專利名稱：一種可提高腫瘤對紫杉醇敏感性的聯(lián)合用藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤藥物，尤其是涉及一種在腫瘤治療中可提高腫瘤對紫杉醇 (Taxol)敏感性的新型聯(lián)合用藥。
背景技術(shù)：
紫杉醇(Taxol)是一種能阻斷細(xì)胞中微管功能而導(dǎo)致細(xì)胞死亡的藥物，在臨床上已被廣泛應(yīng)用于乳腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌等實(shí)體瘤的治療(I. Jordan MA, Wilson L Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat Rev Cancer 2004 ；4 :253-265)。 但由于種種原因，如p-糖蛋白(P-Glygoprotein)過表達(dá)、微管蛋白突變等原因，腫瘤病人對紫杉醇的抗藥現(xiàn)象卻越來越突出，成為治療腫瘤病人的一大障礙；而且，紫杉醇的臨床毒副作用較廣泛，主要包括過敏反應(yīng)、神經(jīng)毒性、造血抑制(2. Rodriguez-Antona C Pharmacogenomics of paclitaxel. Pharmacogenomics 2010 ；11 :621-623);此夕卜，由于天然的紫杉醇產(chǎn)量較少，臨床上經(jīng)常出現(xiàn)世界性的供不應(yīng)求現(xiàn)象，這些因素都對紫杉醇在腫瘤治療上的應(yīng)用帶來了很大的挑戰(zhàn)。因此，近年來紫杉醇與其它藥物的聯(lián)合使用策略得到了高度的關(guān)注和發(fā)展，國外有很多這樣的與紫杉醇藥物聯(lián)用已經(jīng)成功地進(jìn)入臨床使用或臨床前的測試。這種聯(lián)合使用的優(yōu)勢在于一方面可以提高某些對紫杉醇不敏感或有抗藥性的腫瘤對紫杉醇的敏感性并降低對紫杉醇的抗藥性，同時(shí)在保證同樣療效的前提下降低紫杉醇的用藥量，從而減少毒副作用的發(fā)生和對紫杉醇的依賴。吡喹酮是一種高效廣譜抗寄生蟲藥，已在臨床上用于治療寄生蟲多年，對寄生于人體和動物的多種寄生蟲，特別是對血吸蟲、華支睪吸蟲、并殖吸蟲、姜片蟲和多種絳蟲的成蟲及幼蟲等都有顯著的殺蟲作用，且毒性低，使用方便(3. GonnertR，Andrews P Praziquantel, a new board—spectrum antischistosomal agent. ZParasitenkd 1977 ； 52 :129-150 ；4.Grover JK, Vats V，Uppal G，Yadav S Anthelmintics a review. Trop Gastroenterol 2001 ；22 :180-189),目前還未見到任何有關(guān)吡喹酮涉及抗腫瘤治療的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可提高腫瘤對紫杉醇敏感性的聯(lián)合用藥。所述一種可提高腫瘤對紫杉醇敏感性的聯(lián)合用藥包括吡喹酮和紫杉醇，所述吡喹酮和紫杉醇的質(zhì)量比為(180 2200) I。所述吡喹酮是一種已經(jīng)在臨床上廣泛應(yīng)用于治療寄生蟲病的化學(xué)藥物，所述紫杉醇是一種已經(jīng)廣泛應(yīng)用于抗腫瘤化療的藥物。所述聯(lián)合用藥可提高腫瘤對紫杉醇的敏感性并可以有效提高紫杉醇對腫瘤的殺傷能力，能極大地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生，可以有效提高對紫杉醇不敏感性或有抗藥性的腫瘤對紫杉醇的敏感性，并且大大降低腫瘤細(xì)胞對紫杉醇的抗藥性。吡喹酮單獨(dú)使用時(shí)對腫瘤細(xì)胞并沒有明顯的殺傷效果，但是當(dāng)吡喹酮和紫杉醇聯(lián)
3合使用時(shí)能有效提高紫杉醇對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，并在細(xì)胞水平和動物腫瘤模型中明顯增強(qiáng)紫杉醇對腫瘤的殺傷性。此外，這兩個(gè)藥物的聯(lián)合使用還能有效地提高某些對紫杉醇不敏感性或有抗藥性的腫瘤對紫杉醇的敏感性。


圖 I 為利用 MTT (3_ (4，5-cimethylthiazol_2-yl) _2，5-diphenyl tetrazolium Bromide ;3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名噻唑藍(lán))方法檢測不同腫瘤細(xì)胞在紫杉醇處理后的存活率，依此測量這些腫瘤細(xì)胞對紫杉醇的敏感性。在圖I 中，橫坐標(biāo)為IC50值，縱坐標(biāo)為腫瘤細(xì)胞系。圖2為用MTT方法檢測腫瘤細(xì)胞株乳腺癌細(xì)胞ZR-7530和Bcap37、人宮頸癌細(xì)胞 HeLa、肺癌細(xì)胞Spc-a_l和Lt印_a_2經(jīng)吡喹酮和紫杉醇單獨(dú)處理及聯(lián)合處理后細(xì)胞存活率的結(jié)果。在圖2中，縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率(％) ;a為吡喹酮，b為紫杉醇，c為吡喹酮+紫杉醇。圖3用MTT方法檢測對紫杉醇不敏感的結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-I (A)經(jīng)吡喹酮與紫杉醇聯(lián)合處理后的存活率。在圖3中，橫坐標(biāo)為紫杉醇濃度(nM)，縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率)； □為紫彬醇， 為紫杉醇+20 μ m吡喹酮。圖4用MTT方法檢測對紫杉醇不敏感的肺癌細(xì)胞H1299經(jīng)吡喹酮與紫杉醇聯(lián)合處理后的存活率。在圖4中，橫坐標(biāo)為紫杉醇濃度(nM)，縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率(％) ; □為紫彬醇， 為紫杉醇+20 μ m吡喹酮。圖5為利用流式細(xì)胞術(shù)對經(jīng)吡喹酮和紫杉醇分別單獨(dú)處理及聯(lián)合處理后結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-I的細(xì)胞凋亡檢測的結(jié)果。在圖5中，縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率)。圖6為利用流式細(xì)胞術(shù)對經(jīng)吡喹酮和紫杉醇分別單獨(dú)處理及聯(lián)合處理后肺癌細(xì)胞H1299的細(xì)胞凋亡檢測的結(jié)果。在圖6中，縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率(％ )。圖7為在裸鼠動物中用對紫杉醇不敏感結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-I所建立的腫瘤模型經(jīng)吡喹酮和紫杉醇單獨(dú)給藥或聯(lián)合給藥后的抑瘤率結(jié)果。在圖7中，縱坐標(biāo)為抑瘤率(％ )。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例I、檢測不同腫瘤細(xì)胞對紫杉醇的敏感性用MTT方法檢測不同腫瘤細(xì)胞系對紫杉醇的敏感性。將人宮頸癌細(xì)胞HeLa、前列腺癌細(xì)胞 PC-3、結(jié)腸癌細(xì)胞 SW620、HT29、HCT-116, DLD-1、肺癌細(xì)胞 Lt印_a_2、Spc-a-1、 H460、H1299、A549、乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231、ZR-7530、Bcap37 以每孔 5000 7000 個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種到96孔板，12 16h后，以O(shè) 200nM的紫杉醇處理48h，然后吸去培養(yǎng)液，每孔加入80 120 μ I含O. 5mg/ml MTT的細(xì)胞培養(yǎng)液，37°C下反應(yīng)2 4h后，去掉細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入100 μ I 二甲基亞砜(DMSO)去溶解上一步驟中形成的甲瓚結(jié)晶，再用酶標(biāo)儀檢測0D570讀值。紫杉醇對細(xì)胞的生長抑制率按如下公式計(jì)算抑制率=(I-加藥組0D570值/不加藥物組0D570值)X 100%將濃度及濃度對應(yīng)的抑制率輸入GraphPad軟件(GraphPad Software Inc)得到半數(shù)抑制濃度(IC50)，即對細(xì)胞的生長抑制率達(dá)50%時(shí)所需的藥物濃度。
紫杉醇對不同腫瘤細(xì)胞的IC50值見圖I。在這些腫瘤細(xì)胞中，結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-I 的IC50最大，為150nM，其次為肺癌細(xì)胞H1299細(xì)胞，IC50值為ΙΟΟηΜ，紫杉醇對其它細(xì)胞的IC50值在5 30nM范圍內(nèi)。一般情況下，當(dāng)IC50值大于50nM時(shí)，可認(rèn)為該細(xì)胞對紫杉醇不敏感或具有抗藥性。上述檢測結(jié)果表明，在我們所檢測的腫瘤細(xì)胞中，如已經(jīng)報(bào)道的一樣，結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-I和肺癌細(xì)胞H1299為對紫杉醇不敏感細(xì)胞(即對紫杉醇有抗藥性的細(xì)胞)。實(shí)施例2、檢測紫杉醇單獨(dú)使用或吡喹酮單獨(dú)使用以及他們聯(lián)合使用時(shí)對 ZR-7530、HeLa> Spc-a-1、Ltep-a-2、Bcap-37等多種腫瘤細(xì)胞系存活率的影響將乳腺癌細(xì)胞ZR-7530和Bcap-37、人宮頸癌細(xì)胞HeLa、肺癌細(xì)胞Spc-a-Ι和 Ltep-a-2等細(xì)胞以每孔5000 7000個(gè)細(xì)胞的密度接種到96孔板上，12 16h后，加入吡喹酮和紫杉醇單獨(dú)使用或聯(lián)合使用。采用不同的吡喹酮和紫杉醇的配比對不同的腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行藥物處理，藥物配比和處理時(shí)間分別為處理HeLa和ZR-7530細(xì)胞時(shí)，采用吡喹酮和紫杉醇的配比為730 I (質(zhì)量比)，處理時(shí)間為48h;處理Bcap-37和Spc-a-Ι細(xì)胞時(shí)，采用吡喹酮和紫杉醇的配比為2200 1(質(zhì)量比)，處理時(shí)間為48h ;處理Lt印-a-2細(xì)胞時(shí)， 采用吡喹酮和紫杉醇的配比為2200 1(質(zhì)量比)，處理時(shí)間為60h。然后按實(shí)施例I所述的MTT方法得到0D570讀值，再按如下公式計(jì)算得到不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞的存活率，細(xì)胞存活率=加藥組0D570值/不加藥物組0D570值X 100%。由此得出這些腫瘤細(xì)胞系在吡喹酮、紫杉醇單獨(dú)使用時(shí)或聯(lián)合使用下的細(xì)胞存活率。由圖2結(jié)果表明，在所述條件處理下，吡喹酮的單獨(dú)使用幾乎不對腫瘤細(xì)胞有影響；而在上述條件下，紫杉醇的單獨(dú)處理，這些腫瘤細(xì)胞仍可達(dá)70% 80%的存活率；當(dāng)在所述條件下，吡喹酮和紫杉醇兩種藥物聯(lián)合使用后，它們能顯著降低細(xì)胞的存活率，這些細(xì)胞的存活率都下降到不到50%。這些結(jié)果表明吡喹酮可在多種腫瘤細(xì)胞中增強(qiáng)紫杉醇對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。實(shí)施例3、比較紫杉醇單獨(dú)使用及其與吡喹酮的聯(lián)合使用對結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-I和肺癌細(xì)胞H1299細(xì)胞存活率的影響將對紫杉醇不敏感的結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-I和肺癌細(xì)胞H1299以每孔5000 7000個(gè)細(xì)胞的密度接種到96孔板上，12 16h后，加入濃度為0-80nM的紫杉醇，或20 μ M吡喹酮， 或20 μ M吡喹酮與O 80ηΜ紫杉醇聯(lián)合作用，處理時(shí)間為24 48h。然后按實(shí)施例I所述的MTT方法得到0D570讀值，再按實(shí)施例2中的公式計(jì)算得到不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞的存活率。圖3和圖4分別是結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-I和肺癌細(xì)胞H1299經(jīng)紫杉醇單獨(dú)處理或紫杉醇和吡喹酮聯(lián)合處理后得到的細(xì)胞存活率曲線，由圖3和4可知，在吡喹酮濃度為20 μ M，紫杉醇濃度為10 40ηΜ，即吡喹酮和紫杉醇配比在(180 730) 1(質(zhì)量比)時(shí)，吡喹酮可極大地促進(jìn)紫杉醇對其不敏感的腫瘤細(xì)胞系結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-I和肺癌細(xì)胞Η1299的殺傷力。在沒有吡喹酮存在的條件下，紫杉醇?xì)鼈兌_(dá)到的IC50值高于80ηΜ;而當(dāng)紫杉醇和20 μ M吡喹酮聯(lián)合作用時(shí)，紫杉醇?xì)Y(jié)腸癌細(xì)胞DLD-I和肺癌細(xì)胞Η1299的IC50值僅為IOnM到20ηΜ。與紫杉醇單獨(dú)使用時(shí)相比，IC50值顯著降低。這個(gè)結(jié)果表明在有吡喹酮存在的條件下，結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-I和肺癌細(xì)胞Η1299對紫杉醇的敏感性顯著提高。實(shí)施例4、檢測吡喹酮、紫杉醇單獨(dú)使用以及它們聯(lián)合使用對結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-I和肺癌細(xì)胞H1299細(xì)胞凋亡的影響用流式細(xì)胞術(shù)檢測吡喹酮、紫杉醇單獨(dú)使用以及它們聯(lián)合作用后誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-I和肺癌細(xì)胞H1299的細(xì)胞凋亡情況。先將DLD-I和H1299細(xì)胞分別以每孔(I 2) IO6個(gè)細(xì)胞的密度接種到60mm培養(yǎng)板上培養(yǎng)12 16h，再將DLD-I和H1299細(xì)胞各分四個(gè)實(shí)驗(yàn)組第一組細(xì)胞為對照組不處理；第二組細(xì)胞用20 μ M吡喹酮單獨(dú)處理48h ;第三組細(xì)胞用IOnM紫杉醇單獨(dú)處理48h ;第四組細(xì)胞用20 μ M吡喹酮和IOnM紫杉醇(吡喹酮和紫杉醇的配比為730 I)聯(lián)合處理48h。然后用胰酶消化的辦法收獲這些細(xì)胞，1000轉(zhuǎn)離心5min，去掉上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗一次。加入70 %乙醇4°C固定12 24h， 1000轉(zhuǎn)離心5min，去掉上清，PBS重懸后，加入O. lmg/ml RNA酶于37°C反應(yīng)30min，然后加入O. lmg/ml碘化丙錠于37°C反應(yīng)30min，樣品隨后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果如圖5和6所示，圖5和圖6分別是DLD-I和H1299細(xì)胞經(jīng)吡喹酮、紫杉醇單獨(dú)處理以及它們聯(lián)合處理后細(xì)胞的凋亡情況。吡喹酮單獨(dú)處理DLD-I和H1299細(xì)胞幾乎不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；DLD-1和H1299細(xì)胞經(jīng)紫杉醇在上述用量下單獨(dú)處理后的細(xì)胞凋亡率分別僅為12%和20%;而用上述用量的吡喹酮和紫杉醇聯(lián)合處理DLD-I和H1299這兩個(gè)細(xì)胞后，細(xì)胞的凋亡率分別上升到49%和45%。這些結(jié)果表明，吡喹酮可顯著提高那些對紫杉醇不敏感細(xì)胞(或紫杉醇抗性細(xì)胞)被紫杉醇誘導(dǎo)所產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡率。實(shí)施例5、檢測吡喹酮、紫杉醇單獨(dú)給藥和它們聯(lián)合給藥對裸鼠移植腫瘤生長的抑制情況以裸鼠(雄性，18 20g)為實(shí)驗(yàn)動物。取對數(shù)生長期的結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-I細(xì)胞， 按每只(I 5) X IO6的細(xì)胞數(shù)接種裸鼠，5天后將裸鼠隨機(jī)分成4組，對照組即不給藥組， 吡喹酮單獨(dú)給藥組，紫杉醇單獨(dú)給藥組，吡喹酮和紫杉醇聯(lián)合給藥組，每組6只，按以下方式給藥對照組細(xì)胞接種后未給予任何藥物治療；吡喹酮組每只裸鼠使用劑量80 120mg/kg的吡喹酮，腹腔注射，一共給藥5次；紫杉醇組每只裸鼠使用劑量25 35mg/kg的紫杉醇，腹腔注射，一共給藥3次；吡喹酮和紫杉醇聯(lián)合給藥組吡喹酮和紫杉醇同時(shí)應(yīng)用，劑量與給藥方式與單獨(dú)用藥相同。給藥兩周后用脫頸法處死裸鼠，解剖取腫瘤，稱瘤重，根據(jù)以下公式計(jì)算腫瘤生長抑制率抑制率=(I-給藥組瘤重/對照組瘤重)X 100%不同藥物處理對裸鼠的抑瘤率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖7，在上述吡喹酮單獨(dú)給藥的條件下， 幾乎不能抑制移植腫瘤的生長；在上述紫杉醇單獨(dú)給藥條件下能在一定程度上抑制移植腫瘤的生長，其抑瘤率可達(dá)20% ;而在上述吡喹酮和紫杉醇聯(lián)合給藥的條件下，其抑瘤率可達(dá) 52 %，較紫杉醇單獨(dú)給藥，紫杉醇和吡喹酮的聯(lián)合給藥可顯著抑制腫瘤的生長。這些結(jié)果表明，吡喹酮和紫杉醇這兩個(gè)藥物的聯(lián)合使用對腫瘤的生長有更強(qiáng)的抑制效果，大大地提高了紫杉醇對紫杉醇不敏感細(xì)胞(或紫杉醇抗性細(xì)胞)的殺傷能力。綜上所述，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吡喹酮可顯著提高多種腫瘤細(xì)胞對紫杉醇?xì)拿舾行?，包括對紫杉醇有抗性的腫瘤細(xì)胞。在已獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中，吡喹酮和紫杉醇的藥物組合，可以大大降低腫瘤細(xì)胞對紫杉醇的抗藥性。并且，吡喹酮與紫杉醇的聯(lián)合作用，與藥物單獨(dú)作用相比，極大地促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。以吡喹酮和紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤治療具有以下優(yōu)點(diǎn)I)療效顯著，吡喹酮極大地提高了腫瘤細(xì)胞對紫杉醇的敏感性；2)在保證同樣治療效果的情況下，吡喹酮和紫杉醇聯(lián)合使用可以降低紫杉醇的用藥量，從而可減少紫杉醇單獨(dú)用藥帶來的毒副作用；3)兩種藥物都已在臨床上廣泛使用，臨床的安全性已被證實(shí)；4)紫杉醇價(jià)格昂貴，但吡喹酮和紫杉醇聯(lián)用可以降低紫杉醇的用藥量，節(jié)省成本， 且吡喹酮價(jià)格低廉，該藥物組合可減輕病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本發(fā)明為腫瘤的防治提供了一條新途徑，在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。
權(quán)利要求
1.一種可提高腫瘤對紫杉醇敏感性的聯(lián)合用藥，其特征在于包括吡喹酮和紫杉醇，所述吡喹酮和紫杉醇的質(zhì)量比為180 2200 I。
全文摘要
一種可提高腫瘤對紫杉醇敏感性的聯(lián)合用藥，涉及一種抗腫瘤藥物。所述聯(lián)合用藥包括吡喹酮和紫杉醇，所述吡喹酮和紫杉醇的質(zhì)量比為180～2200∶1。所述聯(lián)合用藥可提高腫瘤對紫杉醇的敏感性并可以有效提高紫杉醇對腫瘤的殺傷能力，能極大地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生，可以有效提高對紫杉醇不敏感性或有抗藥性的腫瘤對紫杉醇的敏感性，并且大大降低腫瘤細(xì)胞對紫杉醇的抗藥性。
文檔編號A61K31/4985GK102579449SQ20121009197
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月30日
發(fā)明者盧明科, 吳振華, 李曉彤 申請人:廈門大學(xué)