一種塵螨特異性IgG4亞型抗體校準(zhǔn)品及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物體外診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種塵螨特異性IgG4亞型抗體校 準(zhǔn)品及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 研宄發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行塵螨脫敏治療后，患者血清中塵螨特異性IgG4亞型抗體水平顯 著上升（P〈0. 0001)。誘導(dǎo)產(chǎn)生的塵螨特異性IgG4亞型抗體水平的升高，在特異性免疫治療 過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，可通過(guò)檢測(cè)特異性IgG4抗體水平對(duì)脫敏治療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。目 前，體外診斷是脫敏療效檢測(cè)的常用方法。在生物制品的標(biāo)準(zhǔn)化、質(zhì)量控制和效力評(píng)價(jià)中校 準(zhǔn)品是體外診斷試劑評(píng)價(jià)的標(biāo)尺，起著非常重要的作用。
[0003] 然而目前國(guó)際、國(guó)內(nèi)均沒(méi)有塵螨特異性IgG4亞型抗體的校準(zhǔn)品，這給實(shí)際研宄工 作和臨床檢驗(yàn)工作帶來(lái)很多不便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種塵螨特異性IgG4亞型抗體校準(zhǔn)品（校準(zhǔn)物質(zhì)），用于 標(biāo)定塵螨特異性IgG4亞型抗體的含量，從而判斷脫敏治療療效。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種塵螨特異性IgG4亞型抗體校準(zhǔn) 品，所述校準(zhǔn)品中塵螨特異性IgG4亞型抗體蛋白濃度為lug/mL，塵螨特異性IgG4亞型抗體 蛋白純度多95wt%，其制備方法包括以下步驟：
[0006] (1)候選血清的制備：對(duì)臨床適應(yīng)癥為過(guò)敏的病人進(jìn)行脫敏治療之后，無(wú)菌采取 血液并收集到無(wú)菌的采血管中，在室溫條件下靜置，待血清析出后，取上清，離心分離血清， 作為候選血清；
[0007] (2)候選物的篩選：通過(guò)法瑪西亞UniCap檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)候選物進(jìn)行塵螨特異性IgG4 抗體檢測(cè)，塵螨特異性IgG4亞型抗體高陽(yáng)血清（多0.lmg/mL)作為候選物；
[0008] (3)塵螨特異性IgG4亞型抗體的提取與純化：
[0009] 1)塵螨親和層析純化，將篩選出的候選物經(jīng)過(guò)塵螨親和層析柱上樣，洗雜，洗脫， 收集洗脫后的蛋白吸收峰組分；
[0010] 2)抗人IgG4亞型抗體親和層析柱純化，將步驟1)洗脫后所得的蛋白吸收峰經(jīng)抗 人IgG4亞型抗體親和層析柱上樣，洗雜，洗脫，收集得第二次蛋白吸收峰組分；
[0011] 3)分子篩層析純化，將洗脫后的蛋白吸收峰經(jīng)分子篩層析柱上樣，洗脫，收集得第 三次蛋白吸收峰組分；
[0012] 4)濃縮、除菌、蛋白濃度測(cè)定、蛋白純度鑒定，將洗脫后所得的三次蛋白吸收峰組 分經(jīng)離心超濾濃縮后，通過(guò)直徑為0. 22ym的微孔濾膜除菌后，得塵螨特異性IgG4亞型抗 體提純物，并采用凱氏定氮法檢測(cè)蛋白濃度、通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定蛋白純度；
[0013] (4)校準(zhǔn)品的分裝、凍干、熔封：
[0014] 1)配制凍存液，在磷酸根摩爾濃度為0.01mol/L，Tween20體積分?jǐn)?shù)為1%。，pH= 7. 2?7. 4的PBST緩沖液中加入酪蛋白和核糖，使酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5?5%，核糖的 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1?10%，得凍存液；將所得凍存液用微孔濾膜進(jìn)行抽濾，得抽濾凍存液；
[0015] 2)將所得塵螨特異性IgG4亞型抗體提純物用制得的抽濾凍存液稀釋至1yg/mL， 得所述塵螨特異性IgG4亞型抗體校準(zhǔn)品；
[0016] 3)將所得標(biāo)準(zhǔn)濃度蛋白溶液進(jìn)行無(wú)菌分裝，并用鋁箔紙封口后在-80°C溫度下過(guò) 夜；
[0017] 4)過(guò)夜后在鋁箔紙上扎小孔，進(jìn)行真空冷凍干燥、熔封，得所述凍干塵螨特異性 IgG4亞型抗體校準(zhǔn)品。
[0018] (5)凍干塵螨特異性IgG4亞型抗體校準(zhǔn)品的鑒定：
[0019] 1)物理性狀檢驗(yàn)；
[0020] 2)無(wú)菌檢驗(yàn)、真空度檢驗(yàn)，按照《中國(guó)藥典》的規(guī)定方法進(jìn)行檢驗(yàn)；
[0021] 3)剩余水分測(cè)定，按照《中國(guó)藥典》的規(guī)定，以真空烘干法進(jìn)行剩余水分測(cè)定，應(yīng)不 超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的4% ;
[0022] 4)均一性檢驗(yàn)，隨機(jī)抽取規(guī)定數(shù)量的樣品，使用免疫球蛋白G4測(cè)定試劑盒（散射 比濁法），注冊(cè)號(hào)為國(guó)食藥監(jiān)械（進(jìn)）字2014第2400357號(hào)，進(jìn)行標(biāo)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)一致。
[0023] 5)穩(wěn)定性試驗(yàn)，采用熱加速穩(wěn)定性試驗(yàn)方法，檢查在高溫條件下樣品放置的時(shí)間， 并以此數(shù)據(jù)作為依據(jù)，為下一批穩(wěn)定性試驗(yàn)作基礎(chǔ)。
[0024] 6)定值（協(xié)作標(biāo)定），選擇3個(gè)以上具有對(duì)血清學(xué)試驗(yàn)有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室或醫(yī)院檢 驗(yàn)科，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用3個(gè)樣品，每個(gè)樣品重復(fù)2次，各協(xié)作標(biāo)定單位按照協(xié)作標(biāo)定方案的 要求，使用免疫球蛋白G4測(cè)定試劑盒（散射比濁法），注冊(cè)號(hào)為國(guó)食藥監(jiān)械（進(jìn)）字2014 第2400357號(hào)，進(jìn)行標(biāo)定，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果交給組織單位。
[0025] 根據(jù)上述方案，所述塵螨親和層析柱所用膠凝為經(jīng)塵螨致敏蛋白偶聯(lián)的 CNBR-activatedSepharose4B溶脹基質(zhì)。
[0026] 根據(jù)上述方案，所述塵螨親和層析純化步驟為：將篩選出的候選物經(jīng)塵螨親和層 析柱上樣，上樣量為經(jīng)塵螨致敏蛋白偶聯(lián)的CNBR-activatedSepharose4B溶脹基質(zhì)體積 的8倍；在洗脫前，用10倍柱體積PBS緩沖液洗柱，使A280值恢復(fù)到基線(xiàn)或本底水平；然 后進(jìn)行洗脫，用5?10倍體積的0. 05M，PH為4. 0的醋酸鈉-醋酸緩沖液洗脫結(jié)合的蛋白； 匯集A280彡0. 2的峰組分，得蛋白吸收峰組分。
[0027] 根據(jù)上述方案，所述抗人IgG4亞型抗體親和層析柱所用膠凝為經(jīng)抗人IgG4抗體 偶聯(lián)的CNBR-activatedSepharose4B溶脹基質(zhì)。
[0028] 根據(jù)上述方案，所述抗人IgG4亞型抗體親和層析純化步驟為：將洗脫后的蛋 白吸收峰組分經(jīng)抗人IgG4亞型抗體親和層析柱上樣，上樣量為經(jīng)抗人IgG4抗體偶聯(lián)的 CNBR-activatedS印harose4B溶脹基質(zhì)體積的8倍；在洗脫前，用10倍柱體積PBS緩沖 液洗柱，使A280值恢復(fù)到基線(xiàn)或本底水平；然后進(jìn)行洗脫，用5?10倍體積的0. 05M，PH為 4. 0的醋酸鈉-醋酸緩沖液洗脫結(jié)合的抗體蛋白；匯集A280多0. 2的峰組分，得第二次蛋 白吸收峰組分。
[0029] 根據(jù)上述方案，所述分子篩層析純化步驟為：以葡聚糖凝膠S印hadexG75為分 子篩層析柱所用膠凝，將洗脫后的二次蛋白吸收峰組分經(jīng)分子篩層析柱上樣，上樣量為 S印hadexG75體積的8倍；在洗脫前，用10倍柱體積PBS緩沖液洗柱，讓A280值恢復(fù)到基 線(xiàn)或本底水平；然后進(jìn)行洗脫，用5?10倍體積的PBS緩沖液洗脫；匯集A280彡0. 2的峰 組分，得第三次蛋白吸收峰組分。
[0030] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0031] 1)本發(fā)明通過(guò)采集臨床過(guò)敏病人進(jìn)行脫敏治療之后塵螨特異性IgG4亞型抗體檢 測(cè)陽(yáng)性的血清作為候選血清，通過(guò)效價(jià)篩選，然后進(jìn)行塵螨特異性IgG4亞型抗體的進(jìn)行提 取、純化并采用凍存液替換稀釋血清基質(zhì)來(lái)制備所述塵螨特異性IgG4亞型抗體校準(zhǔn)品，制 得的校準(zhǔn)品純度高、穩(wěn)定性好，可有效判斷脫敏治療的療效。
[0032] 2)本發(fā)明為了保證該校準(zhǔn)品的均一性和穩(wěn)定性，采用凍存液替換血清基質(zhì)，再通 過(guò)真空冷凍干燥法制備凍干塵螨特異性IgG4亞型抗體校準(zhǔn)品，進(jìn)一步保證制得校準(zhǔn)品的 均一性和穩(wěn)定性。
[0033] 3)本發(fā)明涉及的制備方法科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)、完善，按照校準(zhǔn)品制備程序使每一個(gè)步驟科 學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)，經(jīng)過(guò)協(xié)作標(biāo)定，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，保證效價(jià)定值準(zhǔn)確。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限 定本發(fā)明。
[0035] 以下實(shí)施例中，所述塵螨親和層析柱中所用凝膠為經(jīng)塵螨致敏蛋白偶聯(lián)的 CNBR-activatedSepharose4B溶脹基質(zhì)，其制備步驟為：稱(chēng)取 0.lgCNBR-activated Sepharose4B基質(zhì)干粉，懸浮于ImM的HC1中，基質(zhì)迅速溶脹后用ImM的HC1洗柱15min， 每克干粉用 200ml，ImM的HC1，得CNBR-activatedSepharose4B基質(zhì)；將 1. 5mg塵螨致敏 蛋白溶解到〇. 5mL，0. 1MNaHC03(PH為8. 3,NaCl含量為0. 5M)的偶聯(lián)液中；將含有塵螨致 敏蛋白的偶聯(lián)液與制備好的CNBR-activatedSepharose4B基質(zhì)混合，并在4°C條件下翻 轉(zhuǎn)過(guò)夜；用至少5倍體積的偶聯(lián)液洗掉多余的塵螨致敏蛋白；用0. 1M的TRIS-HC1緩沖液 (PH為8. 0)封閉基質(zhì)上的CNBR活性集團(tuán)；用至少5倍體積的0. 1M的醋酸鈉-醋酸緩沖液 (P