專利名稱：草魚呼腸孤病毒快速檢測試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及養(yǎng)殖病害病原檢測技術(shù)的改進，具體講是一種草魚呼腸孤病毒 (Grass carp reovirus, GCRV)快速檢測試紙，屬于檢測試紙結(jié)構(gòu)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
草魚呼腸孤病毒病是草魚養(yǎng)殖中危害嚴(yán)重的疾病之一，導(dǎo)致很高的草魚死亡率， 可達70-80 %的死亡率，給草魚養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。該病毒引起的疾病又稱為草魚出血病，其出血癥狀常與細菌引起的出血很難鑒別，又鑒于草魚出血病尚無有效的治療方法， 因而簡便、快速的檢測方法尤顯重要，以期達到早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防的目的?？焖贉?zhǔn)確的病毒分離檢測技術(shù)已成為學(xué)者研究的焦點之一。目前，病毒性草魚出血病的診斷主要是依靠實驗室內(nèi)對草魚呼腸孤病毒檢測來確診，現(xiàn)實驗室檢測方法有葡萄球菌A蛋白協(xié)同凝集試驗(楊廣智1991)；酶聯(lián)免疫吸附檢測法(江育林1993)；熒光抗體技術(shù)檢測法(江育林1993)；斑點免疫印跡檢測法(邵健忠 1996)；免疫吸附電鏡觀察法(袁愛華1990)；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(王鐵輝1997)等。 這些方法，操作程式較為復(fù)雜，需要一定的實驗室儀器設(shè)備，且耗時較長，整個過程需要幾個乃至十幾個小時，達不到快速檢測的目的。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法靈敏度高，可用于無癥狀病魚的檢測，但其高靈敏度易導(dǎo)致假陽性結(jié)果；酶聯(lián)免疫吸附檢測法及斑點免疫印跡檢測法，是目前常用的檢測方法，但被檢組織的內(nèi)源酶可以對其檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。因此一種適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害病原的快速、準(zhǔn)確、簡便、快速、無假陽性的檢測方法的研制勢在必行，以期達到早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防的目的。
發(fā)明內(nèi)容本實用新型針對草魚呼腸孤病毒病嚴(yán)重危害草魚養(yǎng)殖業(yè)的現(xiàn)狀，針對水生生物生理特點，設(shè)計提供一種能夠達到快速、簡便、準(zhǔn)確檢測目的的草魚呼腸孤病毒快速檢測試紙。本實用新型的技術(shù)方案實現(xiàn)如下草魚呼腸孤病毒快速檢測試紙，包括適當(dāng)尺寸的不干膠載體板7，特殊之處在于在該載體板的中間部設(shè)有由硝酸纖維膜制成的檢測層5，檢測層5上粘貼包被有草魚呼腸孤病毒單抗D液的檢測線3及羊抗小鼠IgG的質(zhì)控線4，與檢測層5相延續(xù)的兩端分別設(shè)置有由吸水紙構(gòu)成的加樣端吸水層1和手持端吸水層6，在檢測層5的檢測線3的遠端與加樣端吸水層1交界處，設(shè)有載有金標(biāo)單抗C的玻璃纖維膜2，該膜一端部分設(shè)置在加樣端吸水層 1之下，其另一端部分設(shè)置在檢測層5之上。本實用新型草魚呼腸孤病毒快速檢測試紙的檢測原理將草魚呼腸孤病毒快速檢測試紙的加樣端吸水層插入或在其上滴加由磷酸鹽緩沖液從搗碎的草魚腎臟提取含有病毒粒子的檢測樣品，根據(jù)夾心免疫層析原理，即由金標(biāo)單抗C同檢測樣品液中的抗原反應(yīng)，形成由金標(biāo)單抗C-草魚呼腸孤病毒復(fù)合物，當(dāng)該復(fù)合物層析至硝酸纖維素膜上預(yù)先包被在檢測線上的單抗D處時，此處的抗體會識別該復(fù)合物中抗原，反應(yīng)的結(jié)果便形成了金標(biāo)單抗C+草魚呼腸孤病毒抗原+單抗D的夾心結(jié)構(gòu)，最終是單抗C上標(biāo)記的膠體金顆粒在此固定并累積出現(xiàn)肉眼可見的紅色線，未反應(yīng)的金標(biāo)單抗 C則仍繼續(xù)層析前行，當(dāng)?shù)竭_點預(yù)先包被在質(zhì)控線羊抗鼠IgG處時，抗體類型為IgG的金標(biāo)單抗C被其結(jié)合住，從而在此處也出現(xiàn)由膠體金顆粒固定并累積而顯現(xiàn)出肉眼可見的紅色線，結(jié)果是檢測線顯示紅色表示草魚呼腸孤病毒陽性；檢測線不顯示紅色，表示草魚呼腸孤病毒陰性，即檢測樣品中不含草魚呼腸孤病毒或是草魚呼腸孤病毒含量極低。質(zhì)控線顯示紅色，表示試紙有效；質(zhì)控線處不顯示紅色，說明試紙失效，即或是金標(biāo)抗體C、或是羊抗鼠IgG失活，檢測結(jié)果無效。本實用新型具有以下優(yōu)點1、本實用新型的草魚呼腸孤病毒快速檢測試紙，從實際的養(yǎng)殖需要出發(fā)，使用時無需專門設(shè)施和操作技術(shù)，適合普通養(yǎng)殖戶池邊檢測，應(yīng)用簡單，具有檢測快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏等特點，并具有較高的穩(wěn)定性；2、本實用新型的草魚呼腸孤病毒快速檢測試紙使用方法中，無需加入特殊的裂解液；只需將草魚腎臟搗碎即可，與傳統(tǒng)病毒提取研磨、離心等方法相比，此方法方便簡單，可快速提取病毒檢測。

圖1 本實用新型草魚呼腸孤病毒快速檢測試紙的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2 本實用新型草魚呼腸孤病毒快速檢測試紙的檢測結(jié)果示意圖。雜交瘤細胞株GCRV-C，其保藏編號為CCTCC-C201103 ；保藏單位全稱及簡稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)；保藏單位地址湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心；保藏日期2011年1月17日。雜交瘤細胞株GCRV-D，其保藏編號為CCTCC-C201104 ；保藏單位全稱及簡稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)；保藏單位地址湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心；保藏日期2011年1月17日。
具體實施方式
本實用新型的實施例結(jié)合附圖進一步描述如下實施例1.參見圖1，2本實施例草魚呼腸孤病毒快速檢測試紙，其包括保藏號為 CCTCC-C201103雜交瘤細胞所分泌的抗草魚呼腸孤病毒、膠體金標(biāo)記的單克隆抗體C(簡稱金標(biāo)單抗C)；保藏號為CCTCC-C201104雜交瘤細胞所分泌的抗草魚呼腸孤病毒的單克隆抗體D (簡稱單抗D)和羊抗小鼠IgG ；包被有單抗D和羊抗小鼠IgG的硝酸纖維膜；載有金標(biāo)單抗C的玻璃纖維膜2 ；帶有不干膠的載體板7 (加樣端為A，手持端為B)。在帶有不干膠的載體板7的中間部，粘貼包被有單抗D(又稱檢測線幻和羊抗小鼠IgG(又稱質(zhì)控線4)的硝酸纖維膜為檢測層5 ；與該層相延續(xù)的兩端設(shè)置吸水紙分別構(gòu)成加樣端吸水層 1和手持端吸水層6 ；在檢測層5的檢測線3的遠端與加樣端吸水層1交界處，設(shè)有載有金標(biāo)單抗C的玻璃纖維膜2，該膜一端部分設(shè)置在加樣端吸水層1之下，其另一端部分設(shè)置在檢測層5之上。所述的單抗C膠體金標(biāo)記方法為(1)膠體金的制備10-20nm膠體金顆粒制備，將0.01%氯金酸溶液IOOOml與 0. 1 %檸檬酸鈉25-Mml混合，加熱至100攝氏度，制成膠體金溶液，該溶液的pH值用 0.2%碳酸鉀調(diào)至8. 0-8. 4，備用；(2)金標(biāo)單抗C的制備單抗C濃度為3_5g/L時，IOOml膠體金標(biāo)記的最適單抗量為120-150 μ 1;按此比例將單抗C加入到膠體金溶液中，慢攪50-60分鐘，加入牛血清白蛋白，4°C過夜; 然后將其在4°C下，17000g離心110-120分鐘；取離心沉淀，用含有牛血清白蛋白和 0. 3-3 % 吐溫-20 的 0. 01mol/L 磷酸鹽緩沖液(KCL 0. 2g，NaCL8. 0g, KH2PO4O. 2g， Na2HPO412H20 2. 9g，蒸餾水1000ml，pH 7.4)懸起，再加疊氮鈉將濃度調(diào)至0. 01-0. 03%，即制成金標(biāo)單抗C。載有金標(biāo)單抗C的玻璃纖維層塊的制備將制成的金標(biāo)單抗C，按每平方厘米 700-1000 μ 1噴在玻璃纖維膜上，冷凍干燥，4°C保存?zhèn)溆?。本實施例的草魚呼腸孤病毒快速檢測試紙檢測層制備方法辛酸-硫酸銨法提純的抗草魚呼腸孤病毒單抗D冷凍干燥后，制備成3-5mg/ml抗草魚呼腸孤病毒單抗D液，用劃線機將其劃于硝酸纖維素膜上，形成檢測線3 ；同樣，將羊抗小鼠IgG，制備成l-2mg/ml， 用劃線機將其劃于硝酸纖維素膜上，形成質(zhì)控線4。兩線相距4-6mm，質(zhì)控線4近手持端吸水層6，檢測線3近加樣端吸水層1，36-37 0C烘干。本實施例分別分泌單抗C和D的兩株雜交瘤細胞，其制備與選擇的方法如下(1)利用草魚腎細胞系體外擴增草魚呼腸孤病毒，利用超速離心法純化病毒。(2)用提純的草魚呼腸孤病毒液為抗原，免疫Balb/c小白鼠；(3)將免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞的融合，培養(yǎng)得450株雜交瘤細胞；(4)采用間接免疫熒光法篩選出抗草魚呼腸孤病毒的陽性雜交瘤細胞株；(5)采用有限稀釋法對其中20株陽性雜交瘤細胞進行了克隆；(6)通過不同模式金標(biāo)免疫層析方法選出2株不同的抗草魚呼腸孤病毒的單抗C 和D，分別作為金標(biāo)單抗與包被檢測線單抗。其具體實驗方法為通過間接免疫熒光法選出抗病毒強陽性的5種單抗，單抗C、單抗E、單抗A、單抗B以及單抗D，金標(biāo)單抗C與分別以同濃度、同體積的這5種單抗為包被抗體，同時檢測同一草魚呼腸孤病毒樣本，結(jié)果單抗D 為包被抗體時，效果最佳(見表1)。因而，選擇單抗C作為金標(biāo)單抗，而單抗D為包被檢測線的單抗。表1不同模式檢測草魚呼腸孤病毒的金標(biāo)免疫層析結(jié)果
包被單抗單抗C 單抗E 單抗A單抗B 單抗D金標(biāo)免疫層析結(jié)果+ + ++ . ++注++表示檢測線顯紫紅色為較強陽性；+表示檢測線顯紅色為陽性；本實施例的草魚呼腸孤病毒快速檢測試紙的使用方法，即草魚呼腸孤病毒的檢測步驟取草魚腎臟放入離心管中充分搗碎，按質(zhì)量/體積比1 (5-10)(g/ml)加入 0.01mol/L pH 6. 0-8. 0的磷酸鹽緩沖液，用搗碎棒將草魚腎臟搗碎，使病毒釋放于該離心管液體中，制成檢測樣品。然后，將樣品滴在的加樣端吸水層1，5-10分鐘內(nèi)讀結(jié)果。陽性結(jié)果檢測層5上呈現(xiàn)兩條紅色的檢測線3和質(zhì)控線4，表示有草魚呼腸孤病毒感染；陰性結(jié)果檢測層5上呈現(xiàn)一條紅色質(zhì)控線4，表示無草魚呼腸孤病毒感染或其病毒含極低；檢測結(jié)果無效加樣10分鐘，檢測層5上質(zhì)控線4處無紅線出現(xiàn)，表示該試紙失效，檢測結(jié)果無效。(見圖2)本實施例的草魚呼腸孤病毒快速檢測試紙檢測的最低病毒量的測定如下結(jié)果見表2。表2最低病毒量的測定結(jié)果
權(quán)利要求1.草魚呼腸孤病毒快速檢測試紙，包括不干膠載體板(7)，其特征在于在該載體板的中間部設(shè)有由硝酸纖維膜制成的檢測層(5)，檢測層( 上設(shè)有包被有草魚呼腸孤病毒單抗D液的檢測線C3)及羊抗小鼠IgG的質(zhì)控線0)，與檢測層( 相延續(xù)的兩端分別設(shè)置有由吸水紙構(gòu)成的加樣端吸水層(1)和手持端吸水層(6)，在檢測層(5)的檢測線(3)的遠端與加樣端吸水層(1)交界處，設(shè)有載有金標(biāo)單抗C的玻璃纖維膜O)，該膜一端部分設(shè)置在加樣端吸水層(1)之下，其另一端部分設(shè)置在檢測層( 之上。
專利摘要一種草魚呼腸孤病毒快速檢測試紙，包括適當(dāng)尺寸的不干膠載體板(7)，其特征在于在該載體板的中間部設(shè)有由硝酸纖維膜制成的檢測層(5)，檢測層(5)上設(shè)有包被有草魚呼腸孤病毒單抗D液的檢測線(3)及羊抗小鼠IgG的質(zhì)控線(4)，與檢測層(5)相延續(xù)的兩端分別設(shè)置有由吸水紙構(gòu)成的加樣端吸水層(1)和手持端吸水層(6)，在檢測層(5)的檢測線(3)的遠端與加樣端吸水層(1)交界處，設(shè)有載有金標(biāo)單抗C的玻璃纖維膜(2)，該膜一端部分設(shè)置在加樣端吸水層(1)之下，其另一端部分設(shè)置在檢測層(5)之上。該試紙穩(wěn)定性好，具有簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏的特點。
文檔編號G01N33/558GK202002934SQ201120040068
公開日2011年10月5日 申請日期2011年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月12日
發(fā)明者王曉潔 申請人:魯東大學(xué)