosfamide和gluSNAP化合物。
已經(jīng)報(bào)道，GLUT3過量表達(dá)與腦癌或者肺癌相關(guān)聯(lián)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，來自患有腦癌或者肺癌的對(duì)象的癌癥樣品中的GLUT3的水平被測(cè)定。
在一些實(shí)施方案中，癌癥和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過量表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)是未知的。在這些實(shí)施方案中，在確定患者中所選擇的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平之前，首先通過例如作表達(dá)圖譜的方法，建立葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和不同類型的癌癥之間的關(guān)聯(lián)?；蛘?，可以簡(jiǎn)單地測(cè)定癌癥樣品中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的總水平，如果該總水平超過參照值，則以施用該藥物時(shí)所選擇的所需劑量，施用該藥物。
7.試劑盒和設(shè)備
在一方面，本發(fā)明提供了用于篩選患者腫瘤的試劑盒和設(shè)備，以確定對(duì)具體抗腫瘤藥劑的敏感性。
本發(fā)明的試劑盒包括用于評(píng)價(jià)一種或者多種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)的試劑，如用于檢測(cè)或者擴(kuò)增葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因產(chǎn)物的探針和/或引物。在一種實(shí)施方案中，探針是核酸探針或引物，其特異性地結(jié)合于由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因轉(zhuǎn)錄的一個(gè)或者多個(gè)多核苷酸。在一種實(shí)施方案中，試劑盒含有特異于不同的人葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的一種或者多種(至少2種，優(yōu)選地為3種，常常是4種，有時(shí)是5種或者更多種)的抗體。本發(fā)明的試劑盒可以任選地包括對(duì)實(shí)施本發(fā)明的方法有用的其它成分，如用于分離細(xì)胞或者從細(xì)胞中分離蛋白或者核酸的設(shè)備。此外，試劑盒可以含有校準(zhǔn)曲線、用于與預(yù)先確定的值進(jìn)行比較的參照樣品(或是蛋白或者是核酸)，和/或如本文描述的參照值(例如，以表格的格式)。
本發(fā)明也提供了用于確定人類組織或者體液樣品中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平或者量的試劑盒。在一種實(shí)施方案中，試劑盒包括診斷篩選試劑及其在本發(fā)明的方法中的使用說明書。
本發(fā)明也提供了對(duì)本發(fā)明的篩選方法有用的設(shè)備。在一方面，提供了包括固定化的探針(多種探針)的設(shè)備，所述探針特異于一種或者多種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因產(chǎn)物(多核苷酸或者蛋白)。探針可以結(jié)合多核苷酸(例如，基于雜交)、多肽或者表達(dá)多肽的細(xì)胞。
在一些實(shí)施方案中，將包括單一的固定化探針的設(shè)備用于篩選。在一種實(shí)施方案中，應(yīng)用陣列格式，其中多種(至少2種，通常至少4種或者更多)不同的探針被固定化。術(shù)語“陣列”以其通常的含義被應(yīng)用，并且意味著，被固定在基質(zhì)上的多種探針中的每一個(gè)，在底物上都具有明確的定位(地址)。根據(jù)設(shè)備的性質(zhì)和用途，陣列上探針的數(shù)目可以不同。例如，盡管通常存在至少2種或者多于2種不同的探針，但用于檢測(cè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蘸棒式陣列(dipstick formatarray)可以具有少至1種的探針。
各種結(jié)合和雜交形式是已知的，包括核苷酸陣列、cDNA陣列、蘸棒(dipsticks)、針式(pins)、芯片(chips)或者珠子(beads)、Southern印跡、Northern印跡、斑點(diǎn)印跡和狹線印跡。因此，本發(fā)明提供了包括固定于固體基質(zhì)上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因產(chǎn)物探針的設(shè)備。可以應(yīng)用各種固相支持物，其可以由玻璃(例如，玻璃載片)、塑料(例如，聚丙烯、尼龍)、聚丙烯酰胺、硝酸纖維素或者其它材料制成。將核酸附著在表面上的一種方法是，通過在玻璃板上進(jìn)行印刷，如在Schena et al.，1995，Science 270467-470；Shalon et al.，1996，Genome Res.6639-645中所一般性地描述的。用于制作微陣列的另一種方法是通過制作高密度寡核苷酸陣列。參見，F(xiàn)odor et al.，1991，Science 251767-73；Lockhart et al.，1996，Nature Biotech 141675；和美國(guó)專利號(hào)5,578,832；5,556,752和5,510,270。
盡管含有用于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的探針的陣列(例如，包含針對(duì)基因組的實(shí)質(zhì)片段的探針的陣列)是已知的，本發(fā)明的設(shè)備著重于測(cè)定葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。因此，在實(shí)施方案中，在設(shè)備或者陣列上的固定化探針的至少大約10％，有時(shí)至少大約25％，至少大約50％或者至少大約75％，特異性地結(jié)合(例如，雜交到)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因產(chǎn)物。在一種實(shí)施方案中，基質(zhì)包括少于大約100種不同的探針，少于大約50種不同的探針，少于大約10種不同的探針，少于大約5種不同的探針或者少于大約3種不同的探針。如本文中所應(yīng)用，如果兩種探針不是特異地結(jié)合于相同的多肽或者多核苷酸(即，例如針對(duì)不同基因的cDNA探針)，則一種探針“不同于”另一種探針。
在一種實(shí)施方案中，探針選自單克隆抗體或者其它特異的結(jié)合蛋白(例如，抗體衍生物或者片段)，其特異地和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或者表達(dá)這種蛋白的細(xì)胞結(jié)合。用于多肽的探針也可以以陣列方式被固定，例如，采用多孔板的ELISA形式。
8.實(shí)施例
前面的章節(jié)已經(jīng)詳細(xì)地描述了本發(fā)明。下面的實(shí)施例闡述了本發(fā)明的各方面。在每一情形下，將在癌癥樣品中確定的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平與參照值相比較，以確定腫瘤對(duì)含有葡萄糖部分的抗腫瘤藥劑的治療是否敏感。
實(shí)施例1
對(duì)胰腺腫瘤中GLUT2水平的Western分析
本實(shí)施例描述了基于抗體的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分析，其用于確定來自胰腺癌患者的樣品中的GLUT2水平。
人胰島細(xì)胞癌或者類癌瘤癌組織是從經(jīng)歷了用于治療胰腺癌的手術(shù)的患者獲得的。在手術(shù)室中，將切取的組織放置在容器中，清楚地標(biāo)記并送至病理部門。在進(jìn)行病理評(píng)定以評(píng)價(jià)腫瘤的病理學(xué)特征并且確保該樣品含有腫瘤細(xì)胞之后，將腫瘤的一部分放置在作好標(biāo)記的容器中，并且于干冰上送至實(shí)驗(yàn)室，在實(shí)驗(yàn)室將其保存在-70℃直至應(yīng)用。在一些情況下，應(yīng)用針抽吸活組織檢查來評(píng)價(jià)腫瘤存在和特征。下面的所有步驟適用于樣品的任何類型。
將冰凍樣品稱重，并于干冰上在thermovac組織粉碎機(jī)中粉碎，將組織粉末放置在清潔的管中。使組織粉末在緩沖液中(50mM Tris-HCl-乙二胺四乙酸(EDTA)鈉、1％Triton X-100、10％甘油、10mM鉬酸鈉、10mM硫代甘油、10ug/ml抑肽酶、10ug/ml亮抑蛋白酶肽、0.5mM苯甲基磺酰氟和10ug/ml胃酶抑素)成為勻漿，其中根據(jù)組織樣品的尺寸使用帶有適當(dāng)?shù)奶筋^的polytrone。勻漿化是在0-4℃進(jìn)行的，脈沖時(shí)間為30秒，各次脈沖勻漿之間有1分鐘的冷卻時(shí)間。在10,000g將組織勻漿物離心10分鐘，以將胞漿/膜可溶組分與細(xì)胞核組分和細(xì)胞碎片分離開。丟棄得到的沉淀，移取上清并冷凍保存直至檢測(cè)，上清主要含有胞漿蛋白和膜結(jié)合蛋白，包括GLUT2。
通過混合20ml丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺(30％-0.8％wt/vol)、7.5mlpH8.8的3M Tris-HCl、31.56ml ddH2O和0.6ml 10％SDS，制成分離膠(10％)；將得到的混合物除氣30分鐘。加入TEMED(35μl)，將混合物再次除氣30分鐘。加入過硫酸胺(APS)(10％，0.33ml)，用60cc的注射器將混合物立即灌入凝膠裝置。在分離膠的頂部覆蓋上1-丁醇(1ml)以防止干燥，并使凝膠聚合1小時(shí)。在灌注濃縮膠(參見下面)的即刻前，通過用水清洗，除去丁醇層。
濃縮膠由3.75ml丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺(30％-8％wt/vol)、1.875mlpH6.8的2M Tris-HCl、24ml ddH2O和0.3ml 10％SDS組成；制備此凝膠混合物并除氣30分鐘。向混合物加入TEMED(25∶1)，并將混合物再次除氣30分鐘。加入過硫酸胺(APS)(10％，0.3ml)，將濃縮膠灌入凝膠裝置并正確放入梳子。使?jié)饪s膠聚合1小時(shí)。移走梳子，向凝膠架中加入電極緩沖液(25mM Tris、192mM甘氨酸、4mM十二烷基硫酸鈉，pH8.3)。用5×樣品緩沖液(2g SDS、1.0mlTritonX100、3.126ml 2M Tris-HCl、10.8ml ddH2O；將終體積調(diào)至20ml和pH調(diào)至6.8，100mg溴酚蘭、1.0ml巰基乙醇和4ml甘油)混合欲分離的蛋白樣品，得到1×的終濃度并鋪放到凝膠孔中。分子量(MW)標(biāo)記(BioRad)可以被包含到凝膠中(10μl的MW標(biāo)記物加入到0.150ml的1×樣品緩沖液)。將樣品鋪放到凝膠上，在17mA和500V條件下，室溫電泳12-17小時(shí)。
將凝膠從裝置中移出，并放置在BioRad轉(zhuǎn)膜儀中，轉(zhuǎn)膜儀中充滿了轉(zhuǎn)移緩沖液(20％甲醇、192mM甘氨酸和20mM Tris，pH8.3)。在0.36A和100V，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，0-4℃轉(zhuǎn)移3小時(shí)，伴隨著攪動(dòng)。將硝酸纖維素膜放置在兩層濾紙之間并在室溫保存，或者立即用于蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)分析。
通過在室溫下，在振蕩器上，在TBST/5％脫脂奶(10mM Tris、150mM氯化鈉，調(diào)節(jié)pH至8.0；再加入0.5％的Tween 20)中溫育1小時(shí)，封閉硝酸纖維素膜上的非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)。隨后，用TBST清洗膜，并以所需的稀釋度(1∶1000或者1∶2000，在TBST/5％奶中)加入抗GLUT2的一抗。室溫下輕輕振蕩1小時(shí)，進(jìn)行抗體-抗原的相互作用。然后，用TBST清洗膜3次，每次5分鐘，去除未結(jié)合的一抗。
向硝酸纖維素膜上加入二抗(免疫純化的羊抗兔IgG，其偶聯(lián)于過氧化物酶)(1∶50,000，在TBST/奶中)。在室溫下輕輕振蕩40分鐘，進(jìn)行此溫育。然后，用TBST清洗膜4次，每次5分鐘。然后，在一份穩(wěn)定的過氧化物溶液對(duì)一份魯米諾/增強(qiáng)劑溶液的體系中溫育膜3-5分鐘(Pierce)，如制造商所建議。將膜包裹在莎綸包裹物中并放置在盒中。在暗室中，將X-光膠片放置在膜上1-30秒種。將膜顯影，可見到條帶，并進(jìn)行定量。將樣品中的GLUT2蛋白的水平標(biāo)準(zhǔn)化為，單位重量腫瘤中的單位數(shù)，并和參照值比較，以確定腫瘤對(duì)含有葡萄糖部分的抗腫瘤藥劑的治療是否敏感。
實(shí)施例2對(duì)胰腺癌中GLUT2蛋白水平的免疫組織化學(xué)分析
在下面描述的示例性方法中，應(yīng)用下列緩沖液和溶液磷酸鹽緩沖液(PBS)5mM Na2HPO4、0.9mM KH2PO4、72mM NaCl、1.6mM KCl，pH7.4；PBS/TritonX100PBS，含Triton X100，稀釋比例為1∶500；和檸檬酸鹽緩沖液18ml 0.1M檸檬酸和82ml 0.1M檸檬酸鈉。
如實(shí)施例1所描述，獲得胰腺癌組織樣品。切成5μm的切片，并安放在硅烷包被的載片上。使載片干燥過夜。65℃加熱載玻片45分鐘至1小時(shí)，然后脫蠟和再水化，方法為入二甲苯3次，每次5分鐘，入100％酒精2次，每次3分鐘，和入95％酒精2次，每次2分鐘。在45ml甲醇和5ml 30％過氧化氫中溫育載片20分鐘，封閉內(nèi)源性的過氧化物酶。用PBS/Triton X-100潤(rùn)洗載片2次，每次2分鐘。
通過向浸有載片的玻璃容器中加入檸檬酸鹽緩沖液，并微波高功率加熱15分鐘，然后50％功率加熱5分鐘，并50％功率再加熱5分鐘，來進(jìn)行抗原修復(fù)。然后，將載片冷卻至室溫大約30分鐘，在PBS/Triton X-100中潤(rùn)洗2次，每次2分鐘。以合適的稀釋比例向每一載片加入GLUT2一抗(用PBS稀釋，每一載片加入200μl)，并在濕盒(humidity chamber)中37℃溫育1小時(shí)。用PBS 5％ TritonX-100洗滌載片2次，每次2分鐘。將生物素化的二抗施于載玻片上，室溫30分鐘。在PBS 5％Triton X-100中清洗載片。
然后，在濕盒內(nèi)室溫應(yīng)用鏈霉抗生物素蛋白30分鐘，然后在PBS 5％Triton X-100中清洗載片。加入發(fā)色團(tuán)(2.5ml PBS，1/4片3，3′二氨基苯聯(lián)胺四鹽酸(DAB)和2滴0.8％過氧化氫)，在濕盒內(nèi)室溫溫育載片10分鐘。用ddH2O潤(rùn)洗載片5分鐘，用Gill’s蘇木精中復(fù)染1分鐘，用流水清洗直至清澈。用0.25％的酸性酒精澄清細(xì)胞質(zhì)(浸蘸3次)。然后，在連續(xù)的輕緩水流下清洗載片并在1％氨水中藍(lán)化(differentiated)10秒，隨后在流水中清洗。然后，將載片脫水，方法為，在95％酒精中溫育2次，每次浸蘸8-10次；在100％酒精中2次，每次浸蘸8-10次；和二甲苯中3次，每次浸蘸10-15次；應(yīng)用Permount來施加蓋玻片，用于光學(xué)顯微鏡觀察。用Kodak Ectochrome speed 100膠片為載玻片照相，并確定染色的水平。
實(shí)施例3GLUT1的免疫組織化學(xué)分析
本實(shí)施例描述了基于抗體的免疫組織化學(xué)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分析，這在確定腫瘤樣品中的GLUT1水平中是有用的。
應(yīng)用治療癌癥患者過程中的常規(guī)方法，通過外科切除術(shù)或者腫瘤活組織檢查，分離組織樣品。分離即刻之后，將組織樣品放置在明確標(biāo)記的容器內(nèi)并送至病理部門。在進(jìn)行病理評(píng)價(jià)以評(píng)定腫瘤病理學(xué)特征并確認(rèn)樣品含有腫瘤細(xì)胞之后，將腫瘤細(xì)胞的一部分放置在標(biāo)記好的容器內(nèi)，放在干冰上，送至實(shí)驗(yàn)室。
立即將樣品浸沒在10％福爾馬林溶液中，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法加工為石蠟包埋組織塊。應(yīng)用恒冷切片機(jī)從石蠟包埋的固定組織塊切取至少三張連續(xù)切片，每張4微米厚，并將切片貼片在Vectabond包被的載玻片上(Vector Laboratories，Burlingame，CA)。讓載玻片干燥過夜，再56℃加熱30分鐘，然后將載玻片脫蠟并再水化，方法為，入二甲苯3次，每次5分鐘，入100％酒精2次，每次3分鐘，入95％酒精2次，每次2分鐘。
將載玻片在含有0.3％過氧化氫的甲醇中溫育20分鐘，封閉內(nèi)源性過氧化物酶。用PBS(5mM Na2HPO4、0.9mM KH2PO4、72mM NaCl、1.6mM KCl，pH7.4)清洗載玻片2次，每次2分鐘。
通過在10mM pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液中微波加熱載玻片，修復(fù)抗原，加熱5分鐘，三個(gè)循環(huán)。然后，將載玻片冷卻至室溫(22℃)大約30分鐘，然后在PBS中清洗2次，每次2分鐘。為封閉非特異性蛋白結(jié)合，將載玻片浸沒在的2％的正常羊血清中，2％的正常羊血清溶于含有1％BSA的PBS溶液中，室溫30分鐘。
以1∶300的稀釋比例(用含有0.1％BSA的PBS稀釋，每一載玻片加入200μl)向每一載玻片加入抗人GLUT1一抗(Chemicon International，Inc.，Temecula，CA)，在濕盒中室溫溫育2小時(shí)。該抗GLUT1抗體是親和純化的兔多克隆抗體，其用對(duì)應(yīng)于人GLUT-1序列的外表面環(huán)的15個(gè)氨基酸的合成肽來生成。
對(duì)于陰性對(duì)照，可以從相同患者的染病器官或健康器官中的健康部分，分離非腫瘤組織。此外，陰性對(duì)照可以包括，未應(yīng)用一抗的染色，用非免疫的兔IgG(20ug/ml)替代抗葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抗體，和用靶抗原蛋白預(yù)吸附的一抗染色。該分析的陽性對(duì)照是，組織切片中存在的血管組織和紅細(xì)胞中觀察到的染色。
與一抗溫育之后，用PBS清洗載玻片2次，每次2分鐘?？梢詰?yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素-生物素檢測(cè)方法，來檢測(cè)一抗。向載玻片施用生物素化的二抗，室溫30分鐘。在PBS中清洗載玻片。然后，在濕盒內(nèi)室溫應(yīng)用鏈親和素30分鐘。加入發(fā)色團(tuán)(2.5ml PBS，1/4片3，3′二氨基苯聯(lián)胺四鹽酸(DAB)和2滴0.8％過氧化氫)，并在濕盒內(nèi)室溫溫育載玻片10分鐘。
然后，在ddH2O中清洗載玻片5分鐘，在Gill’s蘇木精中復(fù)染色1分鐘，并在流水中清洗直至清澈。用0.25％的酸性酒精澄清細(xì)胞質(zhì)(浸蘸3次)。然后，在連續(xù)的輕緩水流下沖洗載玻片并在1％氨水中藍(lán)化10秒，隨后在流水中清洗。
將載玻片脫水，方法為，在95％酒精中溫育2次，每次浸蘸8-10次；在100％酒精中2次，每次浸蘸8-10次；和二甲苯中溫育3次，每次浸蘸10-15次；應(yīng)用Permount來施加蓋玻片，以便進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察。用Kodak Ectochromespeed 100膠片為載玻片照相。
記錄下具有膜染色的細(xì)胞比例的半定量評(píng)價(jià)以及染色的密度?？梢詰?yīng)用連接于BX60顯微鏡(Olympus)和KY-F55B(JVC)彩色攝像機(jī)的計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)KS-300(Zeiss)，計(jì)算出免疫活性蛋白占據(jù)的比例面積。根據(jù)染色的密度和陽性率，將染色結(jié)果按0分至4分評(píng)分。重復(fù)該實(shí)驗(yàn)，計(jì)算平均值。
取決于組織樣品和試劑的來源，此分析方法將需要對(duì)最佳參數(shù)進(jìn)行判定?？杀徽{(diào)整的參數(shù)包括但不限于，組織切片在載玻片上的粘附性、一抗的稀釋度、與一抗溫育的時(shí)間和溫度，和與一抗溫育后清洗的嚴(yán)格程度。
實(shí)施例4GLUT8 mRNA水平的分析
本實(shí)施例描述了在確定腫瘤樣品的GLUT8 mRNA水平中有用的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分析。
應(yīng)用治療癌癥患者過程中的常規(guī)方法，通過外科切除術(shù)或者腫瘤活組織檢查，分離組織樣品。分離即刻之后，將組織樣品放置在明確標(biāo)記的容器內(nèi)并送至病理部門。在進(jìn)行病理評(píng)價(jià)以評(píng)定腫瘤病理學(xué)特征并確認(rèn)樣品含有腫瘤細(xì)胞之后，將腫瘤細(xì)胞的一部分放置在標(biāo)記好的容器內(nèi)，在干冰上，送至實(shí)驗(yàn)室。
在4M硫氰酸胍中勻漿組織樣品。應(yīng)用Dynabeads mRNA純化試劑盒(Dynal Biotech)，根據(jù)制造商的建議，分離Poly(A)RNAs。
通過在含有1％甲醛的1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行變性凝膠電泳，分離1-5μg的Poly(A)RNAs。通過毛細(xì)管作用，將分離的RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Hybond N+，Amersham Pharmacia Biotech，Braunschweig，Germany)。
采用隨機(jī)寡核苷酸引導(dǎo)法(random oligonucleotide priming)，用DNA聚合酶I的Klenow片段和[α-32P]dCTP，對(duì)GLUT8 cDNA進(jìn)行放射性標(biāo)記。在ExpressHyb雜交液(Clontech Laboratories，Palo Alto，CA)中，于42℃雜交尼龍膜。
隨后，用0.12M NaCl、0.012M檸檬酸鈉、0.1％SDS，于55℃清洗膜2次，然后使膜被干燥并在磷成像板(phosphoimager plate)(Fugi Photo Film)上暴露過夜。重復(fù)該實(shí)驗(yàn)，計(jì)算平均值。
實(shí)施例5GLUT12蛋白水平的免疫組織化學(xué)分析
本實(shí)施例描述了基于抗體的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白免疫組織化學(xué)分析，這在確定腫瘤樣品中的GLUT12蛋白水平中是有用的。
在進(jìn)行抗體結(jié)合的步驟之前，如實(shí)施例2所描述，獲取并處理腫瘤組織樣品。然后，在濕盒中，用抗GLUT12一抗(R1396)的1∶150或者1∶300的5％FBS/PBS稀釋液溫育載玻片(每一載玻片200μl)，4℃過夜。該兔多克隆抗GLUT12抗體，R1396，是針對(duì)人GLUT12獨(dú)特的16個(gè)C-末端氨基酸培育出的(Rogers et al.，2002，″Identification of a novel glucose transporter-like protein-GLUT-12″Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.282E733-E738)。
與一抗溫育之后，用含有0.1％Tween-20的PBS清洗載玻片，然后與生物素化豬抗兔IgG(Dako，Carpinteria，USA)溫育1小時(shí)。可以應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素-生物素檢測(cè)方法，來檢測(cè)一抗。將生物素化的二抗應(yīng)用于載玻片，室溫30分鐘。在PBS中清洗載玻片。然后在濕盒中，于室溫應(yīng)用鏈親和素30分鐘，再用PBS清洗載玻片。加入發(fā)色團(tuán)(2.5ml PBS，1/4片3，3′二氨基苯聯(lián)胺四鹽酸(DAB)(Sigma，St.Louis，USA)和2滴0.8％過氧化氫)，在濕盒內(nèi)室溫溫育載玻片10分鐘。
然后，在ddH2O中清洗載玻片5分鐘，在Gill’s蘇木精中復(fù)染色1分鐘，并在流水中沖洗直至清澈。用0.25％的酸性酒精澄清細(xì)胞質(zhì)(浸蘸3次)。然后，在連續(xù)的輕緩水流下沖洗載玻片并在1％氨水中藍(lán)化10秒，隨后在流水中清洗。
將載玻片脫水，方法為，在95％酒精中溫育2次，每次浸蘸8-10次；在100％酒精中2次，每次浸蘸8-10次；和二甲苯中3次，每次浸蘸10-15次；應(yīng)用Permount來施加蓋玻片，用于光學(xué)顯微鏡觀察。用Kodak Ectochrome speed 100膠片為載玻片照相。
記錄下對(duì)具有膜染色的細(xì)胞的比例的半定量評(píng)價(jià)以及染色的密度。用于評(píng)價(jià)染色的標(biāo)準(zhǔn)是基于Southby等人描述的那些標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用連接于BX60顯微鏡(Olympus)和KY-F55B(JVC)彩色攝像機(jī)的計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)KS-300(Zeiss)，可以計(jì)算出免疫活性蛋白占據(jù)的比例面積。根據(jù)染色的密度和陽性率，將染色結(jié)果按0至4分來評(píng)分。
實(shí)施例6FDG-PET掃描
如Manda et al.Anti-cancer Res.(2003)23(4)3263-72中所描述，應(yīng)用18-F-氟脫氧葡萄糖(FDG)的正電子發(fā)射體層攝影術(shù)(PET)被用于確定患有胸食道SCC的患者的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平。該研究是在經(jīng)歷了外科手術(shù)前FDG-PET成像的患者中進(jìn)行的。FDG-PET研究是應(yīng)用具有59.5cm橫軸視場(chǎng)(transaxial fieldof view)和20cm軸向視野(axial field of view)的SET 2400 W PET掃描儀(SchimazuCorporation，Kyoto，Japan)進(jìn)行的，其產(chǎn)生63個(gè)圖像面，面間相隔3.125mm。橫軸FDG PET圖像和冠狀FDG PET圖像與CT或者M(jìn)RI的結(jié)果相聯(lián)合，由核醫(yī)學(xué)醫(yī)師直觀地解釋。應(yīng)用感興趣的區(qū)域，評(píng)價(jià)節(jié)段中的FDG攝取，評(píng)價(jià)區(qū)域?yàn)?×4平方像素，其包括放射性最高的區(qū)域但不包含整個(gè)腫瘤。
實(shí)施例7免疫組織化學(xué)分析
下面的分析可以被用于分析葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。切取原發(fā)性腫瘤的切片，厚度為3-4mm，在二甲苯中脫蠟，并在遞減梯度的酒精(100-70％)中再水化。用含有3％過氧化氫的甲醇溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。用蒸餾水和磷酸鹽緩沖液沖洗數(shù)次后，用正常馬血清的1∶10稀釋液溫育切片，以最小化背景染色。隨后在室溫下，與一抗(Chemicon GLUT1抗體)溫育1小時(shí)。過氧化物酶染色程序是利用ABC Elite Kits(Vector Laboratories，Burlingame，Calif.)進(jìn)行的。用3-氨基-9-乙基咔唑作為生色團(tuán)，可看到免疫染色反應(yīng)。用甲苯胺藍(lán)染色切片和/或細(xì)胞離心涂片制備物，并用Permount固定。也制備了陽性和陰性對(duì)照免疫染色物。
由病理學(xué)技術(shù)人員評(píng)價(jià)切片。應(yīng)用半定量標(biāo)準(zhǔn)，記錄下該免疫反應(yīng)的兩個(gè)特征陽性細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目(0％、＜10％、10-50％和＞50％)和反應(yīng)的強(qiáng)度(0-3)。分別記錄下免疫染色的方式(膜染色、胞漿染色)。如果瘤細(xì)胞顯示出細(xì)胞膜反應(yīng)活性，則認(rèn)為該腫瘤過量表達(dá)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析，用整合了Windows軟件的SAMBA 4000細(xì)胞成像分析系統(tǒng)(Cell Image Analysis System)(Image Products International，Inc.，Chantilly，Va.)，進(jìn)行葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白免疫染色的定量測(cè)定。強(qiáng)染色的腫瘤組織切片被用作陽性對(duì)照。用同工型-匹配的但不相關(guān)的抗體替代上述一抗，來建立陰性對(duì)照閾，將來自十個(gè)區(qū)域的結(jié)果平均化。
實(shí)施例8對(duì)細(xì)胞松弛素B敏感的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基于活性的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分析
本實(shí)施例描述了基于活性的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分析，這在確定腫瘤樣品中細(xì)胞松弛素B敏感的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平和活性方面，是有用的。
應(yīng)用治療癌癥患者過程中的常規(guī)方法，通過外科切除術(shù)或者腫瘤活組織檢查，分離組織樣品。分離即刻之后，將組織樣品放置在明確標(biāo)記的容器內(nèi)并送至病理部門。在進(jìn)行病理評(píng)價(jià)以評(píng)定腫瘤病理學(xué)特征并確認(rèn)樣品含有腫瘤細(xì)胞之后，將腫瘤細(xì)胞的一部分放置在標(biāo)記好的容器內(nèi)，放在冰上送至實(shí)驗(yàn)室。
通過加入酶至下列終濃度0.02％DNA酶、0.3％膠原酶和0.4％透明質(zhì)酸酶，獲得腫瘤細(xì)胞懸浮液，在37℃溫育2小時(shí)。用PBS清洗細(xì)胞3次，使細(xì)胞穿過25號(hào)針3次。離心之后，用孵育緩沖液(15mM HEPES、135mM NaCl、5mM KCl、1.8mM CaCl2、0.8mM MgCl2)重懸浮細(xì)胞，并在此介質(zhì)中室溫孵育細(xì)胞30分鐘。然后，在含有0.5mmol的2-脫氧葡萄糖和6μL的2-[1，2-3H]脫氧-D-葡萄糖(25-50Ci/mmol；NEN Life Science Products，Boston，MA)的0.5ml孵育緩沖液中，于常溫進(jìn)行攝取分析1分鐘。用冰冷的PBS 10mL清洗細(xì)胞，終止葡萄糖攝取。
經(jīng)離心收集細(xì)胞并用冷PBS清洗2次。然后，用0.5mL裂解緩沖液(10mMTris-HCl，pH8.0，0.2％SDS)裂解細(xì)胞，通過液體閃爍計(jì)數(shù)來分析被整合進(jìn)的放射活性。
重復(fù)實(shí)驗(yàn)并計(jì)算平均值。在扣除掉在平行樣品中的非特異性攝取之后，計(jì)算出2-脫氧葡萄糖攝取，所述的平行樣品是在10μmol/L細(xì)胞松弛素B存在的條件下進(jìn)行孵育的，細(xì)胞松弛素B是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的有效抑制物。針對(duì)平行樣品中確定的細(xì)胞數(shù)目將結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。
對(duì)于陰性對(duì)照，也從相同患者的健康器官中分離非腫瘤樣品?？扇芜x的陽性對(duì)照可以是，在已知表達(dá)高水平的GLUT4的組織中觀察到的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，所述的表達(dá)高水平的GLUT4的組織例如人肌肉組織和脂肪組織，或者應(yīng)用全長(zhǎng)GLUT4 cDNA轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞培養(yǎng)物。
實(shí)施例9針對(duì)GLUT3水平進(jìn)行的基于流式細(xì)胞術(shù)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分析
本實(shí)施例描述了基于抗體、基于流式細(xì)胞儀的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分析，這在確定腫瘤樣品的GLUT3蛋白的水平中是有用的。
應(yīng)用治療癌癥患者過程中的常規(guī)方法，通過外科切除術(shù)或者腫瘤活組織檢查，分離組織樣品。分離即刻之后，將組織樣品放置在明確標(biāo)記的容器內(nèi)并送至病理部門。在病理評(píng)價(jià)以評(píng)定腫瘤病理學(xué)特征并確認(rèn)樣品含有腫瘤細(xì)胞之后，將腫瘤細(xì)胞的一部分放置在標(biāo)記好的容器內(nèi)，放在干冰上，送至實(shí)驗(yàn)室。
應(yīng)用膠原酶消化Ficoll梯度純化方法，將樣品分散為單細(xì)胞懸液。通過在室溫(RT)以500×g沉淀30秒，在Dulbecco′s磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.6)中清洗細(xì)胞兩次。然后，在室溫用含有4％多聚甲醛的pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)固定細(xì)胞15分鐘。將細(xì)胞在PBS中清洗3次，用含有3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS重懸浮，并以每管大約105個(gè)細(xì)胞的密度，分裝在1.5ml微量離心管中。
以1∶60的稀釋比例，將抗人GLUT3一抗(Chemicon International，Inc.，Temecula，CA)加入每管，在4℃溫育過夜。與一抗溫育之后，通過在PBS中以500×g離心30秒，清洗細(xì)胞兩次。在R-藻紅蛋白標(biāo)記的羊抗兔IgG(Fisher Scientific)中重懸細(xì)胞沉淀，4℃溫育1小時(shí)，并偶爾振蕩。通過在PBS中以500×g離心30秒來清洗細(xì)胞兩次之后，將細(xì)胞重懸浮在500μl的PBS中。
采用流式細(xì)胞技術(shù)，在FACScan(Becton Dickinson)流式細(xì)胞儀上進(jìn)行IgG結(jié)合的測(cè)定。裝入細(xì)胞群以排除死細(xì)胞。取決于組織樣品和試劑的來源，此分析方法將需要對(duì)最佳參數(shù)進(jìn)行判定?？梢宰兓膮?shù)包括，一抗的稀釋比例、與一抗孵育的時(shí)間和溫度、與一抗孵育之后清洗的嚴(yán)格程度。確定每一樣品中陽性染色的細(xì)胞的比例，并且可以和陰性對(duì)照樣品比較。在一種實(shí)施方案中，流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果被顯示為，細(xì)胞數(shù)目對(duì)染色強(qiáng)度(例如，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的數(shù)目)，以及與調(diào)查人群相比較的樣品分布。
盡管已經(jīng)通過參考具體的實(shí)施方案，詳細(xì)描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，其修改和改進(jìn)包含在本發(fā)明的范圍和精神之內(nèi)，如在權(quán)利要求中所闡明的。本文引用的所有出版物和專利文獻(xiàn)(專利、公開的專利申請(qǐng)和未公開的專利申請(qǐng))通過引用方式并入本文作為參考，如同每一份這樣的出版物或者文獻(xiàn)都被具體地和分別地指出已并入本文作為參考。對(duì)出版物和專利文獻(xiàn)的引用不是要承認(rèn)任何這樣的文獻(xiàn)都是有關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)，也不是構(gòu)成關(guān)于其內(nèi)容或者時(shí)間的任何認(rèn)可。現(xiàn)在，已經(jīng)通過書面的描述和實(shí)施例的方式描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明可以以各種實(shí)施方案被實(shí)施，并且前面的說明和實(shí)施例是為了說明的目的而不是對(duì)權(quán)利要求的限制。
權(quán)利要求
1.用于確定癌癥對(duì)抗腫瘤藥劑的治療是否敏感的方法，其包括下列步驟(a)獲取癌癥的樣品；(b)測(cè)定所述樣品中至少一種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平；(c)將所述水平與預(yù)先確定的值比較；和(d)如果測(cè)定出的水平比預(yù)先確定的值高，則確定該癌癥對(duì)該抗腫瘤藥劑的治療是敏感的。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的抗腫瘤藥劑包含葡萄糖部分。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的抗腫瘤藥劑包含葡萄糖類似物部分。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的葡萄糖類似物部分是果糖部分。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是I類GLUT。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是II類GLUT。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是III類GLUT。
8.前述權(quán)利要求中的任意一項(xiàng)所述的方法，其中至少兩種不同的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被測(cè)定。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中至少一種I類GLUT、至少一種II類GLUT和至少一種III類GLUT的水平被測(cè)定。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的抗腫瘤藥劑是鏈脲菌素。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是GLUT2。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的抗腫瘤藥劑是glucofosfamide。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是Na+依賴型葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
14.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的抗腫瘤藥劑是糖基-S-亞硝基硫醇。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是GLUT1。
16.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平是通過免疫學(xué)分析被測(cè)定的。
17.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平是通過RNA或者cDNA的擴(kuò)增被測(cè)定的。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的癌癥選自白血病、乳腺癌、皮膚癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、腦癌、喉癌、膽囊癌、胰腺癌、胰島癌、直腸癌、甲狀旁腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、神經(jīng)組織癌、頭部和頸部癌癥、結(jié)腸癌、胃癌、支氣管癌、腎癌、基底細(xì)胞癌、潰瘍型鱗狀細(xì)胞癌和乳頭型鱗狀細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性皮膚癌、骨肉瘤、尤因肉瘤、網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤、骨髓瘤、巨細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺腫瘤、胰島細(xì)胞癌、原發(fā)性腦腫瘤、急性和慢性淋巴細(xì)胞瘤和粒細(xì)胞瘤、毛細(xì)胞瘤、腺瘤、過度增生、髓樣癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、粘膜神經(jīng)瘤、腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤、增生性角膜神經(jīng)瘤、類馬伐氏癥候群腫瘤、腎母細(xì)胞瘤、精原細(xì)胞瘤、卵巢腫瘤、平滑肌腫瘤、子宮頸發(fā)育不良和原位癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、軟組織肉瘤、惡性類癌、局部皮膚病損、蕈樣肉芽腫病、橫紋肌肉瘤、卡波西肉瘤、骨源性肉瘤和其它肉瘤、惡性高鈣血癥、腎細(xì)胞瘤、真性紅細(xì)胞增多癥、腺癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、白血病、淋巴瘤、惡性黑素瘤和表皮癌。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的癌癥是胰腺癌。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的癌癥是胰島細(xì)胞癌。
21.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是GLUT2，所述的癌癥是胰腺癌或者胰島細(xì)胞癌，所述的抗腫瘤藥劑是鏈脲菌素、glucofosfamide或者gluSNAP化合物。
22.用于確定對(duì)患者的化學(xué)治療方案的方法，所述方法包括下列步驟(a)診斷患者為患有癌癥；(b)從所述患者獲取癌癥樣品；(c)測(cè)定所述樣品中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平；(d)將在步驟(c)中測(cè)定的量與預(yù)先確定的值相比較；和(e)如果在步驟(c)中測(cè)定的量大于所述預(yù)先確定的量，則確定，該患者是用由所述葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)送的抗腫瘤藥劑進(jìn)行治療的候選者。
23.用于確定癌癥對(duì)抗腫瘤藥劑的治療是否敏感的試劑盒，所述試劑盒包括(a)試劑，其用于確定在癌癥樣品中一種或者多于一種的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平，和(b)包括參照值的說明書。
全文摘要
測(cè)定在含有癌細(xì)胞的樣品中一種或者多種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平，并將該水平與參照值相比較，以確定該癌癥對(duì)該抗癌藥劑的治療是否敏感，所述的抗癌藥劑含有可由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入癌癥細(xì)胞的葡萄糖或者葡萄糖類似物。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1771334SQ200480009532
公開日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2004年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月7日
發(fā)明者G·提馬思 申請(qǐng)人:施瑞修德制藥公司