專利名稱：新型鴨呼腸孤病毒重組σB(SigmaB)蛋白抗原、制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型鴨呼腸孤病毒重組O B蛋白抗原的制備及其在檢測新型鴨呼腸孤病毒病抗體中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鴨出血性壞死性肝炎是由呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬新型鴨呼腸孤病毒(Novel duck reovirus, NDRV)引起的各種品種鴨的一種以肝臟不規(guī)則壞死和出血混雜為主要特征的疫病。不同品種鴨均易感，日齡愈小或并發(fā)感染時其發(fā)病率死亡率愈高，以5 10日齡居多，病程5 7d，發(fā)病率5% 20%、死亡率2% 15%。該痛在我國南方水禽飼養(yǎng)區(qū)廣泛流行，疫區(qū)有逐年擴大的趨勢，給水禽養(yǎng)殖業(yè)造成一定的經(jīng)濟損失。 NDRV的代表株為NP03分離株，其S3基因的序列特征在于根據(jù)DNAStar5. 0軟件包中MegAlign基因序列比較分析軟件的Clustal W算法,所述的NDRVNP03分離株S3基因(GenBank 登錄號GQ888710)與番鴨呼腸孤病毒(Muscovy duck reovirus, MDRV) 89330 株S3 基因(GenBank 登錄號AJ243881)、禽呼腸孤病毒(Avain reovirus, ARV) 176 株 S3 基因(GenBank登錄號AF059720)編碼區(qū)核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列分別為68. 0%，66. 1% ；70. 4%,69. 3%。目前，除了血清中和試驗可用于檢測新型鴨呼腸孤病毒病抗體外，尚無其它檢測方法，雖然中和試驗是抗體檢測的經(jīng)典方法，特異性好，但操作煩瑣，不適于獸醫(yī)臨床及基層應(yīng)用。另外，利用NDRV全病毒作為診斷抗原時,會與抗番鴨呼腸孤病毒(Muscovy duckreovirus, MDRV)的血清樣品產(chǎn)生非特異性交叉反應(yīng)。利用原核表達系統(tǒng)表達外源蛋白是一種簡便和高效的方法。原核表達系統(tǒng)生產(chǎn)的一些基因工程蛋白可保持必要的抗原性，能夠用于病毒感染抗體的檢測。研究表明，新型鴨呼腸孤病毒oB蛋白即屬于此類蛋白，因此應(yīng)用基因工程O B蛋白作為抗原，能夠建立檢測方法用以鑒別NDRV、MDRV全病毒感染的血清抗體，這將為應(yīng)用基因工程疫苗預(yù)防和控制NDRV提供重要的技術(shù)支撐。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供新型鴨呼腸孤病毒重組0 B蛋白抗原的制備及其在檢測新型鴨呼腸孤病毒病抗體中的應(yīng)用；本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的新型鴨呼腸孤病毒重組0 B蛋白抗原，該重組原核表達抗原為His前導(dǎo)肽與S3基因編碼OB蛋白的融合蛋白；該新型鴨呼腸孤病毒O B重組蛋白抗原的制備方法是a、設(shè)計擴增NDRV NP03分離株S3基因的特異性引物b、NDRV NP03分離株培養(yǎng)及RNA提取c、NDRV NP03 分離株 S3 基因的 RT-PCR
d、原核表達載體 pET-30a-C(+)_NP03- o B 的構(gòu)建e、NDRV o B蛋白的誘導(dǎo)表達f、重組蛋白的純化g、重組O B蛋白純化后的復(fù)性h、純化后重組O B蛋白含量的測定i、重組O B蛋白活性的Western-blot檢測將上述重組蛋白應(yīng)用在間接ELISA檢測鴨血清抗NDRV抗體。本發(fā)明以新型鴨呼腸孤病毒(NDRV)RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)擴增獲得NDRV S3基因編碼區(qū)核苷酸全序列，并定向亞克隆至大腸桿菌原核表達載體pET-30a-C(+)融合表達載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)宿主細胞后用IPTG誘導(dǎo)表達，經(jīng)Ni-NTAAgarose純化，包涵體復(fù)性，獲得表達的NDRV o B重組蛋白抗原。該蛋白的表達形式是融合蛋白(His-O B)，分子量約為44kU;經(jīng)免疫印跡(Western-blot)檢測表明該蛋白具有與天然蛋白相似的免疫反應(yīng)活性。本發(fā)明提供一種檢測新型鴨呼腸孤病毒病抗體時無散毒危險、穩(wěn)定性好，靈敏度高、可實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)、成本低的原核表達抗原及其制備方法。應(yīng)用該表達蛋白為包被抗原的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)可檢測鴨血清中的抗NDRV抗體。本發(fā)明的優(yōu)點①由于該檢測抗原是NDRV重組原核表達的0 B蛋白，并非全病毒，因此應(yīng)用該抗原進行檢測時絕無散毒危險。②可用于鑒別NDRV、MDRV全病毒感染的血清抗體。③作為間接ELISA抗原檢測新型鴨呼腸孤病毒病抗體，其檢測敏感性高，特異性強，無交叉反應(yīng)。④生產(chǎn)工藝先進、性能穩(wěn)定、生產(chǎn)成本低，產(chǎn)品付加值高，適合工廠化生產(chǎn)，市場應(yīng)用前景廣。


圖I 是 pET-30a-C(+)_NP03- o B 表達載體構(gòu)建圖，(NP03-S3代表插入到載體pET_30a_C (+)中的NDRV NP03分離株S3基因)。圖2是NDRV NP03分離株S3基因RT-PCR擴增產(chǎn)物及重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果圖；(其中I :NDRV NP03株S3基因RT-PCR擴增產(chǎn)物；2 NDRV NP03株S3基因重組表達質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果；M DNA marker DL2000)。圖3是pET-30a_C (+) -NP03- o B原核表達質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果圖；(其中I.pET-30a-C(+)_NP03- o B原核表達質(zhì)粒雙酶切鑒定；2. DNA MarkerDLlOOOO)。圖4是pET-30a_C (+) -NP03- o B原核表達質(zhì)粒IPTG誘導(dǎo)表達SDS-PAGE分析結(jié)果。(其中I代表沒有加入誘導(dǎo)劑IPTG所取的樣品。2代表加入誘導(dǎo)劑IPTG后8小時所取樣品。M.蛋白 Marker)。圖5 pET-30a-C(+)-NP03_o B重組蛋白免疫印跡結(jié)果。(蛋白印跡所用的一抗為NDRV多克隆陽性番鴨血清，二抗為HRP標記的兔抗鴨IgG多克隆抗體。HRP的顯色底物為DAB。)
具體實施方式
、
以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進一步說明。(但不是對本發(fā)明的限制)。 I、設(shè)計擴增NDRV NP03分離株S3基因的特異性引物NDRV-NP03-S3F(上游引物)5’ -TGCAAGGATCCATGGAGGTGCGTGTGCC-3’NDRV-NP03-S3R (下游引物)5 ’ -ACCCAGGTCGACTTACCACCTAC-3 ’2、NDRV NP03分離株培養(yǎng)及RNA提取取NDRV NP03分離株種毒經(jīng)尿囊腔途徑接種于12日齡非免疫番鴨胚，37°C溫箱孵育，收集48h-72h之間番鴨胚尿囊液，離心后取上清備用。NDR VRNA提取按Trizol試劑盒說明書進行；提取的RNA用于RT-PCR。3、NDRV NP03 分離株 S3 基因的 RT-PCR (I)NDRV NPO3 的反轉(zhuǎn)錄在PCR反應(yīng)管中分別加入7 ii L已制備的RNA，加入I y LNDRV-NP03-S3下游引物(20pmol), 70°C熱吸附 IOmin,冰浴 IOmin,繼續(xù)加入 5 XFirst Standing Buffer4 u L, IOmMdNTPs 2u L,0. 5u L 反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV) 5u (單位)/ y L，0. 25 u LRNA 酶抑制劑(40u)，用無RNA酶水調(diào)至總體積20uL，瞬時離心混勻。反應(yīng)程序30°C 10min,37°C 60min,99°C 5min。(2) NDRV NP03 S3 基因的 PCRPCR反應(yīng)體系(50 U L體系)以制備好的cDNA 2 U L作模版，加入相應(yīng)的上、下游引物(20pmol)各 I u L, 2. 5mM dNTPs4 u L, IOXBuffer 5 u L, rTaql u L,滅菌水 36 u L,反應(yīng)體系50ii L。在PCR擴增儀內(nèi)進行擴增，擴增條件為95°C 5min，94°C lmin，53°C lmin，72°C 2min，35個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin結(jié)束。4、原核表達載體 pET-30a-C(+)_NP03- o B 的構(gòu)建(I)PCR產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒回收目的片段，利用T-A克隆直接連接于pMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coil JM109感受態(tài)細胞，挑取單克隆，進行PCR鑒定。(2)以PCR鑒定正確的陽性克隆再進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒進行純化后，經(jīng)BamHI、SalI雙酶切，回收目的片段并亞克隆于表達質(zhì)粒pET-30a_C(+)的BamHI和Sal I酶切位點之間，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-30a-C(+)-NP03-o B，轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主菌JM109，提取重組質(zhì)粒進行PCR、雙酶切鑒定和序列測定。5、NDRV o B蛋白的誘導(dǎo)表達將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)宿主菌，挑取單克隆接種于5mL(含IOOug/mL卡那霉素)的LB培養(yǎng)基中，37°C 170r/min培養(yǎng)過夜。取0. 5mL接種于5mL LB培養(yǎng)基中，37°C 220r/min培養(yǎng)至OD6J). 4 0. 6時，加入IPTG至終濃度0. ImmoL/L,在37°C下培養(yǎng)8h，收集菌體，以6000g離心2min，去上清液，將沉淀用PBS洗滌I次，再以6000g離心2min，去上清液，ImLPBS重懸，超聲裂解，4°C 12000g離心30min，分別取一定量的上清以及用PBS重懸的沉淀，加入等體積的2 X SDS上樣緩沖液，混勻后，于沸水中煮沸5min，做為SDS-PAGE電泳上樣樣品。以誘導(dǎo)含空質(zhì)粒pET-30a-C (+)的BL21 (DE) 3作對照。采用12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，考馬斯亮蘭染色，觀察結(jié)果。結(jié)果在含有pET-30a-C(+) -NP03- o B質(zhì)粒的大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)后表達了約44kU的融合蛋白，而對照細菌沒有相應(yīng)的條帶。薄層掃描分析，該蛋白可占菌體蛋白總量的35-40%。6、重組蛋白的純化(I)待純化樣品的制備
按已經(jīng)優(yōu)化的表達條件，表達NDRV NP03分離株重組O B蛋白菌液1000ml，收獲菌液 4°C,以 8000rpm/min,離心 20min,菌體沉淀用 TE (IOmM Tris-HCl, ImMEDTA, pH8. 0)洗漆
3次，沉淀用TE溶液重懸起來；裂解菌體獲取包涵體沉淀對菌體進行超聲波破碎，超聲處理必須于冰浴條件下進行。超聲條件800W，工作10S，間隔10S，重復(fù)一定次數(shù)，以4°C，IOOOOrpm離心IOmin,棄上清，沉淀即為包涵體；
包涵體的裂解及可溶性蛋白的回收獲得的不溶性包涵體用包涵體洗滌液(20mMTris-HCl [pH8. 0]，5mM EDTA, 2M尿素)洗滌2次，將該包涵體沉淀溶解于含8M尿素Tris-HCl緩沖液，置于冰上2h，然后4°C過夜，以12000rpm，4°C離心20min，除去不溶性沉淀，取上清即為可溶性包涵體蛋白，經(jīng)0. 45 y m孔徑小過濾器過濾，_80°C凍存?zhèn)溆茫?2)重組O B蛋白的親合層析純化①用25ml新鮮配制的預(yù)冷結(jié)合緩沖液(20mM Tris-HCl [pH7. 9]，IOmM咪唑，0. 5MNaCl，8M尿素)沖洗并平衡His鎳柱；②IOml可溶性包涵體蛋白溶液(再經(jīng)0. 22 ii m過濾孔徑小過濾器過濾)重懸平衡后的His蛋白純化介質(zhì)，置于50ml潔凈離心管中，室溫充分感作30min，然后重新上柱，棄掉流出液,流速為10倍柱體積/小時(柱體積，即樹脂純化柱的體積,2ml，以下均同)；③使用15倍柱體積的結(jié)合緩沖液(含8M尿素)沖洗柱子，收集流穿峰；④使用3倍柱體積的新鮮配制的洗脫緩沖液(20mM Tris-HCl [pH7. 9]，0. 5M咪唑，0. 5M NaCl，8M尿素)洗脫，收集洗脫峰，按500 yl量分裝于潔凈Eppendorf管內(nèi)。⑤純化柱的再生與保存依次使用8倍體積的結(jié)合緩沖液和5倍柱體積的自備去離子水洗滌后，用3倍柱體積的自備20%乙醇平衡(乙醇要將介質(zhì)浸沉)，4°C保存。7、重組O B蛋白純化后的復(fù)性將純化好的表達蛋白(含SM尿素)裝入按常規(guī)方法處理好的透析袋(截留分子量14000Da)后，置于 TGE 透析液(50mmol/L Tr i s-HC 1,0. 5mmo I /LEDTA, 50mmo I /LNac I,10%甘油，1%甘氨酸，pH 8.0)中，4°C條件下反復(fù)透析，8小時換一次透析液，換液三次。透析后用蔗糖粉末覆蓋于透析袋表面對蛋白溶液進行濃縮，濃縮至原體積的1/4。將所得復(fù)性純化蛋白_80°C凍存?zhèn)溆谩?、純化后重組O B蛋白含量的測定采用紫外線吸收法定量蛋白質(zhì)。將待檢樣品適當稀釋后，同時以BioPhotometer分光光度計(Eppendorf)Bradford法測定該蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭G250結(jié)合反應(yīng)后,產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm處的OD值，同時用考馬斯亮蘭G250作為空白對照，顯示蛋白含量。NDRV- 0 B/His純化蛋白的質(zhì)量濃度為彡I. Omg/ml。9、重組0 8蛋白活性的恥8七6111-131(^檢測將復(fù)性純化好的重組0 B蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC)上，用含有3% (w/v)BSA的TBS (pH = 8. 0)4°C孵育過夜封閉NC膜；用TTBS在搖床溫和震蕩洗3次，每次間隔lOmin，再加入用含有1% (w/v)BSA稀釋(I 100)的NDRV多克隆番鴨血清，室溫搖床溫和作用90min ；TTBS在搖床溫和震蕩洗3次，再加入用含有1% (w/v)BSA稀釋(I 1500)的HRP標記的兔抗鴨IgG 二抗，室溫搖床溫和作用60min ；TTBS在搖床溫和震蕩洗3次，吸靜余液，置于DAB顯色液中顯色，結(jié)果在約44kU處觀察到了特異性的反應(yīng)條帶。10、重組O B蛋白在間接ELISA方法中的應(yīng)用將復(fù)性純化好的重組O B蛋白用pH9. 6的碳酸鹽包被緩沖液稀釋后包被酶標反應(yīng)板，濃度Iu g/mL，每孔50iiL，4°C過夜；次日取出ELISA反應(yīng)板，用洗液(含有0.5%TWEEN-20的pH7. 4的PBS)洗滌三次，每次3min，拋干；用含I % BSA的PBST封閉，每孔180 u L，置于37°C孵育Ih ；同法洗三次；將待檢血清(NDRV陽性血清、MDRV陽性血清與非免疫健康番鴨陰性血清)分別用含1% BSA的PBST作I : 40稀釋后加入孔中，置于37°C孵育Ih后，同法洗滌三次；加辣根過氧化物(HRP)標記的山羊抗鴨IgG 二抗，以I : 500稀釋，每孔50ii L,加入各孔,置于37°C孵育Ih ;同法沖洗三次；然后加入用20ml去離子水溶解的FAST OPD顯色，每孔50 u L，置于37°C 10_15min ;最后每孔加入25 y L的2M硫酸終止反應(yīng)；酶標檢測儀讀數(shù)在490nm波長下讀取各孔的光密度值，P/N ^ 2時判定為NDRV抗體陽性。結(jié)果重組表達的O B蛋白僅與待檢NDRV陽性血清反應(yīng)，而與MDRV陽性血清、非免疫番鴨陰性血清均不發(fā)生交叉反應(yīng)。 SEQ ID NO. I 的信息(a) NDRV S3 序列特征全基因長度1202個堿基類型核酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)最初來源新型鴨呼腸孤病毒(d)序列描述SEQ ID NO I SEQ ID NO. IGCTTTTTGAGTCCTCAGCGTGCAAGCCGCAATGGAGGTGCGTGTGCCAAACTTTCACTCCTTTATTGAGGGTATTACTACTAGTTACTTGCGGTCTCCTGCTTGCTGGAATTCGAAGACGTTATGGGATATTGAAGAGTTTCACACACCTGACGTTATCAGGGTCGGCAACGCTTACTGTTGCACTCAGTGCTGTGGTGTTCTGTACTATGGTGCCCCTCCCTCTGATGGTAACTGTTTTCCACATCACAAGTGTCATCAACAGCAATATCGTACTGAGACTCCGCTCATGAGATATATTAAGGTGGGTCGCACTACAGAGCAACTACTTGATCAATATGCCGTTGCTCTGCATGTCATTGCAGATTACTATGATGAGGCGAGTAAGCGACCTCAGGATATCGCTGAAACTGAGTCAATCGCACCATTTGATATCGTAACCAGGACTGAATCTATTCGCAGTGACCGTGCCGTTGACCCGGAGTTCTGGACTTATCCGTTGGAGAGACGAGGATACGACGCGCGACATGAGATTGCTAGAGCGGGTTGGAAGATGATAGATGCTTCATCGCGAAGTCACACTCTTCCTGACTGTCTGGTGTCAAATATGCTCCATACTAGGCATGTCTTCAGCCAAATGTTAACCACGACAACCATCTATGATGTCGCTGTCACGGGTAAAGCTGTTAAATTCAGCCCGATGTTAGTAACCATGCCAACTCGAGGAGATGGTGCTGTGGCTCTGTCAAGAGGTAACTTGGATCATGATGTCGAGGACTGTTGGATGAATGGTTTTGCATTCTCCCCTATCATCGGCGGTGTTGGCATCACTGGTCAATTTGAGCGTGGTTCCTACCATAATTTTGGACACCCCATGGTTGGGAGTGGTAAGAAAGCTTCTCACTACCGCAATTTGTTCATGGAGTCCTGGCGTGGATGGTCAAAGTCG TGCTTTACATGTGCTGCAGGATGGAGCCCGCCGAGTGCGAATCTAGGCTGCGAGGCCATGCCAGAACTATGTTCGGACGTTCTCTTCCGGATATCTGTGACTTCGAGGAGACTACCCACGTTGGCCAGTCGTCCGCGCCATTAAAGAAGGCCACGAAATTGTCCTTCCTGGAGTGTAGGTGGTAAGCACCTCTGGGTCAAAATGCACATAGGCTCCCACCTATGTGACGGTTAGCGGGACTCGCCTATTCATC
SEQ ID NO. 2 的信息(a) NDRV S3編碼區(qū)序列特征編碼區(qū)長度1104個堿基類型核酸鏈型單鏈拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)最初來源新型鴨呼腸孤病毒(d)序列描述SEQ ID NO. 2 SEQ ID NO. 權(quán)利要求
1.新型鴨呼腸孤病毒重組oB蛋白抗原，其特征是該重組原核表達抗原為His前導(dǎo)肽與S3基因編碼oB蛋白的融合蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的新型鴨呼腸孤病毒oB重組蛋白抗原的制備方法，其特征是 a、設(shè)計擴增NDRVNP03分離株S3基因的特異性引物 NDRV-NP03-S3F(上游引物)5’ -TGCAAGGATCCATGGAGGTGCGTGTGCC-3’ NDRV-NP03-S3R(下游引物)5’ -ACCCAGGTCGACTTACCACCTAC-3’ b、NDRVNP03分離株培養(yǎng)及RNA提取 取NDRV NP03分離株種毒經(jīng)尿囊腔途徑接種于12日齡非免疫番鴨胚，37°C溫箱孵育，收集48h-72h之間番鴨胚尿囊液，離心后取上清備用；NDRV RNA提取按Trizol試劑盒說明書進行；提取的RNA用于RT-PCR ； c、NDRVNP03 分離株 S3 基因的 RT-PCR (1)NDRVNP03的反轉(zhuǎn)錄 在PCR反應(yīng)管中分別加入7 ii L已制備的RNA，加入I y LNDRV-NP03-S3下游引物(20pmol), 70°C熱吸附 IOmin,冰浴 IOmin,繼續(xù)加入 5 XFirst Standing Buffer4 u L, IOmMdNTPs L，0. L 反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV) 5u (單位)/ y L，0. 25 y LRNA 酶抑制劑(40u)，用無RNA酶7水調(diào)至總體積20uL，瞬時離心混勻；反應(yīng)程序30°C IOmin, 37°C 60min, 99°C 5min ；(2)NDRV NP03 S3 基因的 PCR PCR反應(yīng)體系(50 UL體系)以制備好的cDNA2 UL作模版，加入相應(yīng)的上、下游引物(20pmol)各 I u L, 2. 5mM dNTPs4 u L, 10 X Buffer 5 u L, rTaql u L,滅菌水 36 u L,反應(yīng)體系.50 u L ;在 PCR 擴增儀內(nèi)進行擴增，擴增條件為 950C 5min，94°C lmin,53°C lmin,72°C 2min,35個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin結(jié)束； d、原核表達載體pET-30a-C(+)-NP03-o B的構(gòu)建 (1)PCR產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒回收目的片段，利用T-A克隆直接連接于pMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coil JM109感受態(tài)細胞，挑取單克隆，進行PCR鑒定； (2)以PCR鑒定正確的陽性克隆再進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒進行純化后，經(jīng)BamH I、Sal I雙酶切，回收目的片段并亞克隆于表達質(zhì)粒pET-30a_C(+)的BamHI和Sal I酶切位點之間，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-30a-C(+)-NP03-o B，轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主菌JM109，提取重組質(zhì)粒進行PCR、雙酶切鑒定和序列測定。
e、NDRVO B蛋白的誘導(dǎo)表達 將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)宿主菌，挑取單克隆接種于5mL(含100ug/mL卡那霉素)的LB培養(yǎng)基中，37°C 170r/min培養(yǎng)過夜；取0. 5mL接種于5mL LB培養(yǎng)基中，370C 220r/min培養(yǎng)至OD6J). 4 0. 6時，加入IPTG至終濃度0. ImmoL/L,在37°C下培養(yǎng)8h，收集菌體，以6000g離心2min，去上清液，將沉淀用PBS洗滌I次，再以6000g離心2min，去上清液，ImL PBS重懸，超聲裂解，4°C 12000g離心30min，分別取一定量的上清以及用PBS重懸的沉淀，加入等體積的2 X SDS上樣緩沖液，混勻后，于沸水中煮沸5min，做為SDS-PAGE電泳上樣樣品；以誘導(dǎo)含空質(zhì)粒pET-30a-C(+)的BL21 (DE) 3作對照； f、重組蛋白的純化 (I)待純化樣品的制備按已經(jīng)優(yōu)化的表達條件，表達NDRV NP03分離株重組O B蛋白菌液1000ml，收獲菌液4°C,以 8000rpm/min,離心 20min,菌體沉淀用 TE (IOmM Tris-HCl, ImMEDTA, pH8. 0)洗漆 3次，沉淀用TE溶液重懸起來； 裂解菌體獲取包涵體沉淀對菌體進行超聲波破碎，超聲處理必須于冰浴條件下進行；超聲條件800W，工作10S，間隔10S，重復(fù)一定次數(shù)，以4°C，IOOOOrpm離心lOmin，棄上清，沉淀即為包涵體； 包涵體的裂解及可溶性蛋白的回收獲得的不溶性包涵體用包涵體洗滌液(20mMTris-HCl [pH8. 0]，5mM EDTA, 2M尿素)洗滌2次，將該包涵體沉淀溶解于含8M尿素Tris-HCl緩沖液，置于冰上2h，然后4°C過夜，以12000rpm，4°C離心20min，除去不溶性沉淀，取上清即為可溶性包涵體蛋白，經(jīng)0. 45 y m孔徑小過濾器過濾，-80°C凍存?zhèn)溆茫? (2)重組O B蛋白的親合層析純化 ①用25ml新鮮配制的預(yù)冷結(jié)合緩沖液(20mMTris-HCl [pH7. 9]，IOmM咪唑，0. 5MNaCl,8M尿素)沖洗并平衡His鎳柱； ②IOml可溶性包涵體蛋白溶液(再經(jīng)0.22 y m過濾孔徑小過濾器過濾)重懸平衡后的His蛋白純化介質(zhì)，置于50ml潔凈離心管中，室溫充分感作30min，然后重新上柱，棄掉流出液，流速為10倍柱體積/小時(柱體積，即樹脂純化柱的體積,2ml，以下均同)； ③使用15倍柱體積的結(jié)合緩沖液(含SM尿素)沖洗柱子，收集流穿峰； ④使用3倍柱體積的新鮮配制的洗脫緩沖液(20mMTris-HCl [pH7. 9]，0. 5M咪唑，0. 5MNaCl, 8M尿素)洗脫,收集洗脫峰,按500 ii I量分裝于潔凈Eppendorf管內(nèi)； ⑤純化柱的再生與保存依次使用8倍體積的結(jié)合緩沖液和5倍柱體積的自備去離子水洗滌后，用3倍柱體積的自備20%乙醇平衡(乙醇要將介質(zhì)浸沉)，4°C保存； g、重組OB蛋白純化后的復(fù)性 將純化好的表達蛋白(含8M尿素)裝入按常規(guī)方法處理好的透析袋(截留分子量14000Da)后，置于 TGE 透析液(50mmol/L Tris-HCl, 0. 5mmol/LEDTA，50mmol/LNacl，10% 甘油，1%甘氨酸，pH 8. 0)中，4°C條件下反復(fù)透析，8小時換一次透析液，換液三次；透析后用蔗糖粉末覆蓋于透析袋表面對蛋白溶液進行濃縮，濃縮至原體積的1/4 ;即為純化的重組NDRVo B蛋白，-80°C凍存?zhèn)溆茫? h、純化后重組0B蛋白含量的測定 采用紫外線吸收法定量蛋白質(zhì)。將待檢樣品適當稀釋后，同時以BioPhotometer分光光度計(Eppendorf)Bradford法測定該蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭G250結(jié)合反應(yīng)后，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm處的OD值，同時用考馬斯亮蘭G250作為空白對照，顯示蛋白含量；NDRV- O B/His純化蛋白的質(zhì)量濃度為彡I. Omg/ml ； i、重組OB蛋白活性的Western-blot檢測 將復(fù)性純化好的重組O B蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC)上，用含有3% (w/v)BSA的TBS(pH = 8. 0)4°C孵育過夜封閉NC膜；用TTBS在搖床溫和震蕩洗3次，每次間隔lOmin，再加入用含有1% (w/v)BSA稀釋(I 100)的NDRV多克隆番鴨血清， 室溫搖床溫和作用90min ；TTBS在搖床溫和震蕩洗3次，再加入用含有I % (w/v)BSA稀釋(I 1500)的HRP標記的兔抗鴨IgG 二抗，室溫搖床溫和作用60min ;TTBS在搖床溫和震蕩洗3次，吸靜余液，置于DAB顯色液中顯色，結(jié)果在約44kU處觀察到了特異性的反應(yīng)條帶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的新型鴨呼腸孤病毒oB重組蛋白抗原的制備方法制備的新型鴨呼腸孤病毒0 B重組蛋白在間接ELISA檢測抗新型鴨呼腸孤病毒病抗體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了新型鴨呼腸孤病毒重組σB蛋白抗原的制備及其在檢測新型鴨呼腸孤病毒病抗體中的應(yīng)用，本發(fā)明以新型鴨呼腸孤病毒(NDRV)RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)擴增獲得NDRV S3基因編碼區(qū)核苷酸全序列，并定向亞克隆至大腸桿菌原核表達載體pET-30a-C(+)融合表達載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)宿主細胞后用IPTG誘導(dǎo)表達，經(jīng)Ni-NTA Agarose純化，包涵體復(fù)性，獲得表達的NDRVσB重組蛋白抗原。該蛋白的表達形式是融合蛋白(His-σB)，分子量約為44kU；經(jīng)免疫印跡檢測表明該蛋白具有與天然蛋白相似的免疫反應(yīng)活性。
文檔編號C12N15/46GK102675469SQ20121006173
公開日2012年9月19日 申請日期2012年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月8日
發(fā)明者朱小麗, 李兆龍, 林鋒強, 王劭, 程曉霞, 陳仕龍, 陳少鶯 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所